Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research attraverso un catalizzatore Co-infezioni e co-morbidità e di sovvenzione. Eritrociti umani sono stati forniti dal Centre Hospitalier de banca del sangue l&#39;Université Laval.

Nota: Esperimenti con HIV-1 e il Plasmodium falciparum devono essere eseguite nel corretto livello di biosicurezza laboratori (BSL2 per i parassiti, e BSL3 per l&#39;HIV-1 e co-infezioni) e precauzione particolare deve essere posta nell&#39;uso potenzialmente infetto sangue umano. 1. Le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) Purificazione (Basato su 8 e 9) <ol><li> Iniziare con sangue umano fresco da donatori sani (500 ml) trattati con anticoagulanti (eparina, citrato, destrosio citrato acido o destrosio citrato fosfato). Utilizzare priva di endotossina reagenti quando purificare e isolare PBMC e per tutto il resto del protocollo. </li><li> Disinfettare la sacca di sangue, compreso il tubo, con il 70% di etanolo, tagliare il tubo e trasferire con cautela il sangue in un pallone T150. </li><li> Preparare 16 provette con 15 ml di separazione Medio Linfociti (Ficoll) per tubo da 50 ml (assicurarsi che Ficoll ha raggiunto la temperatura ambiente).Cautela strato 30 ml di sangue fresco sulla parte superiore. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 30 min a 20 ° C con interrompe. </li><li> Durante la centrifugazione, la preparazione 8 x 50 ml provette coniche con 25 ml di soluzione salina bilanciata di Hank temperatura ambiente (HBSS) per provetta. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;anello nuvoloso cella a livello di interfaccia (contiene PBMC) al tubo 50 ml contenente il HBSS (piscina 2 anelli cellulari per ogni tubo). Completa volumi fino a 50 ml con HBSS. </li><li> Centrifugare a 150 xg per 15 min a 20 ° C con rotture sul. </li><li> Durante la centrifugazione dell&#39;anello cella nuvoloso, raccogliere lo strato giallo superiore dal punto Ficoll, piscina per il plasma per riempire un tubo da 50 ml. Inattivare il complemento nel plasma riscaldando il tubo da 50 ml a 56 ° C per 30 minuti e centrifuga 10 min a 1.800 x g. Mantenere il supernatante (contiene plasma autologo diluito che può essere utilizzato come mezzo integratore a passi successivi). </li><li> Rimuovere con cura il supernatante e resuspend il pellet di cellule dal punto 1.7 in 25 ml di HBSS e piscina 2 pellets per tubo da 50 ml. Spin a 300 xg per 8 minuti a 20 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante con cura e risospendere il pellet in 10 ml di HBSS e piscina in un tubo da 50 ml. </li><li> Prelevare un &#39;aliquota, eseguire l&#39;esclusione blu trypan per valutare la mortalità e poi contare PBMC. </li><li> Completa il volume a 50 ml con HBSS e spin 10 min a 300 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in RPMI 1640 a 5x10 6 cellule / ml (si dovrebbe ottenere circa 400-500 x 10 6 PBMC da 500 ml di sangue). </li></ol> 2. I monociti-macrofagi derivati ​​(MDM) Differenziazione (Basato su 8 e 9) <ol><li> Seed circa 1,25 x 10 8 PBMC in 15 piatti cm con RPMI 1640 (25 ml / piatto). </li><li> Lasciare cellule aderiscono per 1-2 ore a 37 ° C con 5% CO 2 atmosfera. </li><li> Trasferire cellule non aderenti in un pallone nuovo e lavare con 15 ml piastra priva di endotossina PBS due volte (5min, 300 xg). Le cellule aderenti sono monociti isolati. </li><li> Per consentire monociti isolate di fresco a differenziarsi in MDM, aggiungere 20 ml di terreno RPMI 1640 supplementato con 5% di plasma autologo (dal passaggio 1,8). Aggiungere umano ricombinante fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, 25 ng / ml) e soluzione di penicillina / streptomicina (PS, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina). Incubare per 2 giorni, modificare medie e incubare 2-3 giorni supplementari a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. </li><li> Rimuovere vecchio mezzo e lavare con PBS privo di endotossine una volta, aggiungere la PBS delicatamente e aspirare immediatamente. Per staccare MDM completamente differenziate, cellule trattare con ~ 7 ml Accutase (Accutase, una miscela disponibile in commercio e attività di proteasi collagenolitica che consentono il distacco delle cellule dal piatto di plastica) per 15-20 minuti a 37 ° C in una CO 5% 2 atmosfera, cullare dolcemente a metà tempo. </li><li> Aggiungere 3-5 ml di plasma