L'organizzazione spaziale delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale ha un valore clinico. Questa strategia può essere facilmente utilizzata per visualizzare, quantificare e mappare le cellule immunitarie all'interno del tessuto tumorale. L'immunoterapia ha rivoluzionato il trattamento del cancro.
Tuttavia, non tutti i pazienti rispondono bene. Questa strategia può servire a definire le firme dei tessuti immuni che possono prevedere una buona risposta antitumo-tumorale. Prima di condurre un esperimento, testare le combinazioni di anticorpi e le tecniche di stripping sui tessuti di controllo e verificare che le API siano accurate nel loro rilevamento dei marcatori di interesse.
Poiché le descrizioni scritte dei metodi di analisi delle immagini utilizzano un linguaggio tecnico sofisticato, la combinazione di testo e video facilita una migliore comprensione e replica della metodologia. Per il recupero dell'antigene delle sezioni del tessuto tumorale fissate alla formalina e in paraffina, immergere il campione di tessuto dewaxed in un barattolo coplin di soluzione di recupero dell'antigene e posizionare il barattolo in una pentola a pressione elettrica contenente acqua del rubinetto. Il livello dell'acqua non deve superare la metà dell'altezza del barattolo in modo che l'acqua non si mescoli con la soluzione di recupero dell'antigene.
Chiudere il coperchio e la valvola di pressione sul fornello e trattare i vetrini ad alta pressione per 10 minuti. Alla fine del trattamento, scollegare il fornello, rilasciare la pressione e aprire il coperchio. Dopo che le diapositive si sono raffreddate nel fornello per 30 minuti, lavare i campioni due volte per cinque minuti in PBS fresco per lavaggio in un nuovo barattolo coplin, quindi utilizzare una penna idrofobica per disegnare una barriera intorno a ogni sezione tissutale.
Successivamente, immergere i vetrini nella glicina 0,1 molare in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente prima di risciacquare i vetrini due volte in PBS come dimostrato. Dopo il secondo lavaggio, trasferire gli scivoli in una camera di umidità e coprire ogni sezione di tessuto con soluzione di blocco. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, sciacquare le sezioni due volte per cinque minuti in PBS-Tween fresco per lavaggio, quindi aggiungere gli anticorpi primari di interesse, diluiti in soluzione di blocco, ad ogni diapositiva, protetti dalla luce.
Al termine dell'incubazione, sciacquare le diapositive tre volte in PBS-Tween fresco per cinque minuti per lavaggio, quindi etichettare le sezioni con gli anticorpi secondari appropriati per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sciacquare gli scivoli tre volte in PBS-Tween fresco per cinque minuti per lavaggio. Seguire con un unico risciacquo in acqua a doppia distillazione.
Rimuovere l'acqua in eccesso da ogni scivolo e montare i tessuti con un mezzo di montaggio integrato con DAPI e uno scivolo di copertura. Dopo aver spremito il mezzo di montaggio in eccesso, lasciare asciugare le diapositive per 20 minuti a temperatura ambiente, protette dalla luce, prima di acquisire immagini per tutti i canali utilizzando uno scanner a scorrimento intero. Dopo la scansione, aprire le immagini nel software di analisi delle immagini e fare clic sulla scheda Tissuealign.
Per importare le immagini da allineare nella diapositiva, selezionare la prima immagine da allineare dal database. Dopo aver caricato tutte le immagini, fare clic su Avanti nei passaggi del flusso di lavoro per collegare le immagini e trascinare e rilasciare tutte le immagini da allineare alla prima immagine. Quando tutte le immagini sono state collegate a caso, utilizzare un minimo di tre pin per immagine che indichino le caratteristiche del tessuto omologo nelle immagini collegate.
Usa un perno per tracciare la prima immagine per verificare la qualità dell'allineamento risultante. Se è stato ottenuto un allineamento soddisfacente, fare clic su Avanti per visualizzare i livelli dell'immagine e salvare l'immagine composita nel database. Per eseguire un rilevamento tissutale utilizzando il protocollo APP 1 definito dall'utente, aprire la scheda Analisi immagini e aprire l'immagine composita nel modulo di analisi delle immagini.
Fare clic sull'icona Apri APP e selezionare l'APP appropriata. Per verificare che l'APP funzioni, passare a una posizione del tessuto selezionata e fare clic su Anteprima. Se i risultati sono soddisfacenti, fare clic per elaborare l'immagine utilizzando l'APP selezionata.
Durante l'elaborazione l'APP determinerà se il pixel è associato o meno al tessuto per consentire la conversione di tutti i pixel associati ai tessuti in una regione di interesse. L'area di interesse appena creata può quindi essere trasferita a una qualsiasi delle immagini allineate. Al termine dell'analisi, fate clic su File e salva (Save) per salvare l'immagine modificata con l'area di interesse appena creata.
