Gli autori desiderano ringraziare il Sig. Sven Holder e il signor Stephen Conley per la loro preziosa assistenza in questo studio. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal National Institute of Heath [numero di Grant R00CA134920] e l&#39;American Lung Association [numero di Grant RG-194681-N]. NinePoint Medical Inc. sponsorizzato le spese di pubblicazione associati a questo manoscritto.

1. Sistema di imaging I dettagli tecnici di OFDI sono stati descritti in precedenza 4-6. Circonferenziale OFDI è stata condotta a velocità di esposizione tra 25 e 100 fotogrammi al secondo e tra 512 e 2.048 profili di profondità assiali per circolare in sezione trasversale immagine. Personalizzato 2,4 Fr (0,8 mm di diametro) cateteri scansione elicoidale utilizzati in questo studio sono stati progettati per funzionare attraverso la porta di accesso broncoscopi standard. I cateteri consisteva in un nucleo interno ottico per focalizzare la luce sulla parete bronchiale e una monouso guaina esterna. Il corpo del catetere è rimasta ferma durante l&#39;imaging mentre il nucleo interno è stato fatto ruotare a una velocità compresa tra 25 e 100 Hz e tradotti in un pullback velocità di tra 1,25 e 5 mm / sec. La risoluzione assiale del sistema era di 6 mm in tessuto e fornito una profondità di immagine varia di 7,3 mm 4-6. Catetere a base di OFDI è stata effettuata in questo studio per replicare in vivo broncoscopica OFDI (Figura 1). Tuttavia, questo protocollo può essere applicato anche ad imaging con un banco sistema ottico (Figure 3 e 4). 2. Imaging System Set-up <ol><li> Accendere il sistema di imaging </li><li> Impostare e registrare i parametri di imaging (velocità di rotazione, velocità di pullback, velocità di acquisizione immagini, ecc.) Per il sistema di imaging OFDI utilizzato in questo studio, le immagini sono state ottenute a 10-50 fps. </li><li> Fissare catetere a rotatoria e dispositivo pullback. </li><li> Spin catetere e verificare la qualità delle immagini. Regolare l&#39;allineamento del sistema e l&#39;offset, se necessario. </li></ol> 3. Preparazione di tessuto <ol><li> Posizionare un tampone assorbente usa e getta da tavolo sul piano del banco e del polmone modello riportato sul pad. </li><li> Se l&#39;immagine di un campione chirurgico ex vivo da un paziente, assicurarsi di consultare il dipartimento di patologia per garantire che tutti i margini di resezione (margini bronchiali, vascolari e parenchimali) sono stati valutati, documentati, e / o rimosso da un patologist. </li><li> Identificare le vie aeree bronchiali entrare il campione resezione all&#39;ilo. Rimuovere l&#39;eventuale muco visibile all&#39;interno delle vie aeree con una siringa foro. Se necessario, utilizzare un segmento più lungo di tubo di plastica per la siringa foro di aspirazione più profonda all&#39;interno delle vie aeree. </li><li> Palpare la superficie esterna del campione per identificare la lesione di interesse. </li><li> Utilizzando una sonda di metallo sottile, cautamente navigare attraverso l&#39;albero bronchiale fino nei pressi della lesione di interesse. </li><li> Aprire le vie aeree lungo la sonda finché la lesione di interesse è visibile o palpabile sotto la mucosa delle vie aeree. </li><li> Rimuovere con attenzione la presenza di sangue o muco dalla mucosa delle vie aeree sovrastante la lesione con una punta di cotone applicatore. </li><li> Posizionare il catetere OFDI sopra la mucosa delle vie aeree e ottenere un&#39;immagine di confermare la lesione è alla base della mucosa delle vie aeree e di identificare una regione di alta qualità di immagini di interesse per la correlazione istologia. </li></ol> 4. Tissue Marking <ol> &lt;li&gt; Seleziona la regione di interesse nelle vie aeree sulla base di dati di imaging precedenti Fase 3.8. </li><li> Scegliere due punti sul tessuto lungo la linea desiderata di imaging. Punti può essere parallelo sia al longitudinale (figura 2) o circonferenziale (figura 3) aspetto delle vie aeree, a seconda dei risultati desiderati. Puntini spazio non più di 1,5 cm di distanza in modo che la porzione di tessuto può rientrare in un blocco di elaborazione per istologia. Se una lunghezza tessuto di&gt; 1,5 cm è necessario, quindi dividere la lunghezza del tessuto in più 1,5 cm di lunghezza inchiostrate regioni di interesse per creare più immagini abbinate: coppie istologia. </li><li> Immergere un sottile ago con punta aperta alesaggio (cioè 25 calibro 7/8 &quot;di lunghezza) nel tessuto marcatura colorante (Triangolo Scienze Biomediche, Durham, NC). </li><li> Pulire accuratamente l&#39;inchiostro in eccesso all&#39;esterno dell&#39;ago con una garza, lasciando inchiostro