Questo lavoro è stato sostenuto dalla Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. LAM è stata sostenuta dalla segnalazione e Cellular regolamento National Institute of Health di formazione di sovvenzione (T32 GM008759) e il NIH Ruth L. Kirschstein Pre-Doctoral Fellow (CA165349-01). Vorremmo ringraziare il Prof. Michael Stowell (CU Boulder), il Prof. Douglas Rees e del Prof. Rob Phillips (Caltech) per i loro preziosi commenti.

1. Preparazione liposomica <ol><li> Recuperare un flaconcino da 20 ml in vetro con una rivestita di teflon cap. </li><li> Pulire la vetreria e le siringhe con cloroformio prima dell&#39;uso per evitare contaminazioni. </li><li> Trasferire 100 ul di cloroformio distillata al flacone di vetro con un 250 microlitri a tenuta d&#39;aria siringa di vetro. </li><li> Aggiungere 30 microlitri di metanolo distillata al flacone stesso bicchiere con un 100 pl a tenuta d&#39;aria siringa di vetro. </li><li> Per preparare un mM 2 7:1.5:1.5 fosfatidilcolina (POPC): fosfatidiletanolammina (PAPA): soluzione di lipide colesterolo, trasferire 216 microlitri di 10 mg / mL POPC, 42 pl di 10 L mg / mL PAPA e 20 di 11 mg / mL Le soluzioni di colesterolo nel CHCl 3 al flaconcino 20 ml di vetro. </li><li> Evaporare i solventi organici utilizzando lento flusso di argon o azoto gassoso fino ad una pellicola sottile di lipidi si osserva sul fondo della fiala. </li><li> Porre la fiala di vetro non livellata in un essiccatore sotto vuoto per almeno 30 minuti per rimuovere il solvente residuo. </li><li> Transfer 2 mL di tampone, precedentemente passati attraverso un filtro da 0,2 micron, per la fiala di vetro per idratare i lipidi. </li><li> Incubare la miscela a 4 ° C per una notte e utilizzare entro 48 ore. </li></ol> 2. Freeze-and-disgelo: Per i formati liposomi di 30 - 100 nm solo <ol><li> Congelare sospensione liposomica in azoto liquido per 15 secondi. </li><li> Scongelare sospensione liposomica utilizzando un blocco di riscaldamento a 42 ° C di temperatura per ~ 3 minuti. </li><li> Ripetere le fasi 2.1 e 2,2 per un totale di 5 cicli. </li></ol> 3. Estrusione Seguire le istruzioni Avestin per assemblare correttamente il Liposofast LF-50 estrusore, utilizzando lo schema dello strumento nel loro libro guida. <ol><li> Posizionare il grande schermo di supporto foro (con fori circolari) nella base di supporto del filtro, seguita dal piatto circolare sinterizzato (senza fori), un disco di scarico (25 mm di diametro), e una membrana di policarbonato (25 mm di diametro). </li><li> Posizionare il piccolo, neroO-ring sulla parte superiore della membrana per fissarlo alla base di supporto del filtro. </li><li> Fissare l&#39;estrusore top filtro serrando 4 viti nei 4 fori corrispondenti. </li><li> Montare l&#39;unità di filtro estrusore a sotto la canna dell&#39;estrusore grande. Aggiungere la soluzione liposoma alla canna del cilindro. Posizionare il seguente superiore del cilindro di estrusione per: grande circolare O-ring, cap stretto, circolare grande O-ring, cap circolare. </li><li> Collegare il regolatore del gas verso l&#39;alto cilindro estrusore e chiudere tutte le valvole per evitare perdite d&#39;aria, compresa la valvola limitatrice della pressione. Posizionare un flacone di vetro da 20 ml o 50 ml beuta sotto il gruppo estrusore filtro. Una valvola di sicurezza è collegato al regolatore e rilascerà se la pressione supera 600 psi. Accendere il gas azoto e aprire la valvola di gas collegata al estrusore. </li><li> Aumentare la pressione di azoto a 25 psi per liposomi 400 nm, 125 psi per liposomi 100 nm e 400-500 psi per 30 nm liposomi. </li><li> Guarda il susp liposomaensione come viene espulso nel contenitore durante essendo spinto da azoto. Tenere sotto corrente d&#39;azoto fino a quando non osservanza di una qualsiasi liquido che passa attraverso il filtro estrusore nel flaconcino di vetro. </li></ol> 4. Dynamic Light Scattering (DLS) Analisi <ol><li> Preparare 50 pl di una soluzione di 20 pM liposomi. </li><li> Accendere la sorgente di alimentazione e la fonte della lampada. </li><li> Aprire il software DYNAPRO. </li><li> Impostare il software per MS / X modello di algoritmo per individuare liposomi di 30 nm e 100 nm e MS800 modello di algoritmo per rilevare&gt; 