Questo lavoro è stato sostenuto dal numero Wellcome Trust sovvenzione [077108] assegnato a GJW.

1. Compilazione di un Bait and Library of Prey plasmide di espressione Vettori <ol><li> Compilare un elenco di recettori della superficie delle cellule e proteine ​​secrete di interesse da screening di interazioni e recuperare le loro sequenze da un database adeguato sequenza della proteina. La maggior parte delle proteine ​​contenenti un peptide N-terminale di segnalazione secretoria sono adatti (questi includono tipo I, GPI-legati e proteine ​​secrete). Tipicamente, una famiglia di proteine ​​(per esempio superfamiglia delle immunoglobuline o tutti i recettori limitato a un tipo di cellula specifico come il eritrociti) sarebbe selezionato. </li><li> Determinare l&#39;estensione delle regioni extracellulari individuando la posizione del peptide segnale e regione transmembrana con funzionalità software proteina predizione. Usiamo tipicamente v3.0 SignalP 5 e TMHMM v2.0 6. </li><li> Design set di primer che amplificano il frammento intero ectodomain per ciascun recettore. Abbiamo una serie di esca e vettori prede che sono adatti per questo scopo che sonovailable da Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Progettare l&#39;innesco senso intorno all&#39;inizio metionina per includere un sito di restrizione NotI enzima e una sequenza di Kozak ottimale, questo è seguito da 25 coppie di basi di corrispondenza esatta sequenza gene-specifico (Fig. 2A). </li><li> Progettare il primer antisenso per troncare tipo I proteine ​​recettori appena prima della regione transmembrana previsto in modo da esprimere l&#39;intera ectodomain come proteina solubile ricombinante. Includere un sito di restrizione AscI in questo fondo, che dovrebbe poi tradurre in cornice ad un C-terminale di ratto Cd4d3 quattro proteine ​​tag 7 (Fig. 2A). </li><li> Amplificare i frammenti ectodomain di tutti i geni che utilizzano questi primer e clonarli nel esche o vettore di preda. A volte trovano utile prima li clonare in vettori shuttle prima subcloning in un vettore appropriato espressione di mammifero, si usa un derivato del vettore pTT3 3,4. Sia l&#39;esca e la preda vettori contenin C-terminale della proteina tag, come segue (Fig. 2b). <ol><li> Esche: Un tag contenente domini 3 e 4 del CD4 di ratto (Cd4d3 +4) proteine ​​seguiti da una sequenza peptidica che è un substrato per l&#39;enzima Bira E.coli e possono quindi essere monobiotinylated su specifico residuo di lisina (Fig. 2B) . Il Cd4d3 4 tag viene riconosciuto dal anticorpo monoclonale OX68 e viene utilizzato per quantificare l&#39;espressione delle proteine ​​esca da ELISA. Le proteine ​​sono quindi esca monomerica e monobiotinylated. Altri vettori proteina esca qualora la sostituzione del peptide biotinylatable da 6-tag per la sua purificazione sono disponibili. </li><li> Prede: Le prede anche contenere un topo Cd4d3 4 tag seguito da una sequenza peptidica della proteina di ratto matrice cartilaginea oligomerici (COMP) ed un C-terminale dell&#39;enzima β-lattamasi. Il peptide COMP assicura i pentameri preda forme volta espresso (Fig. 2B). </li></ol></li></ol> 2. Prey e Bait-espressione della proteina Usiamoun comodo alto livello di sistema di espressione mediante coltura in sospensione della linea cellulare HEK293E 4 per produrre le librerie di proteine, ma qualsiasi sistema di espressione mammifero dovrebbe essere adatto. Un&#39;alternativa disponibile in commercio è il sistema di Freestyle. Le cellule coltivate vengono abitualmente su una piattaforma di agitazione (125 rpm) a 37 ° C, 5% CO 2 al 70% di umidità relativa. Proteine ​​di controllo sia positive che negative devono essere espresse. Il ratto Cd4d3 4 tag solo frammento è disponibile sia come esca e la preda e sono idonei controlli negativi. Allo stesso modo, i vettori esca e la preda che codificano per un controllo positivo sono disponibili (Addgene); si utilizzano in genere il topo-CD200 CD200R interazione 8. <ol><li> Seme le cellule HEK293E il giorno prima della trasfezione ad una densità di 2,5 x 10 5 cellule mL -1. Noi