tessuto marcatura solo all&#39;interno del foro dell&#39;ago. </li><li> Forare il tessuto perpendicolare alla mucosa delle vie aeree inprescelto punto lungo la linea di imaging. </li><li> Ripetere i passaggi 3,3-3,5 per il secondo punto sulla mucosa delle vie aeree. </li><li> Se l&#39;inchiostro scorre sopra la superficie della mucosa lontano dal sito di puntura, utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere accuratamente l&#39;inchiostro in eccesso. </li><li> Rimuovere muco o sangue sulla superficie della mucosa delle vie aeree con un applicatore con punta di cotone, se presente. </li><li> Se i punti di inchiostro sono disposti circonferenzialmente all&#39;interno di una via aerea, è utile al piedino aperto i due lati della vie aeree per appiattire il tessuto nel campo dell&#39;imaging (Figura 3a). </li></ol> 5. Tissue Imaging <ol><li> Posizionare il catetere OFDI su ogni segno di inchiostro e dell&#39;immagine per garantire i segni sono visibili su OFDI. Marchi dovrebbero apparire come interruzioni focali all&#39;interno della struttura del tessuto con sovrastante particelle altamente diffondenti e sottostante rapida attenuazione del segnale, che corrisponde alle particelle di inchiostro all&#39;interno del sito di puntura (Figura 3b, 4a, figura 4g </strong&gt;). </li><li> Se l&#39;inchiostro segno (s) non sono visibili su OFDI, ripetere i passaggi 4,3-4,7 per i non visibili segni. Se i segni di inchiostro sono visibili con OFDI, passare al punto 5.3. </li><li> Posizionare il catetere parallelo ai due segni di inchiostro sulla superficie mucosa delle vie aeree in modo tale che le ottiche catetere sovrastare il tessuto oltre il segno primo inchiostro (Figura 2b). Ancorare l&#39;estremità prossimale del catetere con un oggetto leggero e fissare l&#39;estremità distale può aiutare a ridurre gli artefatti di movimento. </li><li> Procedere con la raccolta di un pullback OFDI. </li><li> Guarda le immagini pullback OFDI per garantire entrambi segni di inchiostro sono visibili nelle immagini e per verificare la presenza di artefatti da movimento (Figura 3 e Figura 4). Se i marchi non sono visibili, ripetere i passaggi da 5,1-5,4. </li></ol> 6. La raccolta e la lavorazione dei tessuti <ol><li> Inserire un inchiostro verde dot (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) sul tessuto della mucosa delle vie aeree per orientare l&#39;inizio della scansione di imaging, 0,3 cm dal the mark inchiostro che apparve prima nel pullback imaging (figura 2c). </li><li> Rimuovere il tessuto che comprende i due marchi d&#39;inchiostro nero e marchio inchiostro verde. Tagliare il tessuto per adattarsi in una cassetta standard di elaborazione istologia. Se il taglio del tessuto fresco è difficile, quindi il tessuto può essere fissato prima di rimuovere il tessuto per l&#39;esame istologico. </li><li> Tessuto posto in una cassetta di trasformazione istologia e fissare in formalina al 10% per almeno 48 ore. </li><li> Tessuto di processo in un processore tessuto, disponibile tramite qualsiasi reparto istologia. </li><li> Embed tessuto in paraffina tale che le sezioni di taglio saranno parallele ai due segni di inchiostro nero sulla superficie delle vie aeree. </li><li> Utilizzare un tessuto microtomo per affrontare il blocco di paraffina fino a quando un marchio di inchiostro è visibile o l&#39;intera sezione di tessuto è visibile, quello che viene prima. </li><li> Una volta che entrambi i segni di inchiostro nero sono visibili, tagliare una sezione 5 micron di spessore e montare su un vetrino. </li><li> Continuare a tagliare e montare 5 sezioni micron di spessore ogni50 pm fino a quando i segni d&#39;inchiostro nero non sono più visibili o le estremità del tessuto, quello che viene prima. </li><li> Seguire le norme standard ematossilina ed eosina (H &amp; E) colorazione protocolli per macchiare e diapositive coprioggetto. </li></ol> 7. Elaborazione delle immagini Se le immagini sono state acquisite con uno scanner da banco, o altra tecnica di scansione dove entrambi erano visibili segni di inchiostro in una singola sezione trasversale immagine, l&#39;immagine può essere direttamente correlata con istologia corrispondente. Se set di dati volumetrici sono state acquisite con un catetere di scansione elicoidale, le immagini dovranno essere ri-interpolati in modo che una singola immagine 2D intersechi entrambi i segni di inchiostro per la correlazione con istologia. Questo può essere realizzato utilizzando ImageJ o altri software di elaborazione delle immagini. In alcuni casi, l&#39;inchiostro non può essere facilmente visibili nel qual caso sezioni adiacenti / diapositive devono essere esaminati.

