La costruzione di membrane lipidiche a doppio strato descritte in questo protocollo può essere utilizzata per ottenere informazioni cruciali sulle interazioni della membrana con agenti farmaceutici, tossici ambientali e persino composti biologici. Queste tecniche possono essere utilizzate per fabbricare membrane di varia complessità liquida e per valutare la permeabilità, l'assorbimento e l'incorporazione dei composti all'interno delle membrane. Per iniziare, aggiungere il volume appropriato di soluzione madre lipidica in un vile di vetro pulito per ottenere una concentrazione finale di vescicola di 2,5 milligrammi per millilitro dopo la reidratazione.
Rimuovere il cloroformio dalla soluzione lipidica, utilizzando un flusso di azoto gassoso. Per garantire la completa rimozione del cloroformio, collegare il film lipidico essiccato al vuoto per almeno quattro ore. Reidratare il film lipidico essiccato con un volume richiesto di tampone di cloruro di sodio Tris per ottenere la concentrazione finale di vescicola di 2,5 milligrammi per millilitro e vortice per circa 15-30 secondi.
Trasferire la sospensione della vescicola in un contenitore con ghiaccio secco fino a quando non viene congelata per circa 30 minuti. Dopo che il campione è completamente congelato, scongelare la sospensione in un bagno d'acqua da 30 a 40 gradi Celsius. Vortice la sospensione di vescicole scongelate.
Per fare un millilitro o meno di vescicole, ottenere un mini estrusore. Pre-bagnare un supporto filtrante con acqua ultra pura, quindi posizionarlo sulla superficie di supporto della membrana all'interno dell'anello O. Ripetere per il secondo supporto interno della membrana.
Posizionare un supporto interno della membrana nell'involucro esterno dell'estrusore. Posizionare una membrana in policarbonato da 100 nanometri sul supporto interno della membrana direttamente sopra il supporto del filtro. Posizionare il secondo supporto interno della membrana nell'involucro esterno dell'estrusore con l'anello O e il lato di supporto del filtro rivolti verso la membrana in policarbonato.
Fissare il cuscinetto in politetrafluoroetilene nel nodo di fissaggio e avvitarlo chiuso con l'involucro esterno dell'estrusore. Agganciare l'estrusore nel blocco riscaldante. Caricare la sospensione della vescicola lipidica in una delle siringhe e posizionare la siringa nel blocco termico dell'estrusore, inserendo completamente l'ago in un'estremità dell'estrusore.
Inserire la seconda siringa vuota sul lato opposto e bloccare entrambe le siringhe utilizzando le clip del braccio sul blocco termico. Spingere lentamente la sospensione della vescicola nella siringa vuota e poi di nuovo nella siringa originale. Ripetere altre 20 volte per un totale di 21 passaggi attraverso la membrana in policarbonato.
Trasferire le vescicole lipidiche in un vile di vetro pulito per la conservazione. Per estrudere da cinque a 50 millilitri di vescicole, assemblare il grande estrusore posizionando il supporto dello schermo del foro grande, il disco centrato, i dischi di scarico e la membrana in policarbonato nello spazio nel supporto inferiore dell'estrusore. Collegare i supporti superiore e inferiore dell'estrusore utilizzando le quattro viti e serrare.
Fissare l'unità estrusore al cilindro del campione strofinandolo sul fondo e stringendolo con una chiave inglese per fissarlo. Riempire il cilindro del campione con acqua ultrapura ed estrudere l'acqua attraverso l'unità estrusore prima di aggiungere il campione nel cilindro del campione. Aggiungere la sospensione della vescicola lipidica nel cilindro del campione e avvitare la parte superiore chiusa.
Aumentare lentamente la pressione fino a quando il campione inizia a gocciolare dall'unità di estrusore ad una velocità di circa due o tre gocce al secondo in un vile di vetro pulito. Una volta che tutto il campione è stato estruso, spegnere l'alimentazione di azoto e rilasciare la pressione nel cilindro del campione aprendo lentamente la valvola limitatrice di pressione. Versare le vescicole lipidiche nel cilindro del campione e ripetere il passaggio precedente altre nove volte per un totale di 10 estrusi.