abitualmente coltivare le cellule in volumi di 50 mL in Freestyle293 mezzi in base alle raccomandazioni del costruttore. Per garantire biotinilazione efficiente, t integrareegli terreno di coltura cellulare utilizzato per produrre proteine ​​esca con D-biotina ad una concentrazione finale di 100 pM. Mezzo usato per esprimere le proteine ​​preda non ha bisogno di essere integrato con ulteriori D-biotina. </li><li> Il giorno seguente, le cellule trasfezione usando un reagente adatto trasfezioni (293fectin es). Uso 25 pg dell&#39;esca o preda costrutti plasmidici per trasfettare cultura a 50 mL. Per produrre le esche biotinilati, co-trasfezione del plasmide codificante il costrutto esca con un plasmide che codifica una forma secreta della proteina-biotina E.coli ligasi ( Bira) che è disponibile da Addgene. Co-trasfezione plasmidi esca un rapporto di 10:1 (2,5 microgrammi) del plasmide codificante la proteina secreta Bira. </li><li> Culture Harvest cinque giorni post-trasfezione di primo pellet delle cellule per centrifugazione a 3000 xg per 20 minuti, seguita da filtrazione del surnatante attraverso un filtro di 0,22 pM. </li></ol> [Suggerimento: Bait e proteine ​​predas deve essere conservato diluiti a 4 ° C e come guida generale deve essere utilizzato entro un anno. Aggiungere batteriostatici quali 50 ug / mL polimixina B solfato o 10 mM NaN 3 per evitare la contaminazione batterica dei supernatanti.] 3. La normalizzazione del Bait e Campioni Prey Una delle caratteristiche principali del saggio AVEXIS è che, poiché le proteine ​​ricombinanti sono secrete possono essere diluiti o concentrati (normalizzato) con l&#39;attività di soglia stabiliti prima di essere utilizzati nel test. Abbiamo trovato che i livelli in cui sono espresse le proteine ​​ricombinanti coprono una vasta gamma - fino a 4 ordini di grandezza - e quindi il passo di normalizzazione riduce significativamente il numero di falsi positivi nelle schermate. 3,1 Bait normalizzazione Nota: non coniugato D-biotina deve essere rimosso dal supporto (tipicamente da dialisi), poiché sarà in competizione con il biotinilato bait proteine ​​per il legame con streptavidina siti di legame. <ol><li> Trasferire surnatanti esche in tubo di dialisi, etichetta, ritagliare in modo sicuro e dializzato ampiamente contro un tampone adatto come PBS per rimuovere biotina libera. </li></ol> [Suggerimento: Abbiamo trovato che la dialisi sufficiente si ottiene normalmente per 6 surnatanti ml x 50 esche contro un volume di 4,5 L di PBS con 4 variazioni nel corso di un periodo di 24 ore. Dialisi insufficiente può essere osservata una inibizione di legame proteico a diluizioni basse durante la fase di normalizzazione esca (Fig. 3A.) <ol start="2"><li> Eseguire un test ELISA per determinare i relativi livelli in cui sono espresse le proteine ​​esca. Preparare una serie di diluizioni delle proteine ​​esca biotinilati e catturare su una placca rivestita con streptavidina microtitolazione. Utilizzare il topo Cd4d3 4 tag per individuare e quantificare le proteine ​​esca catturati utilizzando un anticorpo monoclonale (OX68). Concentrato o diluire le proteine ​​esca per l&#39;importo minimo richiesto per saturare tutto il biotin siti di legame nel pozzetto di una piastra rivestita con streptavidina. </li><li> Bloccare dei pozzetti di una piastra rivestita di streptavidina con tampone fosfato saline/0.1% Tween-20 (PBST) / 2% di sieroalbumina bovina (BSA) per 15 minuti. </li><li> In una piastra separata, una serie di diluizione (quattro diluizioni sono in genere sufficienti 1,3) delle proteine ​​esca in PBST BSA / 2% e il trasferimento di pozzetti di una piastra rivestita con streptavidina. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte in PBST. Aggiungere 100 pl di 2 ug / ml di topo anti-ratto IgG Cd4d3 4 (OX68) incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte in PBST. Aggiungere 100 pl di topo anti-fosfatasi alcalina a 1/5.000 diluizione in PBST / 2% BSA e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte in PBST ed eseguire un lavaggio finale in PBS per rimuovere ogni residuo di detersivo. Aggiungere 100 pl di 1 mg / ml di substrato 104 in tampone dietanolammina (10% dietanolammina (v / v), 0,5 mM MgCl 2, 10 mM NaN 3, pH9.8, protetto dalla luce a 4° C). </li><li> Dopo un&#39;ora, misura l&#39;assorbanza a 405 nm. Rappresentativi dei risultati di normalizzazione esche sono mostrati in figura 3A. </li><li> Bait proteine ​​che vengono espresse a livelli sufficienti per saturare tutti i siti di legame biotina-streptavidina di una piastra rivestita, se usato diluito, dovrebbe essere concentrata usando Vivaspin concentratori (Vivascience, 10kDa MWCO). Come guida, stimiamo che circa il 5 mg di una proteina tipica esca (~ 80 kDa) è sufficiente a saturare un piastra a 96 pozzetti. <ol><li> Bait proteine ​​espresse a livelli elevati può essere diluito in PBST BSA / 2% a una concentrazione sufficiente a saturare la piastra rivestita con streptavidina. L&#39;attività delle esche devono essere verificati dopo la diluizione o concentrazione per garantire che tutti i siti di legame della biotina streptavidina piastra rivestita. </li></ol></li></ol> 3,2 Prey normalizzazione <ol><li> Quantificare i livelli relativi a cui sono espresse le proteine ​​preda con la β-lattamasiL&#39;attività enzimatica. </li><li> Innanzitutto, una serie di diluizioni di supernatante contenente le proteine ​​prede in PBST / 2% tampone BSA. Aggiungere quindi 20 pl delle diluizioni di 60 pl di una 242 pM (0,125 mg / mL) nitrocefina soluzione (Calbiochem). </li><li> Immediatamente trasferire la piastra ad un lettore di micropiastre che accetta una misurazione di assorbanza a 485 nm ogni minuto per 20 minuti a temperatura ambiente. Rappresentativi dei risultati di normalizzazione prede sono mostrati in figura 3B. </li><li> Concentrato campioni con centrifuga concentratori o diluire in PBST / 2% BSA per raggiungere una soglia di attività ~ 2 nmol min -1 fatturato di nitrocefina. In pratica, questo si ottiene se tutto il nitrocefina viene idrolizzato in ~ 7 minuti. </li></ol> 4. AVEXIS Procedura di screening <ol><li> Lavare streptavidina piastra rivestita in PBST. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di PBST / 2% BSA in ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti per bloccare altri siti di legame delle proteine ​​spuri all&#39;interno di ogni bene. </li&gt; </ol> [Suggerimento: per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio dopo operazioni di lavaggio, la lastra viene sfruttato - con forza - su carta assorbente] <ol start="3"><li> Rimuovere la soluzione di saturazione con un colpo intelligente della piastra sopra un lavandino e aggiungere 100 microlitri normalizzato esca biotinilato monomerico ai pozzetti ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere i campioni esca dalla piastra ribaltando il piatto e intelligente flicking sopra un lavandino, e lavare 3 volte in PBST. </li><li> Aggiungere 100 pl della preda normalizzato pentamerized costrutto a ciascun pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora, lavate come nel passaggio 4,4 ed eseguire un lavaggio finale con PBS solo. </li><li> Aggiungere 60 ml di soluzione pM 242 nitrocefina (sciogliere 5 mg di nitrocefina in 500 microlitri di DMSO, mescolare accuratamente e poi ulteriormente diluire il nitrocefina in 40 ml di PBS e passare attraverso un filtro 0,22 uM prima di aggiungere alle piastre) e incubare a temperatura ambiente . Interazioni positivi può osservarea occhio poiché la nitrocefina giallo viene idrolizzato ad un colore rosso. Quantificare leggendo l&#39;assorbanza a 485 nm usando un lettore di piastre. Una piastra tipica e quantificazione è mostrato in fig. 4. </li></ol> [Suggerimento: interazioni positive si osservano di solito entro 2 ore a temperatura ambiente, anche se le piastre devono essere posizionati a 4 ° C per 16 ore per garantire che tutti i potenziali interazioni vengono rilevati. Abbiamo anche scoperto che nitrocefina precipitato e imperfezioni sulla plastica della piastra di microtitolazione come graffi / impronte digitali può talvolta portare a falsi positivi artefattuali a 485 nm, nonostante non idrolisi nitrocefina palese. Si consiglia pertanto di scattare fotografie delle piastre per registrare visivamente fatturato nitrocefina nei pozzetti.] 