Per la segmentazione del tessuto in stroma e parenchima, aprire la scheda Analisi immagini e selezionare i file di interesse dal database. Aperto APP 2, APP 2 utilizza l'immagine macchiata di PSR per la segmentazione dei tessuti. Visualizza in anteprima APP 2 elaborando l'immagine in un campo visivo selezionato.
Se i risultati sono soddisfacenti, fare clic su Esegui per elaborare APP 2 sull'immagine completa. La regione di interesse del tessuto sarà segmentata in stroma e parenchima e le rispettive aree determinate. Le aree di interesse appena create per lo stroma e il parenchima possono essere trasferite alle immagini allineate, quindi esportare e salvare l'immagine modificata come illustrato.
Per identificare e quantificare le popolazioni di celle di interesse, importare l'immagine segmentata di interesse nel modulo di analisi delle immagini. Dopo aver regolato il colore, aprire APP 3. APP 3 rileverà le popolazioni cellulari di interesse e le quantificherà all'interno del parenchima e dello stroma.
Se i risultati sono soddisfacenti, eseguire APP 3 sull'immagine completa. Tutte le singole cellule di interesse saranno etichettate, le loro coordinate tissutali immagazzinate e le densità delle cellule di interesse nelle regioni stroma e parenchimali determinate. L'immagine modificata può quindi essere salvata come dimostrato.
Per eseguire ilmapping termico dei tessuti degli oggetti etichettati della cella di interesse, aprire il protocollo definito dall'utente appropriato nella finestra di selezione app e fare clic su Esegui per richiedere all'APP di utilizzare le coordinate degli oggetti etichettati con anticorpi per generare la mappa termica. Le aree sensibili, evidenziate in rosso, contengono la più alta densità della popolazione cellulare di interesse, mentre le aree blu scuro hanno la più bassa. La mappa termica di una specifica popolazione cellulare può essere sovrapposta alle immagini allineate per fornire ulteriori informazioni su come queste cellule sono organizzate all'interno del microambiente tumorale.
Quindi esportare e salvare la mappa termica dei tessuti. È fondamentale verificare la specificità dell'etichettatura, l'accuratezza delle API progettate e l'efficienza di stripping e riprobing delle diverse macchie nella stessa sezione. Integrando l'imaging seriale, l'etichettatura sequenziale e l'allineamento dei tessuti, è possibile visualizzare più marcatori contemporaneamente e ulteriori informazioni possono essere estratte da campioni clinici limitati.
La colorazione H&E delle sezioni del tessuto tumorale resettato consente la valutazione dell'architettura tissutale, della morfologia cellulare e dei parametri clinicamente rilevanti come il tipo di malignità, il grado tumorale e l'infiltrazione immunitaria complessiva. La colorazione CD34 consente il rilevamento di cellule endoteliali. La colorazione della citocheratina 8/18 rivela la presenza di cellule epiteliali e la colorazione dell'actina muscolare liscia anti-alfa consente l'identificazione di cellule stellate fibrogene, attivate ed epatiche.
La riproiezione con anticorpi contro CD68 e Desmin consente rispettivamente il rilevamento di macrofagi e miofibroblasti. Per caratterizzare meglio l'infiltrato tumorale-immunitario, è possibile eseguire la colorazione per marcatori delle cellule T e mieloperossidasi. La colorazione Picro Sirius Red può anche essere eseguita per visualizzare il collagene fibrilla e facilitare la segmentazione di stroma e parenchima.
I pixel associati ai tessuti all'interno delle sezioni macchiate possono essere identificati per consentire la segmentazione di diversi compartimenti all'interno di una specifica regione di interesse. Le popolazioni cellulari di interesse possono quindi essere identificate all'interno di ogni regione, consentendo la generazione di mappe tissutali per le quali le regioni ad alta densità per una data popolazione cellulare sono visualizzate come punti caldi e le regioni con una densità relativamente bassa appaiono come punti freddi. Questa metodologia per identificare, quantificare e mappare le cellule immunitarie nei campioni di tessuto può essere adattata e convalidata per una specifica domanda di ricerca e marcatore di interesse.
Questa strategia può essere applicata ai micro array di tessuti per l'analisi ad alta produttività. Può anche essere combinato con l'ibridazione in situ per esaminare contemporaneamente l'espressione proteica ed genica in situ. Abbiamo utilizzato questa strategia per identificare e mappare le cellule produttrici di IL-17A in situ nel tessuto epatico fibrotico dei pazienti.
Come indicato nel protocollo, diversi reagenti sono chimicamente pericolosi e le relative procedure devono essere eseguite in una cappa chimica utilizzando gli opportuni dispositivi e precauzioni di protezione individuale.
