Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione del NIH CA113734 assegnato a F Yull e il Department of Veterans Affairs (TS Blackwell).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Animal Care Vanderbilt University e del Comitato Istituzionale uso. 1. Preparazione di topi transgenici <ol><li> Topi femmina, positivo per la (N F-kB-G FP-L uciferase) giornalista transgene NGL (descritto in precedenza 1) vengono utilizzati per questa procedura. Quando le femmine sono almeno 6 settimane di età, li accoppiarsi con un maschio FVB tipo selvatico. Harem di allevamento possono essere utilizzati (fino a 4 femmine in una gabbia con 1 maschio). (Nota: topi FVB ceppo sono stati utilizzati per lo studio attuale topi ceppo scuri come C57Bl6 possono anche essere utilizzati, ma questi topi deve essere rasata prima imaging.). </li><li> A partire da 15 giorni dopo l&#39;accoppiamento, le femmine controllare regolarmente per i segni di gravidanza (grande circonferenza sporgente). Ogni femmina deve essere separato una volta in stato di gravidanza e il maschio tolto dalla gabbia di allevamento una volta che l&#39;ultima femmina rimane incinta. </li><li> Guarda le femmine separate di und notare la data di nascita, quando una cucciolata compare. Un disordine di almeno 6 cuccioli è necessario per l&#39;allattamento adeguato. Otto giorni dopo la nascita della cucciolata, procedere con il protocollo (vedere la Figura 1 per uno schema temporale). </li></ol> 2. Preparazione per iniezione <ol><li> Sciogliere la E. coli LPS in PBS ad una concentrazione finale di 0,1 mg / mL. 50 pl di questa soluzione, o un totale di 5 pg, verrà iniettato nella ghiandola mammaria. Preparare un secondo tubo di PBS solo da utilizzare per il controllo dell&#39;iniezione. </li><li> Set-up di un ambito dissezione e apparecchiature per l&#39;anestesia isoflurano. Un naso-cono apparecchio deve essere fissato alla fase della portata dissezione cui il mouse viene posizionato. Una sorgente di luce buona, se dallo stesso campo di applicazione o da faretti supplementari dovrebbe anche essere preparato. </li><li> Una volta che il set-up, avviare la macchina isoflurano e il flusso d&#39;aria. </li></ol> 3. Iniezione intraduttale di LPS <ol><li> Caricare la siringa corta dell&#39;ago con 50 microlitri della soluzione di LPS. Impostare questa parte. </li><li> Anestetizzare il mouse per essere iniettato in primo luogo mettendo la femmina in una scatola piena di isoflurano e poi una volta che la respirazione è rallentata, il suo muoversi sul palco e mettere il naso all&#39;interno del naso-cono. Utilizzare un pizzico punta a confermare il mouse è completamente anestetizzato. Monitorare il respiro del mouse durante tutta la procedura e regolare il livello isoflurano di conseguenza. La gabbia che contiene la cucciolata di cuccioli che la femmina è stata presa dal deve essere attentamente da parte fino alla diga può essere restituito dopo la procedura. </li><li> Utilizzare una piccola goccia di etanolo al 70% per rendere il pelo distesi e per aiutare a visualizzare il capezzolo attaccato a destra # 4 ghiandola mammaria inguinale sul basso ventre del mouse. </li><li> Mettere a fuoco la portata dissezione per una visione ottimale del capezzolo. Usare con attenzione una serie di una pinza sottile per disegnare ulteriormente il capezzolo dalla pelle, ma non forare o danneggiare il capezzolo in alcun modo. Ilpinza non deve mai essere fissata solidamente insieme quando la manipolazione del tessuto, ma utilizzato con una presa luce che richiede la minima quantità di stress sul capezzolo. </li><li> Utilizzare la pinza nella mano sinistra per tenere delicatamente il capezzolo in posizione. Portare lentamente la siringa precaricata nel campo visivo con la mano destra. La siringa deve essere mantenuta in modo che nessun riposizionamento deve avvenire in modo da iniettare il contenuto. </li><li> Una volta che la siringa è in vista, mirano attentamente la piccola apertura duttale nel centro del capezzolo, e inserire la siringa. </li><li> Senza riposizionare la mano, iniettare il contenuto della siringa e rimuovere l&#39;ago dal capezzolo. </li><li> Caricare una seconda siringa con 50 pl di PBS per il controllo dell&#39;iniezione. Riposizionare il mouse sul palco e per la vista migliore della sinistra # 4 capezzolo inguinale ghiandola mammaria al di là del basso addome del mouse. Ripetere i passaggi 3,4-3,7 con il PBS-caricato siringa. </li><li> Una volta che entrambe le iniezioni sono complete, interrompere l&#39;anestesia e spostare il mouse in una gabbia di recupero. Monitorare la femmina per assicurarsi che lei diventa mobile entro 5 minuti. Permettono il mouse per rimanere nella gabbia di recupero per 1 ora. Dopo 1 ora di recupero, disporre di nuovo la femmina nella gabbia con la sua cucciolata di cuccioli. I topi devono essere controllati periodicamente per 6 ore dopo l&#39;iniezione, prima di procedere con l&#39;imaging. Nella nostra esperienza, senza conseguenze negative sono state rilevate sia nel femminile o dei cuccioli nel periodo compreso tra l&#39;iniezione e di imaging. Tuttavia, se i segni di sofferenza si osservano nella femmina (es. postura ingobbita, mordere o guardia del sito di iniezione, letargia generale) o di cuccioli (nessun movimento, il colore bluastro della pelle), l&#39;esperimento deve essere interrotto. </li></ol> 4. Bioluminescent Imaging Per visualizzare NF-kB Attività <ol><li> Una volta che i topi sono stati trasportati alla struttura di imaging, avviare la procedura di imaging aprendo il software e l&#39;inizializzazione della macchina. Accendere il èmacchina oflurane e flusso d&#39;aria, assicurando che l&#39;anestesia fluisce sia la scatola e la camera di imaging. </li><li> Posizionare il mouse in anestesia isoflurano nella casella anestesia chiaro. Una volta che ha rallentato la respirazione, utilizzare un pizzico punta a confermare il mouse è completamente anestetizzato. Poi, iniettare 100 ml di substrato luciferina nel mouse da retro-orbitale iniezione 5 utilizzando una siringa sterile. </li><li> Trasferire immediatamente il mouse per la camera di imaging e mettere il naso sotto il naso isoflurano cono si trova lì. Il mouse deve essere supino. Fissare ogni piede sul palco con nastro adesivo. </li><li> Ingresso le impostazioni corrette al software IVIS di prendere sia un immagine in bianco luce fotografica e un&#39;immagine dell&#39;attività bioluminescenti. Il tempo di esposizione deve essere di 10 secondi. Acquisire l&#39;immagine. </li><li> Una volta che le immagini sono state acquisite, consentono il mouse per recuperare e quindi inserire la schiena nella gabbia con i suoi cuccioli e monitorare periodicamente. </li><li> La