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La valutazione delle neoplasie polmonari precoci può essere estremamente difficile a causa della mancanza di sintomi e l&#39;incapacità di visualizzare primi alterazioni neoplastiche radiologicamente o broncoscopicamente. OFDI fornisce vicino risoluzione istologico, ampio 3-dimensionale vista microstruttura del tessuto in tempo reale 2-6. Endobronchiale OFDI è stata dimostrata in pazienti come una tecnica sicura che può essere utilizzato per ottenere dati volumetriche ad alta risoluzione su segmenti vie lunghe vie aeree polmonare 11-13 (animazione). Tuttavia, solo piccole biopsie sono ottenuti come controparti istopatologici in in ambiente vivo, che non forniscono adeguate per OFDI correlati per lo sviluppo di criteri di imaging per patologia polmonare. Al fine di valutare con precisione caratteristiche OFDI viste in imaging polmonare, è essenziale ottenere un&#39;immagine esattamente corrispondenti al correlazioni istologia. Presentiamo un metodo semplice ed efficace per la precisione, una a Ocorrelazione tra OFDI ne e istologia applicata alle vie aeree immagini di ex campioni di resezione polmonare in vivo, che è applicabile a quasi tutti i tipi ex tessuto vivo. Una volta criteri di imaging sono stati stabiliti ex vivo con abbinato uno-a-uno istologia, questi criteri possono essere applicati a immagini in vivo. Il colorante tessuto utilizzato per marcare la regione di imaging di interesse è chiaramente visibile sia OFDI e istologia. Utilizzando tecniche semplici per orientare il tessuto, segni di inchiostro può essere correlata sia imaging e istologia consentire 1-1 confronti OFDI caratteristiche ei risultati istologici per determinare le caratteristiche di imaging identificabili della patologia dei tessuti. La tecnica è poco costoso e pratico, rendendo così utile in molte applicazioni di imaging ottico. In ambiente in vivo, metodi come marcatura laser può essere utilizzato per l&#39;orientamento del tessuto 25. Tuttavia, tegli piccola dimensione della biopsia bronchiale è ancora un fattore limitante nell&#39;utilizzo studi in vivo per sviluppare criteri specifici di imaging per patologia polmonare. Sebbene studi ex vivo servire come alternativa adeguata per imaging in vivo, ci sono alcune limitazioni. Ex campioni polmonari in vivo sono uninflated e spesso mostrano atelettasia chirurgicamente indotta, che altera l&#39;aspetto di normali strutture alveolari. Gonfiaggio tessuto polmonare asportato chirurgicamente con il tessuto di marcatura per la correlazione istologia è tecnicamente impegnativo come la maggior parte dei campioni polmonari chirurgici vengono ricevuti dopo patologia valutazione al congelatore nel corso del quale la superficie pleurica si interrompe, interferendo con l&#39;inflazione campione. Non patologico atelettasia non è un artefatto visto nella regolazione in vivo, quindi questa limitazione non sarebbe opportuno in vivo imaging polmonare. Inoltre, la mancanza di sangue all&#39;interno dei vasi in campioni ex vivo potrebbe rendere difficile distinguish strutture vascolari da altre strutture vuoti di segnale. In in ambiente vivo, l&#39;aggiunta di Doppler OCT / OFDI 26-28 a strutturale OCT / OFDI sarebbe facilitare l&#39;identificazione delle navi. Artefatti di movimento può essere visto in vivo in cui non sono presenti ex vivo. Questo potrebbe essere potenzialmente problematico in standard sistemi ottobre con velocità di acquisizione più lenti. Tuttavia, il frame rate rapidi sistemi OFDI sono attualmente&gt; 200 fps 29-31. Pertanto, non si prevede che artefatti da movimento sarà un problema significativo. Precedente in vivo OCT e OFDI studi di imaging hanno dimostrato con successo la visualizzazione di funzioni di imaging sottili 14,15,18,19. In questo studio abbiamo dimostrato volumetrico OFDI con precisa correlazione ai tessuti a base di diagnosi per la valutazione patologia polmonare. La procedura descritta è destinato a fornire istologia perfettamente abbinati ad essere usato come oro Standard per l&#39;interpretazione dell&#39;immagine OFDI. Criteri di imaging volta specifici per patologia polmonare sono stati sviluppati e validati ex vivo con abbinato uno-a-uno istologia, i criteri possono essere applicati ai successivi studi di imaging in vivo con l&#39;uso di una biopsia bronchiale come valutazione gold standard dell&#39;imaging caratteristiche visto. Questa tecnica è presentata come una richiesta di campioni di resezione polmonare, ma può essere applicato a qualsiasi tipo di tessuto per fornire la precisa immagine di correlazione istologia necessaria per determinare caratteristiche di imaging sottili di tessuti normali e patologici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Tissue colorante marcatura </td><td> Triangolo biomedica </td><td> TMD-BK, TMD-G </td><td></td></tr></tbody></table>