100 nm liposomi. </li><li> Collegare l&#39;hardware. </li><li> Dispensare 14 l di campione liposoma in cuvetta di quarzo e inserto nel supporto cella. </li><li> Premere start. </li><li> Premere stop dopo ~ 20 - 30 acquisizioni. </li><li> Analizzare i picchi di diametro medio liposomi registrati sul istogramma. </li></ol> 5. Nanoparticelle Analisi Tracking (NTA) <ol><li> Preparare una 500 uL, 0,1 pM liposomasoluzione. </li><li> Sciacquare il vano campione con acqua ed etanolo. </li><li> Asciugare il vano campione con un panno privo di tovagliolo di carta. </li><li> Accendere la sorgente di potenza del laser e il computer. </li><li> Fornire 300 pl di soluzione 0,1 pM liposoma di compartimento campione. </li><li> Aprire il controllo della temperatura e del software di monitoraggio delle nanoparticelle Analysis. </li><li> Cattura Premere tasto per accendere il laser. </li><li> Utilizzare le regolazioni orizzontali e verticali per spostare il palco e regolare la messa a fuoco microscopio. </li><li> Impostare la temperatura desiderata (20 ° C) e tempo di registrazione (almeno 30 secondi). </li><li> Premere il pulsante Record per prendere cornici multiple delle particelle liposomi per un periodo di tempo specificato. Analizzare i picchi corrispondenti alle dimensioni del diametro liposomi sull&#39;istogramma in quanto segue il movimento di ogni particella. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Uno schema che illustra il metodo di estrusione è prisentiva in Figura 1. Per ottenere risultati ottimali, preparazione di liposomi con diametro di 30 nm richiede una pressione elevata di circa 500 psi e diametri di 100 nm richiede una pressione di 125 psi per ottenere un tasso rapido filtro. Per diametri di 400 nm, una bassa pressione di circa 25 psi viene raccomandato per ottenere un tasso più lento filtro, che permette di allungare le vescicole grandi, e formare liposomi omogenee. Abbiamo condotto una serie di esperimenti per determinare la pressione ottimale per la produzione di consistenti dimensioni sub-micron vescicole. Abbiamo variato la pressione così come il numero di estrusione passa attraverso filtri di policarbonato con dimensioni dei pori di 30, 100 e 400 nm e scoperto pressione appropriata per ciascuna dimensione desiderata. Per pori 30 nm, pressione inferiore a 500 psi ridurrà la portata, causando allungamento e quindi le dimensioni delle vescicole grandi. Per i pori 100 nm, un flusso costante è stato raggiunto a 125 psi. Per pori 400 nm, a bassa pressione (25 psi) permette di allungare le vescicole in s vescicola maggioreizes. A goccia a goccia lenta filtraggio del flusso è ottimale per creare più sub-micron vescicole 13. Abbiamo eseguito DLS per determinare le dimensioni del liposoma estrusi attraverso tre diametri differenti, cioè 30, 100 e 400 nm. DLS è un metodo consolidato che raccoglie la luce diffusa per determinare il diametro particellare. Noi liposomi estrusi idrati di 2 mM attraverso una membrana di policarbonato 30 nm a 500 psi con 5 passa attraverso i pori del filtro, una membrana di 100 nm a 125 psi policarbonato con 5 passa attraverso il poro filtro 400 nm e una membrana di policarbonato a 25 psi con 2 passa attraverso il poro filtro. I diametri dei liposomi e misurato da DLS per 30, 100 e 400 nm pori erano 66 ± 28, 138 ± 18 e 360 ± 25 nm (Figura 2). Una sospensione di perline di polistirene da 50 nm è stato usato come standard di calibrazione, come illustrato nella figura 2, dove è registrato un diametro di 47 ± 16 nm. La percentuale polydispersity dimostra che non vi sia sovrapposizione all&#39;interno dimensioni liposomi. È tipico osservare diametri superiori a 30 nm usando analisi DLS a causa della distorsione noto questo strumento ha verso particelle più grandi 12. Intensità di dispersione della luce da particelle grandi e piccole sono raccolti contemporaneamente da un metodo di rilevazione e quindi più difficili da risolvere i liposomi in sospensione 12. Nonostante questa limitazione strumentale, la curva di calibrazione descrive una correlazione lineare vicino. NTA è una nuova tecnologia che misura la dimensione di ogni particella da osservazioni dirette di diffusione in un mezzo liquido, indipendentemente indice di rifrazione o la