Ringraziamo Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond e tutti i membri passati e presenti del laboratorio Berger per assistenza e consulenza. La piattaforma MultiBac e il suo sviluppo sono stati e sono generosamente sostenuto da enti finanziatori tra cui il Fondo nazionale svizzero (FNS), l&#39;Agence National de Recherche (ANR) e del Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) e la Commissione europea (CE) ai programmi quadro (PQ), 6 e 7. Il supporto per l&#39;accesso transnazionale è fornito dai progetti 7 ° PQ CE P-CUBE ( <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ) e BioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). Il Ministero della Scienza francese è particolarmente riconosciuto per sostenere la piattaforma MultiBac al EMBL attraverso l&#39;Investissement d&#39;Avenir progetto FRISBI.

1. Recombineering Tandem (TR) per la creazione di multigenica costrutti di espressione <ol><li> Pianificare la strategia di co-espressione. Approccio progettuale per l&#39;inserimento dei geni di interesse in donatori e accettori. Potenziali moduli fisiologici del vostro complesso dovrebbero essere raggruppati insieme su Aderenti ei donatori specifici. Utilizzare Modulo Moltiplicazione composto da endonucleasi Homing (HE) - coppie BstXI combinare cassette di espressione sul singolo donatore e plasmidi Acceptor 7,8 Crea tutti i costrutti rilevanti in silico e validare accuratamente la strategia prima di procedere al lavoro sperimentale.. Per esempio, geni di interesse dovrebbero essere controllati per non contenere HE o altri siti di restrizione e la presenza di corrette fasi di lettura aperta (ORF) dovrebbe essere convalidato. Considerare l&#39;ordinazione geni sintetici ottimizzati per insetti cella codon usage e struttura secondaria dell&#39;mRNA per migliorare i livelli di produzione di proteine ​​così come la rimozione di qualsiasi esisting HE siti dei geni di interesse. Provare a inserire i tag di depurazione sulla base dei dati della letteratura sulla N-o flessibili o esposti C-terminali delle vostre proteine ​​di scelta. Si consideri l&#39;applicazione di strategie poliproteici che mirano a produrre diverse subunità proteiche nel complesso se le quantità relative di singole proteine ​​devono essere controllati a causa di problemi di stechiometria del complesso. 4 Preparare dettagliato &quot;How-To&quot; del documento (si consiglia di prenotare laboratorio elettronico) contenente tutte le fasi proiettate sperimentali del progetto che porta al costrutto multigene completa (s). Creare file elettronici dei Cre-LoxP plasmidi fusi per esempio utilizzando il software di Cre-ACEMBLER che può essere scaricato dalla home page Berger gruppo ( <a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / CRE-acembler</a> ). </li><li> Inserisci i tuoi geni di interesse in donatori selezionati eAccettori utilizzando enzimi di restrizione e ligasi, o, in alternativa, mediante legatura metodi indipendenti seguenti protocolli pubblicati. 5,6,14 Se si ha accesso a una gestione dei liquidi stazione di lavoro e se si prevede un gran numero di costrutti da generare ( ad esempio, per gli approcci combinatori) considerare l&#39;utilizzo di script robotica sviluppate e attuate dal gruppo Berger (Figura 2). 14,15 Se una manipolazione dei liquidi stazione di lavoro non è disponibile, il funzionamento manuale utilizzando micropiastre permette l&#39;inserimento del gene in un HT come la moda. </li><li> I vincoli imposti dalla necessità di controllare la stechiometria delle subunità espresse potrebbero materializzarsi. Nel caso di stechiometricamente livelli di espressione squilibrate di singole subunità di un complesso proteico, è consigliabile applicare strategie poliproteici di coniugare diverse subunità del vostro complesso e una proteasi specifica (ad esempio tabacco etch virus NIA proteasi) in singoli grandi ORF distanziati di ssiti proteolitici specifici applicabili. 4,8 considerare co-esprimono uno o più poliproteine ​​con cassette di espressione singoli, se si dispone di un grande complesso con numerose subunità e ampiamente che vanno pesi molecolari delle singole unità. Considerare co-esprimono diversi geni che codificano per la stessa proteina in una poliproteina o come diversi cassette di espressione identici se tale proteina è caratterizzata da una bassa resa di produzione. 