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	<li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li><li>Bushell, K. 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著者らは、開示することは何もありません。

生きている細胞はin vivoで観察された場合、その細胞膜は非常に動的な挙動を示す：彼らが連絡して、彼らの隣人2と通信する際の拡張と後退膜プロセス。これらの接点の多くを仲介する細胞膜に埋め込まれた受容体タンパク質間の物理的相互作用は、この非常に運動性の動作を許可するように非常に弱いように進化してきました。それは50μMとして弱いように単量体の相互作用の強さは非常に2,10に挑戦する新たな相互作用を検出できます生理的受容体密度が9で自発的な相互作用を駆動するのに十分であることと推定されている。低い偽陽性率でスケーラブルな方法で実装することができるタンパク質の相互作用：ここで説明しAVEXISメソッドは一時的な細胞外タンパク質を検出する感度の高い方法を提供します。他のスケーラブルな方法は、11月15日細胞の相互作用を検出するために開発されているが、AVEXISの一つの利点は、そのような餌と捕食活動などの実験パラメータが低い偽陽性率3を維持しながらも（T 1/2≤0.1秒）の相互作用の弱いを検出するために定量化されていることです。さらに、合理化された堅牢な試料調製手順は、他のアッセイよりもはるかに大規模に実装するために、このアッセイを有効にしていると我々は最近〜16500潜在的な相互作用16歳以上の合計体系的相互作用の画面を説明してきました。 アッセイは、可溶性の組換えタンパク質断片を発現させることが可能となっている任意のタンパク質を実行することができます。したがって、これはそのようなI型、GPI-結合及び分泌タンパク質のN末端シグナルペプチドを含むタンパク質が含まれています。我々は最近、今私たちが餌17とタイプIIのタンパク質を発現することができますベクトルのスイートを設計しました。アッセイは、一般的に、イオントランスポーターとして、マルチパスの膜タンパク質には適していませんsまたはポンプが正常に細胞膜のコンテキストの外側で折られることはほとんどありませんので。我々は、異なる様々なシステムにこれを適用していると正常ゼブラフィッシュ3,16,18、ヒト、マウス、およびPから細胞外タンパク質を表明している対話画面での熱帯熱マラリア 。 AVEXIS画面を設定するために必要なリソースの面で、我々は重大なボトルネックが選定、建設、発現プラスミドの完全なシーケンスであることを見出した。メソッドのこの側面は、〜100餌と獲物の構造を作るために年に取ることができますが、遺伝子合成の減少コストで、我々は現在、市販プロジェクトのこの側面をアウトソーシング好む。大揺れ組織培養インキュベーター（我々はINFORS HT Multitronセルを使用してください）​​と一緒に哺乳動物発現系は発現し、約100餌と獲物タンパク質月までに正規化する単一の研究者を可能にします。タンパク質が生成し、s、正規化されたら、相互作用のためにcreeningする便利な一日あたり処理されている12までの96ウェルプレートで迅速です。我々は、タンパク質のような大規模な数の生産を容易にするために開発されていることを唯一のオーダーメイドの装置が並列に0.22μmフィルターを通して5上清に渡すために使用されている圧縮空気駆動型ピストンです。 これらの相互作用のいくつかは3を検出することができますが、文献（偽陰性）から予想される相互作用に比べ見逃されるかもしれない相互作用のメインクラスは、同種の相互作用があります。予想される相互作用が検出されない場合には、私たちは、これがその後固定化した餌のタンパク質との相互作用を防ぐことができ、さらに餌タンパク質による同種の相互作用の形成（獲物 &quot;マスキング&quot;効果）によるものであると信じています。相互作用が検出された周波数は、スクリーニングされている蛋白質ライブラリのコンテンツに依存します。読者へのガイド&gt; 30の画面として、ゼブラフィッシュ免疫グロブリンスーパーファミリー内の000の相互作用は、188陽性の結果- 0.6パーセント3,16,18の周波数。つまり、結合タンパク質のいずれかの餌として存在するかどうかにかかわらず、同じ相互作用を検出することができます。任意の正のヒットを確認するために実行することができます非常に迅速なチェックでは、相互作用は、両方の餌 - 捕食の方向で検出することができるかどうかを判断することですまたは獲物。我々はこの往復動作を観察したときは、バインディングが続いて表面プラズモン共鳴を用いたタンパク質の精製直接飽和結合を示すことにより、特定であることが示されている。それは我々が人工的に餌のタンパク質をpentamerisingによって結合親和性を高めるために、我々は定量的に相互作用強度を比較するための適切なアッセイを考慮していないことを強調する必要があります。相互作用の生物物理学的結合パラメータを取得するために我々は、単量体蛋白質と表面プラズモン共鳴を使用しています。最後に、かつての相互作用が同定された、ハイアッセイのGHスループットの性質は、そのような抗体または相互作用をブロックする小分子などの試薬をスクリーニングするアッセイ法を適応することが比較的容易になります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> 猫。数 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>フリースタイルメディア</td><td>インビトロジェン</td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td>ニトロセフィン</td><td>カルビオケム</td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SAコーティングされたマイクロタイタープレート</td><td>ヌンク</td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68抗体</td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>ピアース</td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td>ポリミキシンB </td><td>シグマ</td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-ビオチン</td><td>シグマ</td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td>基板-104 </td><td>シグマ</td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20遠心コンセントレータ</td><td>縫工筋</td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μmのフィルター</td><td>ナルゲン</td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidity-based extracellular interaction screening (avexis) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions

細胞外タンパク質の分泌や膜繋留タンパク質間のタンパク質相互作用は、細胞間の通信を開始し、多細胞生物の中で凝集を確保するため、両方のために重要である。細胞の相互作用を形成すると予測タンパク質はヒトの遺伝子1の約4分の1でエンコードされていませんが、その重要性と豊かさにもかかわらず、これらのタンパク質の大部分は結合パートナーをまとめました。主に、これは彼らの生化学的な難しによるものです。膜に埋め込まれたタンパク質は、それらのネイティブなコンフォメーションに可溶化することが困難であり、構造的に重要な翻訳後修飾が含まれています。また、受容体タンパク質との相互作用の親和性は、しばしば多くの一般的に使用される高スループットの方法2でそれらの検出を排除し、極めて低い相互作用の強さ（半減期&lt;1秒）によって特徴付けられる。 ここでは、アッセイ、AVEXIS（親和性ベースの細胞外を記述する低い偽陽性率は3で、非常に弱いタンパク質相互作用の検出（T 1/2≤0.1秒）を有効にするこれらの技術課題を克服LARインタラクション画面）。アッセイは、通常、便利なマイクロタイタープレートフォーマットの相互作用（図1）の何千の体系的なスクリーニングを有効にするには、ハイスループット形式で実装されています。それは相互作用をスクリーニングするためにその中に細胞表面の受容体または分泌タンパク質の細胞外ドメインのフラグメントを含む可溶性組換えタンパク質ライブラリーの生産に依存しているため、このアプローチでは、タイプに適しているI、II型、GPIアンカー型細胞表面受容体と分泌このようなイオンチャネルやトランスポーターとして、マルチパスの膜タンパク質のタンパク質ではなく。 組換えタンパク質のライブラリは、そのようなglycosylaなどの重要な翻訳後修飾を確保するために、便利な高レベルの哺乳類発現系4を使用して生成されまするとジスルフィド結合が追加されます。発現した組換えタンパク質が培地中に分泌され、二つの形式で生成されます。スクリーニングに適したストレプトアビジンでコーティングされた固相上に捕捉し、pentamerised酵素タグを付けることができ、ビオチン化餌（β-ラクタマーゼ）餌食。餌と獲物タンパク質は、従来のELISA（図1）に似て、それらの間の直接的な相互作用を検出するためにバイナリ形式でお互いに提示されます。捕食中のタンパク質のpentamerisationは軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）からペプチド配列によって達成し、それにより検出されるにも非常に一時的な相互作用を有効にするには、重要な親和性の向上を提供する外部ドメインの局所濃度を増加させています。餌とスクリーニングの前に所定のレベルに獲物の両方の活動を正規化することによって、我々は0.1秒の単量体の半減期を持つ相互作用が低い偽陽性率3で ​​検出できることが示されている。

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Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXISは、細胞認識のプロセスに関与する新規細胞外受容体 - リガンドペアの体系的に画面に開発した高スループット·タンパク質相互作用アッセイである。これは特に、他の高スループットアプローチを用いて識別することが困難である一時的なタンパク質相互作用を検出するように設計されています。

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

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Biology

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

21.4K ビュー.  Wellcome Trust Sanger Institute. AVEXISは、細胞認識のプロセスに関与する新規細胞外受容体 - リガンドペアの体系的に画面に開発した高スループット·タンパク質相互作用アッセイである。これは特に、他の高スループットアプローチを用いて識別することが困難である一時的なタンパク質相互作用を検出するように設計されています。