5. Risultati rappresentativi Un esempio rappresentativo di una piastra di screening AVEXIS è mostrato in Figura 4. Si dovrebbe osservare idrolisi (giallo al rosso) del substrato nitrocefina nellapositiva dei pozzetti di controllo (sia mediata da anticorpi di controllo cattura della preda e anche l&#39;interazione controllo positivo) entro una decina di minuti. Alcune interazioni all&#39;interno dello schermo si osservano anche all&#39;interno di questo lasso di tempo, ma altri possono richiedere più tempo (poche ore) a comparire. Tipicamente, un hit-rate di circa 0,4-0,6% (un&#39;interazione positiva per ogni 150-250 interazioni state selezionate) è tipico, a seconda delle librerie di proteine ​​state selezionate. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Figura 1. Identificazione del recettore-ligando interazioni cellulari che mediano i processi di riconoscimento con AVEXIS. Lo schema mostra due cellule interagenti (A e B) che scambiano informazioni attraverso le interazioni effettuate tra membrana incorporati proteine ​​recettoriali. AVEXIS è scalabile saggio interazione proteina specificamente progettato per identificare nuovi recettore-ligando coppie che sono caratterizzate da forze di interazione molto deboli. Ricombinante cosìbiblioteche luble proteine ​​che rappresentano il ectodomain tutto il repertorio recettore sulla superficie cellulare di entrambe le cellule vengono compilate sia come pentamerica prede β-lattamasi-etichetta (tipo di cellula A) o monomeriche esche biotina-tag (per cellule di tipo B). La pentamerisation del prede aumenta la concentrazione locale dei ectodomains di effettuare un guadagno complessivo avidità modo che le interazioni anche molto transitori possono essere rilevati. La biblioteca esca è disposti su piastre rivestite di streptavidina e sistematicamente sondato per le interazioni con le proteine ​​preda. Dopo un lavaggio breve, tutte le prede catturate vengono rilevati utilizzando il β-lattamasi attività associate con la preda. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Figura 2. Bait and costrutto progettazione preda. (A) Il CD200 proteina recettore di ratto è fornito come un esempio di come i ectodomains intero proteine ​​di superficie cellulare recettori sono determinate e primer sono progettati per effettuare sia escae prede costrutti di espressione. La sequenza di proteina tradotta cDNA e vengono visualizzati dal N-terminale del peptide segnale al transmembranale regione transmembrana di ratto CD200. Un innesco senso è progettato per includere un sito 5 &#39;enzima di restrizione NotI e la sequenza di Kozak ottimale seguita da 25 basi della sequenza corrisponde esattamente alla sequenza di cDNA CD200. L&#39;innesco antisenso contiene un sito AscI e 25 basi della sequenza esatta corrispondenza situato immediatamente a monte del residuo selezionato troncamento ectodomain. Per mantenere la ectodomain in frame con il ratto Cd4d3 4 tag, il sito AscI dovrebbe tradursi come Gly-Ala-Pro. (B) Una rappresentazione schematica delle esche e costrutti di espressione preda. Ogni recettore contiene ectodomains fiancheggiati da NotI e siti ASCI e uno Cd4d3 4 tag. Le esche contengono un C-terminale sequenza peptidica che può essere specificamente monobiotinylated da coinfezione con un plasmide che esprime un enzima secreto Bira. Le prede sono seguiti dalla sequenza pentamerisationdalla proteina matrice cartilaginea oligomerica (COMP) e la β-lattamasi enzima. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Figura 3. La normalizzazione dei dell&#39;esca e proteine ​​preda. (A) esempi rappresentativi di normalizzazione esca. Una serie di diluizioni di quattro differenti esca dialisi supernatanti sono stati rilevati mediante ELISA utilizzando un anticorpo anti-CD4 monoclonale tag. I quattro esche sono espressi a diversi livelli 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4. Le esche devono essere normalizzati a un livello di soglia che satura i siti di legame biotina in ciascun pozzetto. Esche altamente espresse possano essere diluito per conservare le proteine ​​(ad esempio esca 1 potrebbe essere diluito ~ 1:100), esche e mal espressi concentrato. Letture diminuiti a basse diluizioni sono talvolta osservati in alcuni esche (es. esche 2) che è imputabile alla presenza di D-biotina coniugato a causa di dialisi incomplete. (B) I livelli a cui sono vittime le proteine ​​sono expressato è quantificato utilizzando il tasso di idrolisi di un β-lattamasi substrato, nitrocefina. Nell&#39;esempio illustrato, le tre prede sono espressi a livelli diversi: preda 1&gt; 2&gt; 3. Prede devono essere normalizzati un&#39;attività di ~ 2 nmol min -1, che corrisponde a completare idrolisi di 14,5 nmol nitrocefina in ~ 7 minuti (es preda 1). Le prede di altri in questo esempio dovrebbe essere concentrata prima dell&#39;uso nello screening. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentativi AVEXIS screening risultati. (A) una fotografia di un rappresentante piastra di screening AVEXIS. Una proteina contro la preda viene sondato 41 esche diverse e una positiva interazione viene rilevato in E2 bene. Controlli utilizzati nei piatti di screening comprendono: un biotinilato anti-CD4 anticorpi per catturare tutte le proteine ​​preda aggiunto al bene (G6), una interazione controllo: rat CD200 (esche)-CD200R (prede) con il CD200R preda utilizzato alla diluizione di soglia (H3), 1:10 (H4) e 1:100 (H5). I controlli negativi erano: uno Cd4d3 4 esca sondati con la proteina preda essere proiettato (H1) e la preda CD200R (H2). (B) Quantificazione dei valori di assorbanza della stessa schermata effettuata in triplicato. I punti dati sono media ± SD.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Quando le cellule viventi sono osservate in vivo, le membrane plasmatiche mostrare comportamenti altamente dinamici: estendere e processi a membrana a scomparsa in quanto si mettono in contatto e comunicare con loro due vicini. Le interazioni fisiche tra le membrane-embedded proteine ​​recettori che mediano molti di questi contatti sono evoluti per essere estremamente debole in modo da permettere questo comportamento altamente mobili. E &#39;stato stimato che le forze di interazione debole come monomerici 50 micron potrebbe essere sufficiente a guidare le interazioni spontanee a densità dei recettori fisiologici 9 che fa rilevare nuove interazioni estremamente impegnativi 2,10. Il metodo AVEXIS qui descritto fornisce un metodo sensibile per rilevare transitori proteina extracellulare: interazioni proteiche che possono essere implementate in maniera scalabile con un basso tasso di falsi positivi. Mentre altri metodi scalabili sono stati sviluppati per rilevare le interazioni extracellulari 11-15,Un vantaggio di AVEXIS è che i parametri sperimentali come l&#39;esca e la preda attività sono state quantificate per rilevare anche la più debole delle interazioni (t 1/2 ≤ 0,1 s), pur mantenendo un basso tasso di falsi positivi 3. Inoltre, le procedure semplificate e robusta preparazione del campione hanno permesso questo test da attuare su una scala molto più grande di altri test e abbiamo recentemente descritto una schermata sistematica interazione ~~~HEAD=NNS un totale di oltre 16.500 potenziali interazioni 16. Il dosaggio può essere eseguita su qualsiasi proteina per la quale è possibile esprimere un frammento solubile proteina ricombinante. Questo include pertanto proteine ​​che contengono un peptide N-terminale come segnale di tipo I, GPI-legati e proteine ​​secrete. Recentemente abbiamo progettato una serie di vettori che ora ci consentono di esprimere proteine ​​di tipo II come esche 17. Il saggio non è generalmente indicato per le proteine ​​di membrana multipass come trasportatore di ionis o pompe in quanto è improbabile che possano essere correttamente piegato al di fuori del contesto di una membrana plasmatica. Abbiamo applicato questo per una varietà di sistemi diversi e si sono espressi con successo proteine ​​extracellulari da zebrafish 3,16,18, umano, mouse