Caricare la sospensione della vescicola in una cuvetta appropriata e inserirla nello strumento di diffusione dinamica della luce, inserire i dettagli del campione ed eseguire la misurazione utilizzando il software associato. Posizionare la cella zeta nella camera del campione, assicurandosi che gli elettrodi siano a contatto e chiudere il coperchio del portacampioni. Nel software associato, immettere i dettagli del campione e raccogliere le misurazioni.
Inserire il sensore di cristallo di quarzo codificato in silice nel modulo di flusso, assicurandosi che la forma a T sul cristallo si allinei con la forma a T sul modulo e avvitare il modulo di flusso chiuso. Negli strumenti con più camere, è possibile formare in parallelo ulteriori doppi strati. Collegare il tubo di ingresso e di uscita al modulo di flusso e alla pompa.
Posizionare il tubo nelle protezioni di tenuta e chiudere il coperchio del sistema di analisi. Posizionare un contenitore per i rifiuti all'uscita della pompa per raccogliere le soluzioni esaurite. Per eseguire la pulizia, accendere prima la pompa e impostare la velocità del flusso su 400 microlitri al minuto.
Inserire il tubo di ingresso in acqua ultra pura e far scorrere da cinque a 10 millilitri attraverso il modulo. Commutare i tubi in SDS e far scorrere da cinque a 10 millilitri attraverso il modulo. Trasforma i tubi in acqua ultra pura e fai scorrere da 10 a 20 millilitri attraverso il modulo.
Infine, far scorrere l'aria attraverso il modulo fino a quando non viene raccolta alcuna soluzione rimanente. Rimuovere il sensore dal modulo di flusso e risciacquare il sensore con acqua ultra pura. Azionare il sensore e il modulo di flusso con un flusso di gas azoto, assicurandosi che l'elettrodo rimanga sempre privo di liquidi.
In una cappa chimica, inserire il sensore di cristallo di quarzo rivestito di silice in uno strumento di pulizia a raggi ultravioletti o ozono. Accendere lo strumento e lasciare il trattamento per almeno due minuti. Rimuovere accuratamente i sensori e reinserirli nel modulo di flusso.
Accendere lo strumento analizzatore per collegare il software associato e impostare la temperatura sul valore desiderato per formare il doppio strato lipidico di supporto. Lasciare che la temperatura si stabilizzi all'ingresso desiderato. Configurare la misurazione e trovare tutte le frequenze di risonanza del sensore e la dissipazione per i toni tre, cinque, sette, nove, 11 e 13 prima di iniziare la misurazione.
Consentire al cloruro di sodio Tris di fluire attraverso il modulo da cinque a 10 minuti, assicurando che la variazione di frequenza di base o Delta F e la variazione di dissipazione o i valori Delta D nel liquido rimangano stabili. Arrestare la pompa, rimuovere il tubo di ingresso dalla soluzione di cloruro di sodio Tris e inserirlo con attenzione nella soluzione di vescicola lipidica. Riflusso per cinque secondi per rimuovere eventuali bolle d'aria dal tubo di ingresso, quindi continuare il flusso in avanti.
Riavviare la misurazione nel software per azzerare la linea di base. Flusso di vescicole lipidiche fino a quando la formazione di due strati viene osservata in tempo reale nel software di acquisizione dati. Quindi ripetere questo passaggio per cambiare il tubo di ingresso dalle vescicole lipidiche al tampone di cloruro di sodio Tris.
Aggiungere cinque microlitri della soluzione lipidica al compartimento donatore, che è una piastra filtrante multischermo porosa in polivinilidene difluoruro 96 con dimensioni dei pori di 0,45 micrometri. Immergere immediatamente la piastra filtrante nel compartimento accettore, che è una piastra ricevente di trasporto contenente 300 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Aggiungere 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato al compartimento del donatore di trasporto.