autologo (dal punto 1.8) in ciascun piatto (per aiutare a proteggere le cellule, mentreraschiatura). </li><li> Raschiare delicatamente le cellule facendo attenzione che media copre le cellule di tutti i tempi e di trasferimento / piscina in una provetta da 50 ml. </li><li> Lavare le piastre con PBS privo di endotossine per recuperare le celle numero possibile. </li><li> Spin 5 min a 200 xg, eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di terreno di coltura MDM (RPMI 1640 supplementato con 10% complemento-inattivato Siero fetale bovino (IFB), PS, 25 mM HEPES) e cellule di conteggio (MDM resa generalmente 2-8% del totale PBMC). Nota: una aliquota di MDM potrebbero essere prese in questa fase di valutare la purezza della popolazione cellulare mediante citometria di flusso, di solito il 99% di MDM ottenuto espressa CD14. </li><li> Seme 1x10 5 MDM in 600 pl di mezzo di coltura MDM per pozzetto in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera prima infezioni. </li></ol> 3. Produzione e quantificazione di HIV-1 Stocks virali <ol><li> Produrre azioni virali utilizzando fosfato di calcio transfezione in cellule HEK293T Folloala il protocollo di Fortin et al. dieci. </li><li> Per ottenere virus singolo ciclo contenenti la luciferasi-codifica gene reporter, co-trasfezione cellule HEK293T sia con 20 pg di NL4.3 Luc + Env - R + e 10 pg di pHCMV-G, o 15 microgrammi di NL4.3 Luc + Env - R + e 15 microgrammi di pJRFL env. Uso 30 microgrammi di NL4.3 Luc + Env - R + per generare controllo della glicoproteina-carenti virus. Per il virus replicativa completamente, utilizzare 30 microgrammi di NL4.3Bal env. I vettori pHCMV-G e pJRFL env codificare le glicoproteine ​​del virus della stomatite vescicolare (VSV-G) e di un CXCR5-tropico HIV-1 (diverso NL4.3Bal env), rispettivamente. Ulteriori informazioni sui plasmidi possono essere ottenuti da 8. I plasmidi possono essere ottenute attraverso il NIH AIDS Research and Program Reference (NIAID, NIH). </li><li> Quantificare tutti gli stock virali mediante ELISA per la proteina HIV-1 p24 del capside 11, E verificare il loro potenziale infettiva prima dell&#39;uso. Valutiamo l&#39;infettività delle nostre riserve di virus attraverso l&#39;uso di TZM-bl cellule indicatrici 12. </li></ol> 4. Cultura di parassiti Plasmodium falciparum (Basato su 13) 4,1 cultura generale e la manutenzione dei parassiti <ol><li> Mantenere P. falciparum parassiti fase 3D7 asessuali di eritrociti umani (gruppo O +) ad un ematocrito del 4% in RPMI 1640 (tamponato con HEPES 25 mM e 25 mM NaHCO 3) supplementato con 0,5% (w / v) Albumax II, 25 pg / ml gentamicina e ipoxantina 370μM a 37 ° C in una miscela gassosa di ossigeno 1% / anidride carbonica 5% in azoto. </li><li> Parassitemia può essere controllata facendo un velo di cultura e colorazione con una soluzione Giemsa 15%. </li><li> Mantenere sempre un cellule non infettate globuli rossi (uRBC) piatto di coltura nelle stesse condizioni come parassiti da utilizzare come un controllo. Per ottenere Parasit fine stagees (trofozoiti / schizonti primi), sincronizzare i parassiti come segue: </li></ol> 4,2 Parasite sincronizzazione <ol><li> Al mattino, raccogliere la cultura parassita, spin 5 min a 300 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere le sfere in 5 volumi ematocrito con 5% (w / v), D-sorbitolo e incubare 5 min a 37 ° C. </li><li> Spin 5 min a 300 x g, eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 30 ml di mezzo la cultura e la rimessa in incubatrice. </li><li> Circa 8 ore dopo, ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.3 in modo da ottenere parassiti ben sincronizzati. Parassiti fase avanzata (trofozoiti / schizonti primi) può quindi essere raccolte la mattina seguente per eseguire l&#39;esperimento. Prima di purificazione, eseguire la colorazione Giemsa per confermare la fase del ciclo di vita. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum-globuli rossi infetti (iRBC) depurazione <ol><li> Sterilizzare il separatore VarioMacs (stand e magnete) con il 70% di etanolo e ppizzo sotto il cofano biologico. </li><li> Fissare la valvola a tre vie a colonna in basso a CS. </li><li> Tagliare la fine della protezione dell&#39;ago plastica con la taglierina Miltenyi speciale e fissare l&#39;ago al fondo rubinetto. </li><li> Bloccare la colonna all&#39;interno del magnete con attenzione. </li><li> Rimuovere le bolle d&#39;aria nella colonna iniettando lentamente 10 ml di terreno di coltura MDM con il kit-chiuso siringa avvitato sul lato sinistro del rubinetto. </li><li> Lavare la colonna con circa 20 ml di terreno di coltura MDM. </li><li> Harvest RBC dalla piastra di coltura, lavare una volta con 10 ml di mezzo MDM (300 xg, 5 min) e risospendere il pellet in 12 RBC terreno di coltura MDM ml. Aggiungere lentamente alla colonna e lasciare che il flusso di sospensione attraverso (solo le cellule infettate globuli rossi contenenti parassiti nel trofozoite o stage schizonte sarà trattenuto dal campo magnetico a causa della presenza di cristalli emozoina). </li><li> Risciacquare una volta con 20 ml di mezzo e arrestare il flusso di liquido quando raggiunge il disco bianco sulla parte superiore della colonna. </li><li>Rimuovere la colonna dal magnete e iRBC eluire in una provetta pulita sterile con 12 ml di terreno di coltura MDM. </li><li> Macchia un&#39;aliquota del iRBC recuperato ed eseguire la colorazione Giemsa per confermare la fase di ciclo di vita. </li><li> Contare iRBC recuperato utilizzando un emocitometro (isolato RBC sono al 100% iRBC). </li><li> Celle a pellet (300 xg, 5 min), eliminare il surnatante e trattare le cellule con 500 microlitri AB + fresca di siero umano (opsonizzazione passo 14). </li><li> Incubare per 30 min a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. </li><li> Risciacquare una volta con 10 ml di terreno di coltura MDM (300 x g, 5 minuti), e risospendere iRBC alla concentrazione desiderata. Di solito, un 10% di parassitemia 15 centimetri piatto di coltura dà circa ~ 0.5-1x10 8 iRBC ben sincronizzati. </li></ol> 5. L&#39;esposizione di MDM di Plasmodium falciparum <ol><li> Per esporre la MDM di uRBC o iRBC, le cellule devono essere risospese in mezzo di coltura MDM per ottenere un rapporto di uRBC / iRBC: MDM di 75:1. In precedenzapreparate piastre da 24 pozzetti contenenti MDM, aggiungere volume appropriato sospensione RBC in ciascun pozzetto. Eseguire tutti gli esperimenti, in triplice copia. </li><li> Incubare co-colture per 4 ore a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. </li><li> Lavare le cellule con 600 microlitri di endotossina-free PBS 3 volte, aggiungere il PBS delicatamente e aspirare immediatamente. </li><li> Per lisare il restante RBC, lavare i pozzetti aggiungendo 200 microlitri di acqua ghiacciata sterile per 20 sec e aspirato. </li><li> Aggiungere 600 pl terreno di coltura MDM e incubare 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. </li></ol> 6. L&#39;infezione di MDM con un replicativa completamente HIV-1 <ol><li> Per valutare l&#39;effetto di P. falciparum sulla replicazione dell&#39;HIV-1 in MDM, aggiungere, secondo lo schema illustrato in Figura 1A, 10 ng di p24 (in 300 pl di MDM media) del virus NL4.3Bal env nel caso pozzetti, aggiungere solo mezzo MDM in pozzetti di controllo . </li><li> Incubare 2 ore a 37 ° C in 5% Di CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Lavare le cellule con PBS privo di endotossine 3 volte, aggiungere il PBS delicatamente e aspirare immediatamente. Aggiungere 600 microlitri di terreno MDM fresca per bene. </li><li> Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. </li><li> Al giorno 3, 6, 9 e 12 dopo l&#39;inizio di infezione virale, raccolto 200 pl di ciascun supernatante, aggiungendo 200 pl di mezzo fresco MDM successivamente. Mantenere i surnatanti raccolti a -20 ° C per la quantificazione dei principali HIV-1 proteina del capside p24 mediante ELISA seguito Fortin et al. 10. </li></ol> 7. L&#39;infezione di MDM con un singolo Luciferase Encoding Virus Cycle <ol><li> Per determinare l&#39;impatto del parassita su HIV-1 espressione genica in MDM, aggiungere, secondo lo schema illustrato nella figura 1B, 10 ng p24 (in 300 pl di mezzo MDM) di una NL4.3 Luc + Env - R + ( VSV-G), NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) o NL4.3 Luc +Env - R + virus nei pozzetti corrispondenti. </li><li> Incubare 2 ore a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. </li><li> Lavare le cellule con 600 microlitri di endotossina-free PBS 3 volte, aggiungere il PBS delicatamente e aspirare immediatamente. Aggiungere 600 microlitri di terreno MDM fresca per bene. </li><li> Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. </li><li> Rimuovere il supporto di 72 ore seguenti