4,13 </li><li> Convalidare tutti i costrutti del donatore e l&#39;accettore clonati da mappatura di restrizione (a scelta in high-throughput) e sequenziamento. Procedere a fondere combinazioni donatore-accettore di Cre-loxP ricombinazione per generare i multigeniche espressione costrutti di scelta. Confermi purificata Acceptor-donatori plasmidi fusione di mappatura di restrizione, utilizzare sequenze elettroniche create da Cre-ACEMBLER o programmi simili come riferimento. </li><li> Conservare purificati e convalidato I donatori, accettori e fusioni donatore-accettore a -20 ° C o -80 ° C. Archivio plasmids e le loro sequenze (Microsoft Excel, Filemaker, altri) con cura per un utilizzo successivo. </li></ol> 2. Composito multigene Baculovirus Generation, Amplificazione e conservazione <ol><li> Integrare vettori di trasferimento multigeniche genoma baculoviral MultiBac trasformandosi in DH10 cellule che ospitano il genoma virale e le funzionalità necessarie per la TN7 trasposizione. Si noti che il genoma baculoviral MultiBac può essere precaricato con particolari geni di interesse (YFP marcatore, accompagnatori, ecc) nel proprio sito loxP (costruito nel genoma distale al sito di attacco TN7) da una reazione in vivo Cre precedente TN7 integrazione. Dopo 13 TN7 trasposizione, cellule con baculovirus composito contenente i geni di interesse sono selezionati mediante screening blu / bianco (successo TN7 risultati trasposizione in perdita di α-complementazione della β-galattosidasi, pertanto, colonie con TN7 corretta trasposizione rimangono bianco su una selettivapiatti gar contenenti X-gal) e il genoma è preparato da lisi alcalina e etanolo / isopropanolo precipitazioni. 5,6 </li><li> Trasfezione e produzione di virus iniziale. Posto 6 pozzetti coltura tissutale in cappa sterile. Dal log-fase SF21 coltura di cellule di insetto, seme fuori aliquote di cellule nei pozzetti e trasfezione con l&#39;aggiunta del genoma purificata baculoviral e un reagente di trasfezione mescolato in terreni di coltura, come descritto. 6 Harvest virus iniziale dopo 48-60 ore rimuovendo il materiale ( alta qualità, basso titolo virale V 0, tipicamente 3 ml per pozzetto). Supplemento mezzi freschi e di prova per la produzione di proteine ​​(e, se un marcatore YFP è presente, per fluorescenza) dopo altri 2-3 giorni. 6,7 </li><li> Amplificazione di virus, basso MOI regime. Utilizzare V 0 virus per infettare 25-50 ml di cellule in fase logaritmica (densità cellulare &lt;1x10 6 cellule per ml) in piccolo (100-250 ml) Erlenmeyer palloni shaker agitatosulla piattaforma agitatori orbitali (Figura 3). Contare le celle e dividere ogni hr 24 fino le cellule smettono di raddoppio (proliferazione arresto). Seguire un regime basso MOI (molteplicità di infezione cioè il numero di particelle virali per cellula): Le cellule devono raddoppiare (almeno) una volta (MOI &lt;1), altrimenti ripetere esperimento con un volume minore di V 0 aggiunti. Normalmente, 3 ml di 0 V sono usati per infettare 25 ml di cellule di insetti Sf21 ad una densità di 0.5x10 6 cellule / ml. Ciò è essenziale per evitare dannose sovra-amplificazione e cancellazione automatica di virus che può causare la perdita di geni eterologhi di interesse. Harvest V 1 virus (25-50 ml) dopo 48-60 ore dal pellet cellule e rimuovendo i supporti contenenti il virus. Integrare con mezzi freschi e test di YFP e la produzione di proteine, eliminando 6 celle 1x10 ogni 12 o 24 ore, pellet e convalidare la produzione di proteine ​​e di segnale proteina marker (YFP). 6, Amplifica virus (perV 2) ulteriormente se volumi di espressione più grandi sono finalizzate a infettando fino a 400 cellule in 2 ml L shaker beute con V 1 virus rispettando il basso sopra MOI regime (cellule devono raddoppiare almeno una volta dopo l&#39;infezione con V 1). Rigorosamente testare la produzione di proteine ​​e di segnale proteina marker durante l&#39;amplificazione per evitare l&#39;accumulo di virus difettosi contenenti non più i tuoi geni di interesse. 