optical frequency domain imaging of ex vivo pulmonary resection specimens: obtaining one to one image to histopathology correlation

Il cancro del polmone è la principale causa di decessi per cancro 1. A cellule squamose e tumori a piccole cellule si presentano in genere in associazione con vie aeree di conduzione, mentre adenocarcinomi sono in genere più in posizione periferica. Tumore maligno del polmone individuazione nelle prime fasi del processo di malattia può essere difficile a causa di diversi limiti: risoluzione radiologica, limitazioni broncoscopici nella valutazione dei tessuti sottostanti la mucosa delle vie aeree e l&#39;individuazione precoci alterazioni patologiche, e campioni di piccole dimensioni e / o campionamento incompleto nelle biopsie istologiche. Modalità di imaging ad alta risoluzione, come ottica dominio della frequenza immagine (OFDI), forniscono non distruttivo, grande zona 3-dimensionale vista microstruttura del tessuto fino a profondità che si avvicinano 2 mm in tempo reale (Figura 1) 2-6. OFDI è stato utilizzato in una varietà di applicazioni, compresa la valutazione di aterosclerosi coronarica e 6,7 esofageo metaplasia intestinale e displasia <sup&gt; 6,8-10. Broncoscopico OCT / OFDI è stata dimostrata come una cassaforte in strumento di imaging in vivo per valutare le vie aeree polmonare 11-23 (animazione). Ottobre è stato valutato nelle vie aeree e nel parenchima polmonare 16,23 17,22 di modelli animali in vivo e umano delle vie aeree 14,15. Ottobre l&#39;imaging delle vie aeree normali ha dimostrato la visualizzazione delle vie aeree stratificazione e attacchi alveolari, e la valutazione delle lesioni displastiche è stato trovato utile per distinguere i gradi di displasia nella mucosa bronchiale 11,12,20,21. OFDI imaging di mucosa bronchiale è stata dimostrata in un breve segmento bronchiale (0,8 cm) 18. Inoltre, volumetrico OFDI estende generazioni delle vie aeree più nei suini e umani vie aeree polmonare in vivo è stato descritto 19. Endobronchiale OCT / OFDI viene in genere eseguita con sottili cateteri flessibili, compatibili con standard di broncoscopiaporte di accesso Copic. Inoltre, ottobre e OFDI aghi basati sonde sono state recentemente sviluppate, che può essere utilizzato per regioni di immagine del polmone oltre la parete bronchiale o superficie pleurica 17. Mentre OCT / OFDI è stata utilizzata e dimostrata come fattibile per imaging in vivo polmonare, studi con perfettamente abbinati uno-a-uno OFDI: istologia sono stati effettuati. Pertanto, i criteri di imaging specifici per varie patologie polmonari devono ancora essere sviluppati. Omologhi istopatologici ottenuti in vivo consistono solo piccoli frammenti bioptici, che sono difficili da correlare con dataset OFDI grandi. Inoltre, essi non forniscono l&#39;istologia globale necessaria per la registrazione con OFDI grande volume. Come risultato, funzioni di imaging specifiche di patologia polmonare non può essere sviluppata in ambiente in vivo. Proprio abbinati, uno-a-uno OFDI e correlazione istologia è fondamentale per valutare con precisione le caratteristiche viste in OIED contro istologia come gold standard, al fine di ricavare specifici criteri di interpretazione di immagine per neoplasie polmonari e altre patologie polmonari. Una volta specifici criteri di imaging sono stati sviluppati e validati ex vivo con abbinato uno-a-uno istologia, i criteri possono essere utilizzati anche per studi di imaging in vivo. Qui vi presentiamo un metodo per preciso, 1-1 correlazione tra imaging ad alta risoluzione ottica e istologia nei campioni di resezione polmonare ex vivo. In questo manoscritto, si descrivono le tecniche utilizzate per abbinare le immagini OFDI all&#39;istologia. Tuttavia, questo metodo non è specifico per OFDI e può essere utilizzato per ottenere istologia-registrate immagini per qualsiasi tecnica di imaging ottico. Abbiamo eseguito delle vie aeree centrato OFDI con un costume specializzato costruito broncoscopica 2,4 Francese (0,8 mm di diametro) del catetere. I campioni di tessuto sono stati segnati con la tintura dei tessuti, visibile sia OFDI e istologia. Procedure di orientamento attente sono stati usati per correlare con precisione imaging e luoghi di campionamento istologici. Le tecniche descritte in questo manoscritto sono stati utilizzati per condurre la prima dimostrazione di volumetrico OFDI con precisa correlazione ai tessuti a base di diagnosi per valutare la patologia polmonare 24. Questo semplice, tecnica efficace può essere estesa ad altri tipi di tessuti per fornire una precisa immagine di correlazione istologia necessaria per determinare le caratteristiche di imaging sottili di tessuti sia normali che patologici.