l&#39;infezione e aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi 1X (fornita con il kit di analisi luciferasi). Lasciate che le cellule lisare a temperatura ambiente, con agitazione delicata. Conservare a -20 ° C. </li><li> Scongelare la piastra e trasferire 40 microlitri di lisato ad una piastra a 96 pozzetti luminometro; aggiungere 100 ul di substrato luciferasi (fornita con il kit di analisi luciferasi) e misurare la luciferasi (luciferasi Firefly) attività in un luminometro seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Utilizzando il nostro modello di co-infezione, si dimostra che exposure di P. falciparum alla MDM diminuisce la loro suscettibilità alle infezione da HIV-1. Infatti, una diminuzione significativa (p &lt;0,05; 2 ANOVA, giorno 12) per il rilascio di particelle virali, come misurato da HIV-1 p24 proteina del capside del supernatante, si osserva in MDM pretrattati con parassiti (Figura 2A). Questa osservazione è confermata in cellule infettate da virus che codificano un gene reporter luciferasi. MDM con infezione da virus di questo tipo si annidano sia esogena VSV-G o HIV-1 glicoproteine ​​conduce in modo significativo (p &lt;0,05, di Student t-test) produzione di luciferasi meno in cellule esposte a P. falciparum (Figura 2B). È interessante notare che VSV-G-pseudotyped virus prodotto molto maggiore attività di luciferasi che le loro controparti JRFLenv: ciò è dovuto alla maggiore efficienza di infezione VSV-G particelle pseudotyped 15. Dato che parassita esposizione agli impatti MDM entrambi i tipi di virus, questo suggerisce che influisce in qualche passo ex gene viralepressione (Figura 2B). È inoltre importante ricordare che la vitalità cellulare non è stata influenzata dalla MDM esposizione alla iRBC (dati non mostrati), indicando che l&#39;inibizione osservata è specifico e non causa di mortalità cellulare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> Figura 1. A) schema di Piastra MDM di infezione con un virus replicativa pienamente Mock:. Cellule non infettate. uRBC: cellule esposte a infettate globuli rossi. iRBC: cellule esposte a Plasmodium falciparum-globuli rossi infetti. Bal: cellule infettate con NL4.3Bal env Bal / uRBC:. Cellule esposte a uRBC e infettati con NL4.3Bal env Bal / iRBC:.. Cellule esposte a iRBC e infettati con NL4.3Bal env B) Schema Piastra per l&#39;infezione da MDM con singolo ciclo di luciferasi virus Mock-encoding:. cellule non infettate. uRBC: cellule esposte a infettate globuli rossi. iRBC: le cellule esposte a Plasmodium falciparum-infected globuli rossi. Δenv: cellule infettate con NL4.3 Luc + Env - R + JRFL:. Cellule infettate con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). VSV-g: cellule infettate con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-g) Δenv / uRBC:.. cellule esposte a uRBC e infettati con NL4.3 Luc Env +-R + Δenv / iRBC: le cellule esposte a iRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env - R + JRFL / uRBC: cellule esposte a uRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: cellule esposte a iRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: le cellule esposte a uRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G): vsv-g/iRBC. cellule esposte a iRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-g). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; Figura 2. . A) Effetto del Plasmodium falciparum in materia di HIV-1 la produzione virale in MDM MDM sono stati esposti a uRBC o iRBC con un rapporto 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) per 4 ore e ampiamente lavato. Le cellule sono state infettate con 10ng di NL4.3Bal p24 per 2 h env. Produzione virale è stata monitorata mediante ELISA per HIV-1 p24 in cellule privo supernatante a tempi diversi dopo l&#39;infezione virale iniziale. Un esperimento rappresentativo è mostrato B) Effetto del Plasmodium falciparum in materia di HIV-1 la trascrizione virale in MDM MDM sono stati infettati con uRBC o iRBC con un rapporto 75:1 (uRBC / iRBC:.. MDM). Le cellule sono state poi infettate con 10ng di p24 del virus a ciclo unico (sia NL4.3 Luc + Env - R +, NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) o NL4.3 Luc + Env - R + (VSV- g)). Espressione della luciferasi è stata valutata in lisati cellulari 72 ore dopo l&#39;infezione virale iniziale. Un esperimento rappresentativo viene mostrato.