5-7 Utilizzo pellet cellulari si accumulano ad ogni amplificazioni passo già per stabilire protocolli di purificazione per il complesso proteina espressa di interesse. </li><li> Stoccaggio BIIC produzione del virus. Si consiglia vivamente di memorizzare virus V 2 come il virus di produzione utilizzando il BIIC (B aculovirus-i nfected i nsect c ell) metodo, per evitare modifiche (ad esempio la perdita del gene di interesse) del virus ricombinante e per preservare l&#39;alta espressione livellos 16 pellet cellule infette è osservata 24 ore dopo l&#39;arresto della proliferazione -. di questo stadio le cellule contengono particelle virali complete poco prima che sarebbero stati rilasciati (per gemmazione) nei mezzi di comunicazione. Rimuovere i supporti e le aliquote congelamento del pellet di cellule in azoto liquido e conservare a tempo indeterminato. 7,16 </li></ol> 3. Produzione di proteine ​​e trattamento a valle <ol><li> Infettare grandi culture (R) e di monitoraggio YFP. Utilizzare V 1, V 2 o congelati aliquote BIIC di infettare colture cellulari più grandi per i cicli di produzione (in genere 400 ml a 2 l fiaschi). Aderire a basso regime di MOI (regolare il volume virus utilizzato per l&#39;infezione in modo che la cultura infetto raddoppia almeno una volta). Ingrandire volumi di coltura infetti, se necessario in base al numero di flaconi moltiplicando. Se YFP proteina marker è presente, recedere in definiti intervalli di 1x10 6 celle, pellet e lisare le cellule e monitorare l&#39;evoluzione del segnale YFP fino a un plateau viene raggiunto indicating massima produzione di proteina ricombinante. YFP livelli possono essere misurati in un pozzo lettore di piastra di serie 96 in grado di registrare segnali di fluorescenza (ad esempio Tecan SPECTRAFluor). Celle di raccolta in questa fase. Pellet cellulari conservare a -20 ° C (breve termine) o -80 ° C (a lungo termine). </li><li> La lisi cellulare e frazionamento. Lyse cellule dal vostro metodo preferito di scelta, su misura per le esigenze della vostra proteina (gelo-disgelo, sonicazione, stampa francese, altri). 5-7 citosol frazionare e di nuclei e di test per la presenza dei vostri proteine ​​di interesse. Sviluppare protocolli di purificazione basati sui risultati di semplificare la purificazione di proteine. Si consideri l&#39;applicazione di procedure di immersione totale per estrarre la vostra proteina dalla frazione nucleare in condizioni di alto KCl se le proteine ​​risiedono nel nucleo. 7,18 </li><li> Purificazione della proteina (micro-scala, su larga scala). Si noti che spesso piccoli volumi (10 o 25 ml) di coltura cellulare sono susere sufficienti per ottenere pellet cellulari per la purificazione di notevoli quantità di vostre proteine ​​di interesse a causa dei tipicamente elevati o molto elevati livelli di produzione di proteine ​​eterologhe nei sistemi cellulari baculovirus / insetto (spesso 10-100 mg di proteine ​​per L cultura e altro ancora). In concomitanza con micro-depurazione (piastre a pozzetti multipli, metodi MicroTip, sistema di GE Healthcare ÄKTAmicro, altri) è possibile ottenere dati biochimici e di attività e spesso anche quantità sufficiente di proteine ​​desiderate e complessi per nanolitri scala cristallizzazione high-throughput (HTX ). Considerare l&#39;utilizzo di metallo purificazione di affinità (Clonetech Takara TALON, Qiagen Ninta resine chelante metallo) e un oligo-istidina (6-10 residui) tag su subunità esposte della vostra proteina complessi per facilitare la purificazione, in collaborazione con scambio ionico e cromatografia ad esclusione dimensionale in piccolo volumi usando per esempio la ÄKTAmicro o una simile piccola macchina di purificazione del volume (Figura 4 </strong&gt;). Altri passaggi di purificazione di affinità e di scambio ionico (IEX) passi oltre alla purificazione di affinità con i tag oligo-istidina o altri tag (scegliere tra GST, MBP, CBP, altri) possono e devono essere considerati, in base alle proprietà biochimiche delle proteine di interesse e le preferenze individuali. Considerare codifica più di una subunità di etichetta di affinità per migliorare l&#39;efficienza di purificazione. Concentrate i vostri complessi proteici purificati e stabilire protocolli di storage, quali il congelamento con o senza glicerina. Sviluppare criteri di controllo di qualità che possono essere applicati in standard (saggi di attività, test biochimici e biofisici) per valutare variazioni da lotto a lotto dei vostri proteine ​​purificate. </li></ol>