densità delle particelle. Questa tecnica ad alta risoluzione può essere utilizzato per integrare la misurazione di liposomi con DLS. La NTA ha registrato diametro di 95 ± 48 e 356 ± 51 nm, due 100 nm e 400 nm soluzioni di polistirene sono stati utilizzati per la calibrazione. Soluzioni lipidiche di 30 nm e 100 nm sono state osservate avere un comp più<html> diametro coltivabile rispetto alle DLS come illustrato nella figura 3, producendo dimensioni medie di 29 ± 14, 95 ± 17 e 359 ± 73 nm. Il NTA può essere una tecnica di caratterizzazione più generale di quantificare particelle microscopiche dalla sua sensibilità permette di misurare particelle di 50 a 1000 nm. La curva di calibrazione mostra una correlazione lineare tra i pori della membrana di policarbonato rispetto al diametro registrata NTA. <table border="1"><tbody><tr><td> Misure liposomi </td><td> Soglia di rilevamento </td><td> Prevista particelle dimensione minima (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Parametri NanoSight. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagramma di flusso del metodo di estrusione, che descrive come la pressione e flusso di azoto controlla l&#39;omogeneità di differenti diametri liposomi. A seguito di idratazione liposomi, vescicole unilamellari di diverse dimensioni vengono estrusi attraverso i pori della membrana diverse filtro in policarbonato a pressioni diverse. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Figura 2. Dinamici Light Scattering (DLS) dati che descrivono le dimensioni seguenti quantitativi di liposoma estrusione. (A) grafici a barre sono mostrati per descrivere i diametri dei tre campioni liposomi. Uno standard di calibrazione 50 nm polistirene (PS) perline è stato usato come riferimento. I diametri medi liposomi sono indicate sopra la barra per ciascun campione. L&#39;asse x descrive le dimensioni dei pori che le soluzioni sono state estruse attraverso. L&#39;asse y indica lo spessore registrato da DLS. Sebbene i 30 nm e 100 nm registrare formatied valori superiori a loro dimensioni dei pori, mentre maggiore è la dimensione 400 nm registrata una dimensione leggermente inferiore, la curva di taratura (b) mostra una correlazione quasi lineare, dove l&#39;asse x esprime le dimensioni dei pori della membrana di policarbonato, e l&#39;asse y descrive registrata diametro liposoma da DLS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Figura 3. Nanoparticelle tracciamento Analysis (NTA), dati che descrivono le dimensioni dei liposomi seguenti estrusione. (A) I grafici a barre rappresentano il diametro di ciascun campione liposoma. L&#39;asse x descrive le dimensioni dei pori che le soluzioni sono state estruse attraverso. L&#39;asse y indica lo spessore dimensione registrato dal NTA. I diametri medi liposomi sono classificati come sopra ogni campione. (B) La curva di taratura NTA mostra una correlazione più lineare rispetto alla curva di taratura DLS tra i filtri di dimensioni dei pori della membrana rispetto al diametro registrato. L&#39;asse x descrive le dimensioni dei pori della membrana di policarbonato. L&#39;asse y indica lo spessore registrato liposoma da NTA. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Figura 4. Negativi macchia microscopia elettronica di trasmissione (TEM) risultati immagini ogni dimensione liposoma (500 pM) seguita da estrusione. Carbonio Formvar griglie maglia sono stati scaricati negativamente prima della colorazione del campione, dove acetato di uranile 1% in acqua è stato utilizzato per colorare i campioni prima dell&#39;essiccazione e immagini a 34.000 ingrandimento ×. Formati 30, 100 e 400 nm sono chiaramente distinti l&#39;uno dall&#39;altro. L&#39;ingrandimento è stato fissato a 25.000 ×. La barra della scala rappresenta il 0,5 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Figura 5. Una volta portate esperimento è stato condotto con tre dimensioni liposomi. Dynamic Light Scattering (DLS) è stata misurata per ogni soluzione di liposomi di estrusione immediatamente successivo. Tutte le soluzioni di liposomi sono stati conservati a 4 °C per una notte. I loro diametri sono state registrate dai DLS dopo una notte di incubazione. Poca o nessuna modifica è stata osservata dopo 16 ore di incubazione.