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2005).</li><li>Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi:+a+prospective+cohort+study.">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365, 233-240 (2005).</li><li>Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-malaria+co-infection:+effects+of+malaria+on+the+prevalence+of+HIV+in+East+sub-Saharan+Africa.">HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).</li><li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).</li><li>Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+malaria+antigens+renders+mononuclear+cells+susceptible+to+HIV+infection+and+re-activates+replication+of+endogenous+HIV+in+cells+from+HIV-infected+adults.">Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults.</a> Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).</li><li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+derived+from+hemozoin-loaded+monocytes+display+a+partial+maturation+phenotype+that+promotes+HIV-1+trans-infection+of+CD4++T+cells+and+virus+replication.">Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication.</a> J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).</li><li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+hemozoin+modulates+susceptibility+of+immature+monocyte-derived+dendritic+cells+to+HIV-1+infection+by+inducing+a+mature-like+phenotype.">Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype.</a> Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).</li><li>Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+the+malaria+pigment+hemozoin+renders+human+macrophages+less+permissive+to+HIV-1+infection.">Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection.</a> Virology. 395, 56-66 (2009).</li><li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+macrophages.">Isolation and culture of human macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4(+)-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue,+a+major+site+of+replication+in+vivo.">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li><li>Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+(T-20)+monotherapy.">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193, 673-675 (1976).</li><li>Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+human+red+blood+cells+by+human+monocytes:+involvement+of+immune+and+nonimmune+determinants+and+dependence+on+parasite+developmental+stage.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage.</a> Blood. 80, 801-808 (1992).</li><li>Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+CD34++cells+with+a+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+retroviral+vector+pseudotyped+with+vesicular+stomatitis+virus+envelope+glycoprotein+G.">High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G.</a> J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).</li><li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network.">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Abbiamo illustrato qui due diversi approcci per analizzare l&#39;impatto del parassita della malaria sul HIV-1 ciclo virale, vale a dire analizzando sia l&#39;espressione genica virale o virus produzione di progenie e replica in monociti-macrofagi derivati. Simili approcci sono stati usati per altre HIV-1-parassita co-infezioni 16. Tuttavia, questi nuovi dati sono un passo avanti nelle indagini della malaria-HIV-1 co-infezioni. ., Infatti, Diou et al 8 studiato l&#39;effetto di emozoina, i parassiti non dal vivo, il replicazione dell&#39;HIV-1, in accordo con i nostri risultati, hanno osservato che emozoina era per sé sufficiente a inibire la produzione virale da MDM, e non MDM. Utilizzando il layout descritto sperimentale, abbiamo osservato che P. falciparum esercita un chiaro effetto negativo sul ciclo replicativo di HIV-1 nei macrofagi: una significativa inibizione della produzione virale si osserva nei macrofagi pre-esposti a parassiti (Figure 2A) e un peso specifico del parassita sulla trascrizione virale è illustrato nella figura 2B. Tuttavia, non possiamo lasciare eventuali ulteriori effetti del parassita su ingresso del virus o la fusione (decapsidation), o su post-integrazione di meccanismi, come la sintesi proteica o montaggio di particelle virali e in erba. Inoltre, è possibile che un diverso impatto sulla replicazione dell&#39;HIV-1 si otterrebbe se il parassita sono stati aggiunti sia al tempo stesso o infezione MDM seguente con il virus. Il nostro in vitro co-infezione modello fornisce un potente strumento per effettuare indagini dettagliate di HIV-1 / P. interazioni falciparum nella cellula ospite. Ad esempio, la combinazione di questo schema sperimentale con altre tecniche come