<ol>
	<li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+Grip+on+Complexes.">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li><li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+sociology+of+the+cell.">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes.">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li><li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors.">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li><li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production.">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).</li><li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production.">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li><li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robots,+pipelines,+polyproteins:+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells.">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li><li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors.">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li><li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome.">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+core,+two+shells:+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes.">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism.">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li><li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li><li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex.">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li><li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

IB è inventore di brevetti e domande di brevetto che dettagliano le parti della tecnologia qui descritta.

Video istantanee delle figure 2 e 3 illustrano l&#39;intero processo di generazione robot-assistita da cDNA di espressione multigene costruisce fino alla infezione di colture cellulari di insetto per la produzione di proteine. Nuovi reagenti (plasmidi e virus) e protocolli robusti sono stati sviluppati per consentire una pipeline basandosi su SOP. L&#39;intera filiera è stato implementato come una piattaforma tecnologica al EMBL di Grenoble. La piattaforma MultiBac è stata letta da mo...

Attività biologica è controllata da gruppi di proteine ​​e altre biomolecole che agiscono di concerto per catalizzare le funzioni cellulari. Tipici esempi sono i macchinari che trascrive l&#39;informazione ereditaria contenuta nel DNA in RNA messaggero. Negli esseri umani, più di 100 proteine ​​si uniscono in un processo definito e disciplinato a trascrivere i geni, formando grandi complessi multiproteici con 10 e più subunità tra RNA polimerasi II e dei fattori di trascrizione generali come TFIID, TFIIH e altri. 9 Altri esempi sono il ribosoma, composto di molte proteine ​​e molecole di RNA, che catalizza la sintesi proteica, o il complesso nucleare del poro che è responsabile della spola biomolecole attraverso la membrana nucleare negli eucarioti. Una dissezione dettagliata architettonico e biochimici di sostanza, tutte le macchine multicomponente nella cella è fondamentale per capire la loro funzione. La delucidazione struttura dei procarioti e eukarribosomi yotic, per esempio, costituivano eventi caratteristici che producono visione senza precedenti di come queste macchine macromolecolari svolgere le loro funzioni indicate nella cella. 10,11 Ribosomi possono essere ottenuti in qualità e quantità sufficiente per studio dettagliato purificando il materiale endogeno da cellule in coltura, dovuta al fatto che fino al 30% della massa cellulare consiste di ribosomi. RNA polimerasi II è già meno abbondante di ordini di grandezza, e molte migliaia di litri di coltura di lievito dovevano essere elaborati per ottenere una dettagliata vista atomico di questo complesso essenziale centrale per la trascrizione. 12 La stragrande maggioranza degli altri complessi essenziali sono comunque presenti in molto più bassi importi in cellule native, e quindi non possono essere adeguatamente purificati da materiale di origine nativa. Per rendere tali complessi accessibili per l&#39;analisi strutturale e funzionale dettagliata richiede produzione eterologa mediante te ricombinantechniques. Produzione di proteina ricombinante ha avuto un grande impatto sulla ricerca di scienze biologiche. Molte proteine ​​sono state prodotte ricombinante, e la loro struttura e funzione sezionati ad alta risoluzione. Programmi di genomica strutturale hanno approfittato della delucidazione dei genomi di molti organismi per affrontare il gene prodotto repertorio di interi organismi in modalità high-throughput (HT). Migliaia di strutture proteiche sono state così determinato. Ad oggi, il sistema più prolifico utilizzato per la produzione di proteina ricombinante è stata E. coli, e molti sistemi di espressione sono stati sviluppati e perfezionati nel corso degli anni per la produzione di eterologa in questo host. I plasmidi che ospitano un gran numero di funzionalità per consentire la produzione di proteine ​​in E. coli riempiono interi cataloghi di fornitori commerciali. Tuttavia, E. coli ha alcune limitazioni che rendono non adatti per produrre molte proteine ​​eucariotiche e in pcomplessi proteici articolari con molte subunità. Pertanto, la produzione di proteine ​​in ospiti eucariotici è diventata sempre il metodo di scelta negli ultimi anni. Un sistema particolarmente idoneo per produrre proteine ​​eucariotiche è il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) che si basa su un baculovirus ricombinante che trasportano i geni eterologhi per infettare colture di cellule di insetto coltivate in laboratorio. Il sistema è un MultiBac BEVS recentemente sviluppate, particolarmente su misura per la produzione di complessi proteici eucariotiche con molte subunità (Figura 1). MultiBac è stato introdotto nel 2004. 13 Dalla sua introduzione, MultiBac è stato continuamente perfezionato e snella per semplificare la gestione, migliorare la qualità delle proteine ​​bersaglio e in generale rendere il sistema accessibile agli utenti non specialisti per la progettazione di procedure operative standard (SOP efficienti). 4 MultiBac è stato implementato in molti laboratori in tutto il mondo, in academia e industria. Alla EMBL di Grenoble, programmi di accesso transnazionali sono state messe in atto dalla Commissione europea per fornire formazione di esperti presso la piattaforma MultiBac per gli scienziati che hanno voluto utilizzare questo sistema di produzione per far progredire la loro ricerca. La struttura e la funzione di molti complessi proteici che erano fino a quel momento non accessibile è stato spiegato, utilizzando campioni prodotti con MultiBac. 4 Nel seguito, le fasi essenziali della produzione MultiBac sono riassunti in protocolli come sono in funzione presso l&#39;impianto MultiBac presso l&#39;EMBL di Grenoble.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