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Utilizzando il Avestin Liposofast LF-50 Estrusore, abbiamo dimostrato come piccole dimensioni, liposomi sintetici vengono preparati attraverso una pressione sistema controllato. È importante notare che formano vescicole multilamellari spontaneamente dopo idratazione liposoma, che può portare alla produzione di nanoparticelle più piccole. Queste piccole vescicole multilamellari inevitabilmente fluire attraverso maggiore è la dimensione dei pori di membrana di policarbonato, causando eterogeneità in soluzioni di vesc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> 95% stabilizzatori </td></tr><tr><td> Alta metanolo Grade </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 Estrusore </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipidi </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Policarbonato pori </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td> 25 mm di diametro </td></tr><tr><td> Scolare i dischi PE </td><td> Avestin, Inc. </td><td> 230600 </td><td> 25 mm di diametro </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

I liposomi sono vescicole preparati artificialmente costituiti da fosfolipidi naturali e sintetici che sono ampiamente utilizzati come una membrana cellulare che imita piattaforma per studiare proteina-proteina e proteina-lipide interazioni 3, drug delivery monitoraggio 4,5, e 4 incapsulamento. I fosfolipidi creano naturalmente doppi strati lipidici curvi, distinguendosi da una micella. 6 I liposomi sono tradizionalmente classificate per dimensione e numero di bistrati, cioè vescicole grandi unilamellari (Luvs), piccole vescicole unilamellari (SUV) e vescicole multilamellari (MLV) 7. In particolare, la preparazione di liposomi omogenee di varie dimensioni è importante per lo studio curvatura membrana che svolge un ruolo essenziale nella segnalazione cellulare, endo-e esocitosi, fusione della membrana, e il traffico proteina 8. Diversi gruppi analizzare come le proteine ​​vengono utilizzati per modulare i processi che coinvolgono curvatura della membrana e quindi preparare liposomi di diametro &lt;100 - 400nm a studiare il loro comportamento su funzioni cellulari 3. Altri si concentrano sulla liposomi-incapsulamento della droga, studiando liposomi come veicoli per trasporto e la distribuzione di un farmaco di interesse 9. Incapsulamento farmaco può essere ottenuto come riportato durante la formazione dei liposomi 9. Il nostro passo di estrusione non dovrebbe pregiudicare il farmaco incapsulato per due motivi, vale a dire (1) incapsulamento farmaco deve essere raggiunto prima di questo passo e (2) liposomi dovrebbero conservare la loro stabilità naturale biofisico, reggere saldamente il farmaco nel nucleo acquoso. Questi obiettivi ulteriori ricerche indicano la necessità di un metodo ottimizzato per progettare stabili sub-micron vescicole lipidiche. Tuttavia, le attuali tecnologie preparazione liposomica sonicazione (10, congelamento-scongelamento e-10, sedimentazione) non consentono la preparazione di liposomi con superficie altamente curva (ossia diametro &lt;100 nm) con efficienza elevata consistenza e 10,5, che limita la biofisico studi di un emergicampo di rilevamento ng curvatura membrana. Qui, presentiamo un metodo efficace per una varietà di preparazione di liposomi biologicamente rilevanti. Estrusione manuale con siringhe a tenuta di gas e membrane in policarbonato 10,5 è una pratica comune, ma l&#39;eterogeneità si osserva spesso quando si usa dimensioni dei pori &lt;100 nm a causa a causa della variabilità della pressione manuale applicata. Abbiamo impiegato una pressione costante controllata apparato di estrusione per preparare liposomi sintetici cui diametri compresi tra 30 e 400 nm. Light scattering dinamico (DLS) 10, microscopia elettronica 11 e tracciamento analisi delle nanoparticelle (NTA) 12 sono stati usati per quantificare le dimensioni del liposoma come descritto nel nostro protocollo, con polistirene commerciale (PS) perle utilizzate come standard di calibrazione. Una correlazione quasi lineare è stata osservata tra le dimensioni dei pori e dei lavoratori liposomi determinati sperimentalmente, che indica l&#39;alta fedeltà della nostra pressione controllata preparazione liposomiale incontratoHod. Inoltre, abbiamo dimostrato che questo vescicola metodo di preparazione lipidica è generalmente applicabile, indipendente di varie dimensioni liposomi. Infine, abbiamo anche dimostrato in uno studio corso di tempo che questi liposomi preparati sono rimasti stabili per un massimo di 16 ore. Un rappresentante di dimensioni nano protocollo di preparazione liposomiale è illustrato di seguito.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Questo protocollo descrive un metodo di estrusione per la preparazione di vescicole lipidiche di sub-micron dimensioni con un alto grado di omogeneità. Questo metodo utilizza un sistema a pressione controllata con velocità controllate flusso di azoto per la preparazione di liposomi. La preparazione lipidica<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Estrusione liposoma, e caratterizzazione formato saranno qui presentata.

Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K Views.  University of Colorado Boulder. Questo protocollo descrive un metodo di estrusione per la preparazione di vescicole lipidiche di sub-micron dimensioni con un alto grado di omogeneità. Questo metodo utilizza un sistema a pressione controllata con velocità controllate flusso di azoto per la preparazione di liposomi. La preparazione lipidica 1,2, Estrusione liposoma, e caratterizzazione formato saranno qui presentata.

Video: Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ricerca

Bioingegneria

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un metodo migliore per la preparazione di tipo I collagene della pelle

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

Film di Estrusione<em&gt; Abyssinica Crambe</em&gt; / Glutine di frumento Miscele

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Valutazione della stabilità di conservazione delle vescicole extracellulari

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...