e P. falciparum per schermi di interazione. In termini di risorse necessarie per impostare uno schermo AVEXIS, abbiamo scoperto che un collo di bottiglia significativo è la costruzione, selezione e completo sequenziamento dei plasmidi di espressione. Questo aspetto del metodo può richiedere fino a un anno per fare ~ 100 esche e costrutti prede, tuttavia, con il costo diminuzione della sintesi del gene, ora favorire commercialmente outsourcing questo aspetto del progetto. Il sistema mammifero di espressione insieme ad un grande incubatore per colture scuotimento del tessuto (si usa un cellulare Multitron INFORS HT) consente a un singolo ricercatore di esprimere e normalizzare fino a ~ 100 esche e le proteine ​​preda di un mese. Una volta che le proteine ​​sono prodotte e normalizzati, screening per le interazioni è rapido con fino a dodici piastre a 96 pozzetti essere convenientemente lavorati al giorno. L&#39;apparecchiatura solo su misura che abbiamo sviluppato per facilitare la produzione di un grande numero di proteine ​​è aria compressa-driven pistone che viene utilizzato per passare fino a cinque supernatanti attraverso un filtro 0.22μm in parallelo. La classe principale di interazioni che potrebbero perdere rispetto alle interazioni attesi dalla letteratura (falsi negativi) sono interazioni omofili, anche se alcune di queste interazioni possono essere rilevati 3. Nei casi in cui interazioni previsti non vengono rilevati, riteniamo che questo è dovuto alla formazione di interazioni omofili dalle proteine ​​preda (preda effetto &quot;mascheratura&quot;) che impedisce poi ulteriori interazioni con proteine ​​esca immobilizzate. La frequenza con cui vengono rilevate le interazioni dipende dal contenuto della biblioteca proteina sottoposta a screening. Come guida per il lettore, uno schermo di&gt; 30, 000 le interazioni all&#39;interno della superfamiglia delle immunoglobuline zebrafish portato a 188 positivi - una frequenza di 0,6% 3,16,18. Un controllo molto rapido che può essere eseguito per verificare eventuali colpi positivi è determinare se l&#39;interazione può essere rilevato in entrambe esca-prede orientamenti, che è, può essere la stessa interazione rilevato indipendentemente se le proteine ​​leganti sono presenti sia come esca o di una preda. Ogni volta che abbiamo osservato questo comportamento reciprocità, l&#39;associazione è stato successivamente dimostrato di essere specifico, dimostrando diretto legame saturabile di proteine ​​purificate mediante risonanza plasmonica di superficie. Va sottolineato che, poiché si aumenta avidità vincolante artificialmente pentamerising le proteine ​​preda, non consideriamo il test adatto per confrontare quantitativamente i punti di forza di interazione. Per ottenere i parametri biofisici legame di interazione che usiamo proteine ​​monomeriche e risonanza plasmonica di superficie. Infine, una volta una interazione è stato identificato, l&#39;hinatura velocità gh del dosaggio rende relativamente facile adattare il saggio di schermo per reagenti quali anticorpi o piccole molecole che bloccano l&#39;interazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Cat. Numero </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Freestyle dei media </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocefina </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA-piastre di microtitolazione rivestite </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 anticorpi </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Dialisi tubi </td><td> Perforare </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polimixina B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotina </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Substrato-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 centrifugo concentratori </td><td> Sartorius </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 micron filtri </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidity-based extracellular interaction screening (avexis) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions

Proteina extracellulare: le interazioni tra proteine ​​secrete o di membrana guinzaglio proteine ​​sono fondamentali per la coesione iniziare la comunicazione intercellulare e di garantire all&#39;interno di organismi pluricellulari. Proteine ​​previsto per formare interazioni extracellulari sono codificati da circa un quarto di geni umani 1, ma nonostante la loro importanza e abbondanza, la maggior parte di queste proteine ​​non hanno documentato partner di legame. Principalmente, ciò è dovuto alla loro intrattabilità biochimica: proteine ​​di membrana-embedded sono difficili da solubilizzare nella loro conformazione nativa e contengono modificazioni post-traduzionali strutturalmente importanti. Inoltre, le affinità di interazione tra proteine ​​recettori sono spesso caratterizzate da forze di interazione estremamente basse (emivita &lt;1 secondo) precludendo la loro rivelazione con molti metodi abituali high throughput 2. Qui, descriviamo un saggio, AVEXIS (Avidità-based extracellularelar Interaction Screen) che vince queste sfide tecniche che consentono la rilevazione delle interazioni proteiche molto deboli (t 1/2 ≤ 0,1 sec) con un basso tasso di falsi positivi 3. Il saggio è generalmente implementato in un formato alto rendimento per consentire lo screening sistematico di molte migliaia di interazioni in un formato conveniente micropiastra (Fig. 1). Essa si basa sulla produzione di proteine ​​ricombinanti solubili librerie che contengono i frammenti ectodomain di recettori di superficie cellulare o proteine ​​secrete entro il quale per schermare interazioni, pertanto, questo approccio è adatto per il tipo I, di tipo II, GPI-linked recettori di superficie cellulare e secreta proteine, ma non per le proteine ​​di membrana multipass quali canali ionici e trasportatori. Le librerie di proteine ​​ricombinanti vengono prodotte usando un sistema pratico e di alto livello di espressione mammifero 4, per garantire che le modifiche post-traduzionali importanti quali glycosylazione e di legami disolfuro sono aggiunti. Espressa proteine ​​ricombinanti sono secreti nel mezzo e prodotta in due forme: una esca biotinilato che può essere catturato su una rivestita di streptavidina fase solida adatta per lo screening, e un pentamerised enzima-tag (β-lattamasi) preda. L&#39;esca e proteine ​​preda sono presentati l&#39;uno all&#39;altro in modo binario di rilevare le interazioni dirette tra loro, analogamente a una convenzionale ELISA (Fig. 1). La pentamerisation delle proteine ​​la preda è ottenuta attraverso una sequenza peptidica della proteina di matrice cartilaginea oligomerica (COMP) e aumenta la concentrazione locale dei ectodomains fornendo in tal modo vantaggi significativi avidità per consentire interazioni anche molto transitori da rilevare. Normalizzando le attività sia l&#39;esca e la preda a livelli predeterminati prima della proiezione, abbiamo dimostrato che le interazioni che hanno monomeriche emivite di 0,1 sec possono essere rilevati con bassi tassi di falsi positivi 3.