I segni di inchiostro nero deve essere compreso tra 1-1,5 cm per indicare la regione di imaging di interesse. Il marchio inchiostro verde deve essere posto all&#39;inizio della scansione imaging, prima del primo contrassegno inchiostro nero orientare il campione (Figura 2 e Figura 3a). Segni di inchiostro dei tessuti deve essere visibile sia su immagini OFDI e istologia (Figura 3 e 4). In suina normali (figura 3) e delle vie aeree umana (Figura 4), ​​tipica stratificazione delle vie aeree deve essere visibile. L&#39;epitelio (E) è visibile come un sottile segnale moderatamente denso strato omogeneo all&#39;aspetto luminale delle vie aeree. Lamina propria consiste organizzata segnale intenso segnale povero tessuto, corrispondenti a vari componenti della lamina propria (LP) come segnale di tessuti connettivi intensi tra elastina e collagene (EL), e il segnale povero salivare tipo tessuto ghiandolare (G ). Ci sono canali di segnale a volte visibili poveri (D) che attraversano il sistema respiratorioepitelio respiratorio per collegare con il lume bronchiale. Muscolo liscio appare come discontinui, intercalati fascicoli muscolari lisce e quindi non è identificabile in OFDI. In H &amp; E e macchie tricromica, stratificazione delle vie aeree può essere visualizzata (Figura 3c, 3d, 3f, 3g, 4b, 4c, 4e e 4f), dove il tricromica i superficiali tessuti densi elastiche e collagene appaiono blu profondo e il muscolo sottostante liscia macchie rosse (SM). Anelli di cartilagine (C) vengono visualizzati come scarsa ricezione del segnale a forma di mezzaluna strutture con confini ben definiti, che si sovrappongono nelle vie aeree suina e non si sovrappongono nelle vie respiratorie dell&#39;uomo. Pericondrio circonda gli anelli cartilagine appare come un sottile strato di tessuto intenso segnale comprende i poveri anelli di cartilagine di segnale. Nel periferico umano vie aeree (Figura 4g e 4h), attacchi alveolari (A) sono visibili come sottili, intenso segnale reticolare pareti alveolari con spazi vuoti segnale alveolari. Spazi vascolari all&#39;interno della lamina propria sono visible come strutture vuoti di segnale lineare o circolare con lieve artefatto ombre sottostante (frecce). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig1.jpg" /> Figura 1. OFDI di suini delle vie aeree. Nelle immagini in vivo ottenuti da una delle vie aeree suina sotto ventilazione meccanica. (A) ODFI sezione prossimale delle vie aeree. (B) OFDI sezione distale delle vie aeree. (C) ODFI sezione longitudinale delle vie aeree prossimali, immagine ingrandimento maggiore di e pannello in rosso regione evidenziata. (D) OFDI sezione longitudinale delle vie aeree distali, immagine ingrandimento maggiore di e pannello in verde regione evidenziata. (E) ODFI sezione longitudinale delle vie aeree da prossimale a distale (sinistra a destra). Diametro del catetere è di 0,8 mm e segni di graduazione rappresentano incrementi di 0,5 mm. Sebbene diversi strati della parete bronchiale e attacchi alveolari sono discernibili nelle immagini OFDI, è difficile interpretare esattamente il co anatomicarrelate dei segnali OFDI senza istologia direttamente registrato. e: epitelio, lp: lamina propria, sm: sottomucosa, c: cartilagine, a: attacchi alveolari. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig2.jpg" /> Figura 2. Tessuto marcatura di suini vie aeree. (A) aperto vie aeree con due segni di inchiostro nero sulla superficie luminale posizionata parallelamente l&#39;aspetto longitudinale delle vie aeree, 1,5 cm di distanza. (B) catetere OFDI posto su due inchiostro nero segna per includere due marchi all&#39;interno del pullback OFDI. (C) Airway con ulteriore marchio inchiostro verde per orientare l&#39;inizio della scansione di immagini sul provino. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3.jpg" /> Figura 3. OFDI ed istologia della specie suina delle vie aeree dimostrare cor precisorelazione utilizzando tessuto marcatura. (a) aperto vie aeree con due segni di inchiostro nero sulla superficie luminale posizionata parallelamente l&#39;aspetto circonferenziale delle vie aeree. Perni vengono utilizzati per aprire ulteriormente le vie aeree (frecce). (B) delle vie aeree OFDI suina sia con inchiostro segna visibile (asterischi) con (c) tinto istologia precisamente correlata con H &amp; E (asterischi: inchiostro nero segni visibili sul epitelio respiratorio) e (d), correlato colorazione tricromica. Scala bar: 2 mm. (E) vista ingrandimento superiore dell&#39;immagine OFDI con (f) istologia corrispondente colorate con H &amp; E e (g) correlato colorazione tricromica. E: epitelio respiratorio, EL: collagene denso e tessuti elastici, SM: muscolatura liscia, C: anelli di cartilagine (artefatto istologico ha portato separazione artificiale degli anelli cartilaginei), G: il tessuto delle ghiandole salivari, D: dotto salivare entrare epitelio. Bar Scala: 250 micron. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3855/3855fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4.jpg" /> Figura 4. OFDI ed istologia delle vie aeree umane dimostrare precisa correlazione con tessuto marcatura. (A) OFDI di umano prossimale delle vie aeree sia con inchiostro segna visibile (asterischi). (B) tinto istologia Proprio correlata con H &amp; E con inchiostro nero segni visibili sul epitelio respiratorio (asterischi) e (c) correlato colorazione tricromica. Scala bar: 2 mm. (D) vista ingrandimento superiore dell&#39;immagine OFDI e (e), istologia corrispondente colorate con H &amp; E e (f) tricromica. Scala bar: 250 micron. E: epitelio respiratorio, LP: lamina propria, G: il tessuto delle ghiandole salivari, C: anelli di cartilagine, PC: pericondrio. Nelle vie respiratorie dell&#39;uomo, stratificazione tipica è visibile. All&#39;interno del tessuto connettivo sciolto, ci si alternano fasci di rosso-colorazione del muscolo liscio (SM, pannelli C e F), Che non formano un nastro continuo, e quindi non sono visibili come uno strato distinto in OFDI. (G) di OFDI umana vie aeree distali e (h) proprio correlata H &amp; E istologia con segni di inchiostro nero visibili sul epitelio respiratorio (asterischi). Scala bar: 2 mm. Attacchi alveolari (A) sono visibili come segnale intenso reticolare pareti alveolari con spazi vuoti segnale alveolari. Spazi vascolari all&#39;interno della lamina propria sono visibili anche come segnale di vuoto-strutture con sottostante ombra lieve (frecce).