fotografico e luminescenteimmagini vengono automaticamente sovrapposti e visualizzati sullo schermo, come in Figura 2. Analizzare le immagini acquisite ponendo regione di interesse o &quot;ROI&quot; cerchi di grandezza uguale su ciascun lato del basso addome del mouse (uno sopra la ghiandola PBS-iniettata e uno sopra l&#39;LPS-iniettato ghiandola). Impostare la lettura ai fotoni. Un numero deve essere visualizzato indica la luminescenza rilevata all&#39;interno di ogni ROI (vedere la Figura 2B). Utilizzare questo numero nell&#39;analisi statistica. </li><li> Per visualizzare l&#39;immagine ottimale, regolare ulteriormente la soglia del segnale visualizzato. Questo non modificherà la luminescenza totale lettura, ma vi permetterà di rimuovere segnale di fondo e visualizzare le differenze tra il controllo e la LPS-trattati ghiandola. Ridurre la quantità di luminescenza mostrato fino alla ghiandola PBS-iniettato è privo di segnale di fondo. Questo dovrebbe lasciare il segnale aumentato nella ghiandola LPS-trattata ancora visibili nell&#39;immagine, come visto nella Figura 2. </li><li> AdditionaL analisi, comprese proteine ​​e analisi dell&#39;RNA, può essere completato con tessuto mammario raccolti dalla femmina post-mortem 6. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Per ottenere risultati interpretabili da questi metodi, LPS (o PBS) deve essere infuso solo nei dotti mammari, lasciando il tessuto adiacente indisturbati. Iniezione nel tessuto sottocutaneo circonda il capezzolo comporterà infiammazione a causa di un danno più che l&#39;infezione simulata. Iniezione di trypan blu colorante diluito in PBS è utile quando si impara la tecnica. Figura 3A mostra una ghiandola successo iniettato infuso con 100 ml di tripan blu in PBS. Come mostrato, solo l&#39;albero duttale deve essere riempito con la soluzione iniettata, e non dovrebbe essere bolo al sito di iniezione. Un &quot;bolo&quot; in questo contesto è un accumulo di liquido iniettato il capezzolo o nel tessuto che circonda il capezzolo senza infusione nell&#39;albero duttale. Questo è shproprio in Figura 3B. Si noti che le iniezioni pratica illustrate nella Figura 3 sono stati completati in una femmina al giorno 21 di lattazione. Durante l&#39;altezza di lattazione (giorni 8-10, la fase in cui viene iniettato LPS utilizzando il protocollo corrente), il latte è abbondante ed è difficile visualizzare i dotti e determinare se l&#39;iniezione è stata completata correttamente. Pertanto, i punti più tardi di orario di allattamento sono migliori per le iniezioni di pratica. Iniezione di LPS successo nei risultati mammarie condotti in un aumento di NF-kB attività all&#39;interno della ghiandola. Questo dovrebbe essere evidente nel topo giornalista upon IVIS imaging, e la ghiandola LPS-iniettato dovrebbe avere sostanzialmente più alta attività di luciferasi (misurata mediante conteggio di fotoni) rispetto al PBS-iniettato ghiandola, come mostrato nella Figura 2 (in media, la ghiandola LPS legge 200% del segnale di controllo PBS). Un aumento statisticamente significativo di luminescenza nelle ghiandole LPS-trattati come compAred al controllo controlaterale è stato raggiunto con la realizzazione di un gruppo di 4 topi 4. Un ulteriore studio ha inoltre utilizzato intraduttale iniezione mammaria di una E. coli o LPS in NF-kB giornalista transgenici. Simile al nostro lavoro, questi autori ha visto un aumento significativo dell&#39;attività giornalista 6 ore dopo E. coli iniezione 2. Si prega di notare, a causa costitutiva di NF-kB attività del cervello e di altri organi addominali, le teste e addomi dei nostri topi reporter dimostrano costantemente un segnale quando ripreso, anche al basale prima di qualsiasi manipolazione. Così, questo segnale deve essere ignorato per quanto riguarda questo esperimento. Un segnale evidente dovrebbe rimanere entro il LPS-iniettato ghiandola mammaria dopo la lettura dell&#39;immagine viene regolato per ridurre al minimo luminescenza di fondo nella ghiandola PBS. Figura 2 mostra le immagini con lo sfondo ridotto. Iniezione riuscita della ghiandola volontàpiù probabile risultato danni al capezzolo. Questo farà sì rilevato, a livello di infiammazione della pelle che sarà evidente upon imaging. Questo tipo di segnale ferimento sarà molto forte e limitato alla zona del capezzolo dove il danno, non emana tutta la ghiandola, come visto dopo una iniezione di successo LPS nei condotti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di procedura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Figura 2. Risultati rappresentativi IVIS bioluminescente imaging. (A) immagine acquisita con sfondo ridotta, rivelando aumento dell&#39;attività luciferasica nel LPS-iniettato ghiandola. (B) Immagine da A con regione di quantificazioni di interesse aggiunto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3 iniezione pratica:.. Ghiandola mammaria iniettato colorante mediante iniezione intraduttale Per verificare la precisione della consegna attraverso il capezzolo, un topo al giorno 21 di lattazione è stato iniettato con 100 ml di colorante blu tripano diluito in PBS. Seguendo sacrificio, la ghiandola è stato esposto per la visualizzazione. (A) iniezione di successo e (B) bolo di colorante al capezzolo.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui ci avvaliamo di un transgenico NF-kB topo giornalista e una tecnica di iniezione ottimizzata per mastite modello, infiammazione del tessuto mammario più comunemente causata da un&#39;infezione batterica. La fase più critica in questa procedura è la stessa iniezione intraduttale. In pratica, di solito è evidente se l&#39;iniezione intraduttale ha avuto successo. L&#39;iniezione di agenti (LPS o PBS) dovrebbe sentire fluido e ci dovrebbe essere poca o nessuna resistenza come la siringa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Lipopolisaccaride da Escherichia coli (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> sierotipo 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> 31 gauge siringa da insulina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Ago corto </td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione portata </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell isoflurano, USP </td><td> MINRAD INC per Rx Elite </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 sistema di imaging &lt;/ Td&gt; <td> Pinza (ex Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Siringa per iniezione luciferina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-Luciferin Firefly, sale di sodio monoidrato (Substrato Luciferin) </td><td> Biosynth Chimica e Biologia </td><td> L-8240 </td><td> Diluire a 10 mg / ml </td></tr></tbody></table>