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Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS è un saggio di rendimento elevato di proteine ​​di interazione sviluppate per lo screening sistematico per nuovi extracellulare del recettore-ligando coppie coinvolte in processi di riconoscimento cellulare. Si è specificamente progettato per rilevare le interazioni proteina transitori che sono difficili da identificare usando altri metodi di high throughput.

Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

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Biology

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

21.4K Views.  Wellcome Trust Sanger Institute. AVEXIS è un saggio di rendimento elevato di proteine ​​di interazione sviluppate per lo screening sistematico per nuovi extracellulare del recettore-ligando coppie coinvolte in processi di riconoscimento cellulare. Si è specificamente progettato per rilevare le interazioni proteina transitori che sono difficili da identificare usando altri metodi di high throughput.

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OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Ricerca

Biologia

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Tecniche per l&#39;Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

A Rapid, metodo scalabile per l&#39;isolamento, studio funzionale, e analisi di Cell-derivati ​​matrice extracellulare

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native receptor and the ligand are challenging since the ligand of a specific receptor may be unknown and experimental procedures with the native ligand can be technically complicated. To address these obstacles, we describe a reporter system to detect the binding and activation of a specific receptor by a ligand of interest. In this reporter system, the extracellular domain of a specific receptor is conjugated to mouse CD3&#950; and this chimeric protein is then expressed in mouse BW cells. These transfected BW cells can then be incubated with different targets (e.g., cells or antibodies). Activation of a transfected receptor leads to the secretion of mouse interleukin-2 (mIL-2) which can be detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This reporter system has the advantages of being sensitive and specific to a single receptor. In addition, the activation level of a specific receptor can easily be quantified and can be used even in cases where the ligand of the receptor is unknown. This system has been implemented successfully in many of our studies to characterize receptor-ligand interactions. We have recently employed this system to study the activation of human Fc&#947; receptors (Fc&#947;Rs) by different monoclonal anti-CD20 antibodies in clinical use.

This protocol describes how to establish a reporter system that can be used to identify and quantify receptor-ligand interactions.

Un sistema di BW Reporter per lo studio di interazioni recettore-ligando

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni delle vescicole extracellulari

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular communication in various research fields; cancer biology, neuroscience, and drug delivery. Many EV uptake assays have been reported in the literature; however, there is a lack of practical, detailed experimental methodology. EV uptake can be assessed by fluorescently labeling EVs to detect their location within cells. Distinguishing between internalized EVs in cells and the superficial EVs on cells is difficult, yet critical, to accurately determine the EV uptake. Therefore, an assay that efficiently quantifies EV uptake through three-dimensional (3D) fluorescence confocal microscopy is proposed in this work. Fluorescently labeled EVs were prepared using a nano-filtration-based microfluidic device, visualized by 3D confocal microscopy, and then analyzed through advanced image-processing software. The protocol provides a robust methodology for analyzing EVs on a cellular level and a practical approach for efficient analysis.

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular vesicles (EVs) contribute to cellular biology and intercellular communications. There is a need for practical assays to visualize and quantify EVs uptake by the cells. The current protocol proposes the EV uptake assay by utilizing three-dimensional fluorescence imaging via confocal microscopy, following EV isolation by a nano-filtration-based microfluidic device.

Test di assorbimento delle vescicole extracellulari tramite analisi di imaging al microscopio confocale

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...