Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust nombre subvention [077108] attribué à GJW.

<ol>
	<li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li><li>Bushell, K. 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K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum.">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480, 534-537 (2011).</li><li>Sollner, C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+surface+interaction+network+of+neural+leucine-rich+repeat+receptors.">A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors.</a> Genome biology. 10, R99-R99 (2009).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Lorsque les cellules vivantes sont observées in vivo, leurs membranes plasmiques présentent des comportements très dynamiques: l&#39;extension et de rétraction des procédés membranaires comme ils entrent en contact et communiquer avec leurs 2 voisins. Les interactions physiques entre les protéines réceptrices membrane embarqués qui interviennent dans beaucoup de ces contacts ont évolué pour être extrêmement faible afin de permettre ce comportement très mobiles. Il a été estimé que les forces d&#39;interaction monomères aussi faibles que 50 uM pourrait être suffisante pour entraîner des interactions spontanées à des densités de récepteurs physiologiques 9 ce qui rend la détection de nouvelles interactions extrêmement difficiles 2,10. La méthode décrite ici AVEXIS fournit une méthode sensible pour détecter transitoire protéine extracellulaire: les interactions entre protéines qui peuvent être mises en œuvre d&#39;une manière évolutive avec un faible taux de faux positifs. Alors que d&#39;autres méthodes évolutives ont été développés pour détecter les interactions extracellulaires 11-15,un avantage de AVEXIS est que les paramètres expérimentaux tels que l&#39;appât et les activités de proies ont été quantifiés pour détecter même les plus faibles des interactions (t 1/2 ≤ 0,1 s) tout en conservant un faible taux de faux positifs 3. En outre, les procédures simplifiées et robuste de préparation des échantillons ont permis ce test à mettre en œuvre à une échelle beaucoup plus grande que d&#39;autres essais et nous avons récemment décrit un écran interaction systématique totalisant plus de ~ 16.500 interactions potentielles 16. Le dosage peut être effectué sur toute protéine pour laquelle il est possible d&#39;exprimer un fragment de protéine recombinante soluble. Cela comprend donc protéines qui contiennent un peptide signal N-terminale telle que le type I, GPI-liés et des protéines sécrétées. Nous avons récemment conçu une suite de vecteurs qui permettent aujourd&#39;hui d&#39;exprimer les protéines de type II comme appâts 17. Le test n&#39;est généralement pas adapté pour des protéines membranaires multipasses comme transporteur ioniques ou des pompes, car ils ont peu de chances d&#39;être correctement pliée en dehors du contexte d&#39;une membrane plasmique. Nous avons appliqué cette méthode à une variété de systèmes différents et ont exprimé avec succès des protéines extracellulaires de poisson-zèbre 3,16,18, humain, souris et P. falciparum pour les écrans d&#39;interaction. En ce qui concerne les ressources nécessaires pour mettre en place un écran AVEXIS, nous avons constaté que un goulot d&#39;étranglement important est la sélection, la construction, et le séquençage complet des plasmides d&#39;expression. Cet aspect de la méthode peut prendre jusqu&#39;à un an pour faire ~ 100 appâts et les constructions proies, mais, avec la baisse du coût de la synthèse de gènes, nous avons maintenant favoriser le commerce sous-traitance cet aspect du projet. Le système d&#39;expression mammifère avec un grand secouant incubateur de culture tissulaire (nous utilisons un INFORS HT Multitron Cell) permet à un seul chercheur à exprimer et à normaliser jusqu&#39;à ~ 100 protéines appâts et proies d&#39;un mois. Une fois que les protéines sont produites et normalisées, screening d&#39;interactions est rapide avec un maximum à douze plaques à 96 puits étant commodément traitées par jour. Le seul équipement sur mesure que nous avons mis au point pour faciliter la production d&#39;un tel grand nombre de protéines est un air comprimé à pistons entraînés qui est utilisé pour transmettre un maximum de cinq surnageants à travers un filtre 0.22μm en parallèle. La classe principale des interactions qui pourraient être manquées par rapport aux interactions attendues de la littérature (faux négatifs) sont des interactions homophiles, même si certaines de ces interactions peuvent être détectés 3. Dans les cas où les interactions attendues ne sont pas détectées, nous croyons que cela est dû à la formation des interactions homophiles par les protéines des proies (une proie &quot;masquage&quot; effet) ce qui l&#39;empêche de nouvelles interactions avec des protéines appâts immobilisés. La fréquence à laquelle les interactions sont détectées dépend du contenu de la bibliothèque protéine étant projeté. Comme un guide pour le lecteur, un écran de&gt; 30, 000 interactions au sein de la superfamille des immunoglobulines poisson zèbre abouti à 188 résultats positifs - une fréquence de 0,6% 3,16,18. Un chèque très rapide qui peut être effectuée pour vérifier les résultats positifs est de déterminer si l&#39;interaction peut être détecté dans les deux appât-proie orientations; qui est, peut être la même interaction détectée indépendamment du fait que les protéines de liaison sont présents sous forme soit d&#39;un appât ou une proie. Chaque fois que nous avons observé ce comportement alternatif, la liaison a ensuite été montré pour être précis, en démontrant la liaison directe saturable de protéines purifiées en utilisant résonance plasmonique de surface. Il convient de souligner que, parce que nous augmentons avidité de liaison par les protéines artificiellement pentamerising proies, nous ne considérons pas le dosage approprié pour comparer quantitativement les forces d&#39;interaction. Pour obtenir biophysiques paramètres de liaison d&#39;interactions que nous utilisons protéines monomériques et résonance plasmonique de surface. Enfin, une fois une interaction a été identifiée, le salutnature débit gh de l&#39;essai, il est relativement facile d&#39;adapter le dosage à l&#39;écran pour les réactifs tels que des anticorps ou des petites molécules qui bloquent l&#39;interaction.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Cat. Nombre </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Freestyle médias </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocéfine </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> Des plaques de microtitrage SA-revêtues </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 anticorps </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Un tube de dialyse </td><td> Percer </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxine B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotine </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Substrat-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 concentrateurs centrifuges </td><td> Sartorius </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> Des filtres de 0,22 um </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidity-based extracellular interaction screening (avexis) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions

Protéine extracellulaire: les interactions entre protéines sécrétées ou de la membrane entre-captifs protéines sont essentielles à la fois pour la cohésion initier la communication intercellulaire et d&#39;assurer au sein d&#39;organismes multicellulaires. Protéines prédit pour former des interactions extracellulaires sont codées par environ un quart des gènes de l&#39;homme 1, mais en dépit de leur importance et de l&#39;abondance, la majorité de ces protéines ont pas documentée partenaire de liaison. Principalement, cela est dû à leur indocilité biochimique: les protéines membranaires intégrées sont difficiles à solubiliser dans leur conformation native et contiennent structurellement importantes modifications post-traductionnelles. En outre, les affinités d&#39;interaction entre les protéines réceptrices sont souvent caractérisés par les forces d&#39;interaction extrêmement faibles (demi-vie &lt;1 seconde) excluant leur détection avec de nombreux couramment utilisés méthodes à haut débit 2. Ici, nous décrivons un essai, AVEXIS (avidité basée sur EXtracelluLAR Interaction écran) qui permet de surmonter ces défis techniques permettant la détection des interactions protéine-protéine très faibles (t 1/2 ≤ 0,1 sec) avec un faible taux de faux positifs 3. Le dosage est généralement mis en œuvre dans un format à haut débit afin de permettre le dépistage systématique de plusieurs milliers d&#39;interactions dans un format microplaque pratique (Fig. 1). Elle s&#39;appuie sur la production de protéines recombinantes solubles bibliothèques qui contiennent des fragments ectodomaine de récepteurs de surface cellulaire ou des protéines sécrétées dans lequel pour dépister les interactions et, par conséquent, cette approche est appropriée pour le type I, type II, liées au GPI récepteurs de surface cellulaire et sécrétées protéines, mais pas pour des protéines membranaires multipasses tels que les canaux ioniques ou des transporteurs. Les bibliothèques de protéines recombinantes sont produites en utilisant un système d&#39;expression pratique et de haut niveau chez les mammifères 4, pour s&#39;assurer que les modifications post-traductionnelles importantes telles que glycosylation et obligations disulfure sont ajoutés. Exprimées protéines recombinantes sont sécrétées dans le milieu et produit sous deux formes: un appât biotinylé qui peut être capturée sur une phase solide revêtue de streptavidine appropriée pour le dépistage, et une enzyme-étiqueté pentamerised (β-lactamase) proie. Le protéines appâts et proies sont présentés les uns aux autres dans un mode binaire pour détecter les interactions directes entre eux, semblables à un ELISA classique (Fig. 1). Le pentamerisation des protéines dans la proie est assurée par une séquence peptidique de la protéine de la matrice du cartilage oligomérique (COMP) et augmente la concentration locale des ectodomaines fournissant ainsi des gains significatifs avidité pour permettre des interactions, même très transitoires pour être détecté. En normalisant les activités de l &#39;appât et en proie à des niveaux prédéterminés avant le dépistage, nous avons montré que les interactions ayant monomères demi-vies de 0,1 sec peuvent être détectés avec de faibles taux de faux positifs 3.

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Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS est un dosage à haut débit de protéines d&#39;interaction mis au point pour l&#39;écran systématiquement pour de nouveaux extracellulaires récepteur-ligand paires impliquées dans les processus de reconnaissance cellulaire. Il est spécialement conçu pour détecter les interactions entre protéines transitoires qui sont difficiles à identifier à l&#39;aide d&#39;autres approches à haut débit.

L&#39;avidité d&#39;un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

avidity-based-extracellular-interaction-screening-avexis-for-scalable

Research

JoVE Journal

Biology

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

21.4K vues.  Wellcome Trust Sanger Institute. AVEXIS est un dosage à haut débit de protéines d'interaction mis au point pour l'écran systématiquement pour de nouveaux extracellulaires récepteur-ligand paires impliquées dans les processus de reconnaissance cellulaire. Il est spécialement conçu pour détecter les interactions entre protéines transitoires qui sont difficiles à identifier à l'aide d'autres approches à haut débit.