intraductal injection of lps as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an nf-&kappa;b reporter transgenic

Modelli animali di malattie umane sono necessarie per studiare rigorosamente fasi della progressione della malattia e meccanismi associati, e infine, come modelli pre-clinici per testare interventi. In questi metodi, si descrive una tecnica in cui il lipopolisaccaride (LPS) è iniettato nel topo ghiandola mammaria in allattamento tramite il beccuccio, efficace modellazione mastite, o infiammazione, della ghiandola. Ciò si traduce in una maggiore infezione simulati fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, come visualizzato attraverso l&#39;imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter luciferasi 1. Il nostro obiettivo finale nello sviluppo di questi metodi era quello di studiare l&#39;infiammazione associata con mastite nella ghiandola in allattamento, che spesso include arrossamento, gonfiore, e infiltrazione di cellule immunitarie 2,3. Pertanto, eravamo consapevoli che incisione o qualsiasi tipo di ferite della pelle, il capezzolo, o la ghiandola per introdurre i LPS possono fermarsinon essere utilizzati nei metodi poiché l&#39;approccio sarebbe probabilmente confondere il read-out di infiammazione. Abbiamo anche voluto uno straight-forward metodo che non ha richiesto appositamente realizzati disegnati a mano pipette o l&#39;uso di micromanipolatori di detenere tali strumenti specializzati in atto. Così, abbiamo deciso di utilizzare una siringa da insulina disponibile in commercio e per iniettare l&#39;agente nel condotto mammaria di un capezzolo intatta. Questo metodo ha avuto successo e ci ha consentito di studiare l&#39;infiammazione associata con iniezione di LPS assenza di effetti addizionali sovrappone il processo di iniezione. Inoltre, questo metodo anche utilizzato un NF-kB reporter di luciferasi di topo transgenico e bioluminescente tecnologia di imaging per mostrare visivamente e quantitativamente maggiore NF-KB di segnalazione all&#39;interno della ghiandola iniettato LPS-4. Questi metodi sono di interesse per i ricercatori di molte discipline che desiderano malattia modello all&#39;interno della ghiandola mammaria durante l&#39;allattamento, in quanto in ultima analisi, la tecnicaqui descritto potrebbe essere utilizzato per l&#39;iniezione di un certo numero di sostanze, e non è limitato a solo LPS.