Seguire i passaggi precedenti di arresto della pompa e di sostituzione del tubo di ingresso in soluzione di vescicola lipidica e osservare la formazione di doppio strato, quindi modificare il tubo di ingresso nella soluzione alfa elicoidale o peptidica AH. Introdurre la soluzione nel modulo di flusso fino a quando non si osservano cambiamenti di frequenza e cambiamenti di dissipazione dalla nuova aggiunta di soluzione. Arrestare la pompa e lasciare incubare il peptide AH con le vescicole per 10 minuti.
Cambiare il tubo di ingresso in cloruro di sodio Tris e avviare il flusso per rimuovere il peptide AH dalle vescicole rotte, portando alla formazione di successo di un doppio strato lipidico. In primo luogo, far scorrere il solvente della molecola, quindi, commutare il tubo di ingresso nella soluzione contenente la molecola di interesse e fluire per almeno cinque minuti. Se lo si desidera, interrompere il flusso e consentire al liquido contenente la molecola desiderata di incubare con il doppio strato.
Riportare il tubo di ingresso al solo solvente molecolare. Scorrere per almeno cinque minuti, quindi commutare il tubo di ingresso in cloruro di sodio Tris e scorrere per almeno cinque minuti. Nel software, interrompere la misurazione, salvare il file e arrestare la pompa.
Immediatamente dopo i passaggi precedenti per un doppio strato sospeso unilipidico o per un doppio strato sospeso multilipidico, rimuovere PBS dal compartimento della piastra filtrante del donatore e sostituirlo con 200 microlitri della soluzione di prova. Immergersi immediatamente in una nuova piastra del ricevitore di trasporto con 300 microlitri di PBS. Dopo l'incubazione con un leggero dondolo per due ore a 25 gradi Celsius, raccogliere 150 microlitri della soluzione dai compartimenti donatore e accettore.
Misurare la concentrazione della molecola in entrambi i campioni utilizzando un metodo appropriato basato sulle proprietà di questa molecola. Sono state confrontate le dimensioni, la polidispersità e il potenziale Zeta delle vescicole PC dell'uovo unilipidico e due composizioni di vescicole multi lipidiche. La distribuzione dimensionale delle vescicole dell'uovo PC e delle vescicole multi lipidiche era quasi identica.
Sia le vescicole dell'uovo che quelle multi-lipidiche pc sono state caricate negativamente, mentre le due vescicole multilipidiche sono state caricate positivamente. Vescicole di PC uovo unilipidico facilmente assorbite in superficie, come dimostrato dalla diminuzione del cambiamento di frequenza e dall'aumento del cambiamento di dissipazione, seguito da rottura spontanea. Vescicole multilipidiche assorbite in superficie, ma richiedono l'aggiunta di peptide AH per rompere le vescicole, con conseguente formazione di doppio strato lipidico.
Con i doppi strati lipidici supportati, il cambiamento di frequenza e il cambiamento di dissipazione possono essere analizzati prima e dopo l'introduzione di un composto di interesse. Ad esempio, sono state studiate le interazioni di DEHP e tossico ambientale con uni supportato e multistrato da strati. Livelli simili di assorbimento di DEHP sono stati osservati per entrambi i tipi di doppio strato lipidico.
Tuttavia, sono state osservate differenze nel cambiamento di dissipazione tra i due strati con un cambiamento di dissipazione più grande osservato per il doppio strato PC dell'uovo rispetto al doppio strato multi lipidico. È stata osservata una piccola permeazione sia per i doppi strati uni-lipidici che multi-lipidici. Seguendo questa procedura, è possibile sviluppare una varietà di cellule che imitano i doppi strati lipidici per consentire lo screening senza cellule delle interazioni molecolari con composti che vanno dai prodotti farmaceutici alle sostanze tossiche ambientali.