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Un metodo per immagine<em&gt; Ex vivo</em&gt; Campioni di resezione polmonare con ottica dominio della frequenza immagine (OFDI) e ottenere precisa correlazione all&#39;istologia è descritto, che è essenziale per lo sviluppo di specifici criteri di interpretazione OFDI per patologia polmonare. Questo metodo è applicabile ad altri tipi di tessuto e le tecniche di imaging per ottenere immagini precise di correlazione istologia per l&#39;interpretazione delle immagini accurate e valutazione. Criteri di imaging stabilite con questa tecnica sarebbe quindi applicabile alla valutazione immagine in futuro<em&gt; In vivo</em&gt; Studi.

Optical Frequency Domain Imaging di<em&gt; Ex vivo</em&gt; I campioni polmonari Resezione: Ottenere One to One immagine per Istopatologia Correlazione

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

optical-frequency-domain-imaging-ex-vivo-pulmonary-resection

Research

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Bioengineering

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

14.0K Views.  Harvard Medical School. Un metodo per immagine Ex vivo Campioni di resezione polmonare con ottica dominio della frequenza immagine (OFDI) e ottenere precisa correlazione all'istologia è descritto, che è essenziale per lo sviluppo di specifici criteri di interpretazione OFDI per patologia polmonare. Questo metodo è applicabile ad altri tipi di tessuto e le tecniche di imaging per ottenere immagini precise di correlazione istologia per l'interpretazione delle immagini acc...

Video: Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Ricerca

Bioingegneria

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Integrato oftalmoscopia fotoacustico e Spectral-dominio Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a phospholipid and then self-assembled to liposome-like spherical vesicles. Due to the extremely high density of porphyrin in the porphyrin-lipid bilayer, porphysomes generated large extinction coefficients, structure-dependent fluorescence self-quenching, and excellent photothermal efficacy. In our formulation, porphysomes were synthesized using high pressure extrusion, and displayed a mean particle size around 120 nm. Twenty-four hr post-intravenous injection of porphysomes, the local temperature of the tumor increased from 30 &deg;C to 62 &deg;C rapidly upon one minute exposure of 750 mW (1.18 W/cm2), 671 nm laser irradiation. Following the complete thermal ablation of the tumor, eschars formed and healed within 2 weeks, while in the control groups the tumors continued to grow and all reached the defined end point within 3 weeks. These data show how porphysomes can be used as potent photothermal therapy (PTT) agents.

We developed novel intrinsic multifunctional nanovesicles called porphysomes, which have structure-dependent fluorescence self-quenching and unique photothermal properties, thus functioning as potent photothermal therapy agents. We formulated porphysomes using high pressure extrusion and investigated their photothermal therapy efficacy in a xenograft tumor model.

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablazione del tumore Utilizzando Porphysomes, intrinseca multifunzionale nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

L&#39;uso della<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Chandler Loop Apparecchio per valutare la biocompatibilità di Modificati Condotti sangue Polimerici

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l&#39;integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Un metodo per stimare il femore cadaverico corticale ceppi durante frattura test utilizzando correlazione di immagini digitali

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...