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Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&amp;kappa;B Reporter Transgenic

Qui descritto è una tecnica in cui viene iniettato lipopolisaccaride nella ghiandola mammaria topo lattazione tramite il beccuccio per simulare mastite, una condizione comunemente causata da infezione batterica. Risultati lipopolisaccaride iniezione in una maggiore fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, visualizzato attraverso l&#39;imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter della luciferasi.

Iniezione intraduttale di LPS come un modello murino di mastite: Segnalazione Visualizzato tramite un NF-kB Reporter transgenico

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

intraductal-injection-lps-as-mouse-model-mastitis-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

19.1K Views.  Vanderbilt University Medical Center. Qui descritto è una tecnica in cui viene iniettato lipopolisaccaride nella ghiandola mammaria topo lattazione tramite il beccuccio per simulare mastite, una condizione comunemente causata da infezione batterica. Risultati lipopolisaccaride iniezione in una maggiore fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, visualizzato attraverso l'imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter della luciferasi.

Video: Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

Topo iniezione parete della vescica

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

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Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Sviluppo di un Rat modello Alfa-sinucleina per la malattia di Parkinson mediante iniezione stereotassica di un ricombinante vettore virale adeno-associato

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Induzione e Micro-CT Imaging delle malformazioni cavernose cerebrali nel modello del topo

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Puntura-indotta di Neovascularization dell'iride come un modello murino di Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Iniezione di acido oleico in maiali come modello per la sindrome da Distress respiratorio

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di TNBS del dotto biliare

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...