Ricerca proteomica ha rivelato l&#39;impressionante complessità del proteoma eucariotiche in dettaglio senza precedenti. Ora è un concetto comunemente accettato che le proteine ​​nelle cellule esistono per lo più non come entità isolate, ma esercitano la loro attività biologica in collaborazione con molte altre proteine, nell&#39;uomo dieci o più, formando catene di montaggio della cella per la maggior parte se non tutte le funzioni vitali. 1 , 2 Conoscenza della funzione e l&#39;architettura di queste assemblee multiproteici richiede la loro disposizione in una qualità superiore e la quantità sufficiente per l&#39;analisi dettagliata. La scarsità di molti complessi proteina nelle cellule, in particolare negli eucarioti, vieta loro estrazione da fonti native, e richiede la produzione ricombinante. Il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) ha dimostrato di essere particolarmente utile per produrre proteine ​​eucariotiche, la cui attività si basa spesso su elaborazione post-traduzionale che altri sistemi di espressione comunemente usati spesso puònon supportano. 3 BEVS utilizzare un baculovirus ricombinante in cui è stato inserito il gene di interesse per infettare colture cellulari di insetto che a loro volta producono la proteina di scelta. MultiBac è un BEVS che è stato particolarmente su misura per la produzione di complessi di proteine ​​eucariotiche che contengono molte subunità. 4 Un prerequisito fondamentale per una produzione efficiente di proteine ​​e loro complessi sono protocolli affidabili per tutte le fasi coinvolte in un esperimento di espressione che idealmente può essere implementato come procedure operative standard (SOP) e seguito anche da utenti non specializzati con relativa facilità. La piattaforma MultiBac al Laboratorio europeo di biologia molecolare (EMBL) utilizza POS per tutti i passaggi necessari per un multiprotein esperimento un&#39;espressione complessa, a partire dalle inserimento dei geni in un genoma baculoviral ingegnerizzato ottimizzato per la produzione di proteine ​​eterologhe proprietà di analisi su scala ridotta della proteina esemplari prodotti. 5-8 La piattaforma diè installato in una modalità di accesso aperto presso l&#39;EMBL di Grenoble e ha supportato molti scienziati del mondo accademico e industria per accelerare i progetti di ricerca complessi proteici.

Forte co-espressione di proteine ​​eterologhe raggiunti dal sistema MultiBac è mostrato in Figura 1d (sonde prelevati 48 ore dopo infettare una coltura cellulare di sospensione). Le bande proteiche sono overexpressed chiaramente distinguibile nell&#39;estratto cellula intera (SNP) e il lisato eliminato (SN). La qualità e la quantità del materiale di proteina prodotta è spesso sufficiente a consentire la determinazione della struttura di complessi proteici, come il punto di arresto mitotico compl...

Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine ​​eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.8K Views.  EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322. Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine ​​eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilit?...

Video: The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissezione lordo dello Stomaco del Gambero, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Ricerca

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All&#39;interno della Atlas proteina umana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

La logica, passaggi sperimentali, e le potenzialità di eterologa Biosintesi prodotto naturale Con l&#39;antibiotico Eritromicina Complesso A prodotti attraverso<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...