tempo reale PCR quantitativa, che può bersagliare e quantificare fasi specifiche retrotrascrizione virale e integrazione del genoma virale per genoma della cellula ospite, sono abbastanza fattibile e dovrebbe fornire ulteriori all&#39;interghts nei meccanismi coinvolti nella co-infezioni. Inoltre, saggi specifici per valutare fasi iniziali del ciclo virale (virale fusione, decapsidation, quantificazione ingresso) può essere applicato a questo protocollo di base per analizzare ulteriormente l&#39;effetto sulla replicazione virale. Queste modifiche mostrano come flessibile questo protocollo è relativa HIV-1 e quantificazione di rilevamento: infatti, anche standard di HIV-1 trascrittasi inverse saggi di quantificazione utilizzando marcata con tritio nucleotidi potrebbe concepibilmente sostituire la ELISA per HIV-1 p24. Oltre a MDM, ci aspettiamo il sistema sia adattabile ad altri tipi di cellule competenti per HIV-1-malaria interazioni, come monociti e cellule dendritiche. Il fatto che MDM sono cellule aderenti facilita la loro manipolazione, per facilitare il lavaggio di iRBC che non sono state prese in, o che sono in contatto con MDM, senza eliminando eventuali macrofagi. Tale vantaggio non si applica alle cellule dendritiche e monociti, che sono coltivate in sospensione, complicando la separazione di iRBC uRBC e gratuito con tali cellule e stiamo affrontando questo problema. Il nostro sistema potrebbe anche essere utile per studiare le interazioni più complesse quali gli effetti di Plasmodium-esposti cellule derivate da monociti sul ciclo virale HIV-1 in altre cellule immunitarie come CD4-positive cellule T in esperimenti di co-coltura. Infine, il nostro protocollo potrebbe essere adatto per gli esperimenti che cercano l&#39;effetto di P. iRBCs falciparum in materia di HIV-1 riattivazione in PBMC per HIV-1 individui infetti. Etica dichiarazione PBMC umani sono stati ottenuti dal sangue di donatori sani, in conformità con le linee guida del Comitato di bioetica del Centre Hospitalier de l&#39;Centro di Ricerca Université Laval. Un consenso scritto è stato ottenuto da tutti i donatori di sangue.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicell </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotossina libera </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Bisonte </td><td> 080-150 </td><td> Inattivato al calore a 56 ° C per 30 min </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> Disciolto in RPMI 1640, sterilizzata con filtro </td></tr><tr><td> Separazione media dei linfociti </td><td> Multicell </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Piastre luminometro Bianco </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS Mac separazione columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs separatore </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina soluzione </td><td> Bisonte </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Cella raschietto (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well piastre di coltura cellulare </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 mm piastra di coltura </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> GenScript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> Siero umano AB + </td><td> Biomedical Valley </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Bisonte </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Ipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Test del sistema luciferasi </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> Globuli rossi umani </td><td></td><td></td><td> Ottenuto purificata da banca del sangue CHUL. </td></tr></tbody></table>

an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells

Plasmodium falciparum, l&#39;agente eziologico della forma mortale di malaria, e da virus dell&#39;immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) sono tra i problemi di salute più importanti del mondo, essendo responsabile per un totale di 4 milioni di decessi all&#39;anno 1. Grazie alla loro sovrapposizione ampie nelle regioni in via di sviluppo, specialmente nell&#39;Africa Sub-sahariana, co-infezioni da malaria e HIV-1 sono comuni, ma l&#39;interazione tra le due malattie è poco conosciuta. Rapporti epidemiologici hanno suggerito che l&#39;infezione malarica aumenta transitoriamente replicazione dell&#39;HIV-1 e aumenta il carico virale HIV-1 in co-infezione da 2,3. Poiché questo viremia rimane alta per diverse settimane dopo il trattamento con antimalarici, questo fenomeno potrebbe avere un impatto sulla progressione della malattia e la trasmissione. I meccanismi immunologici cellulari alla base di queste osservazioni sono stati studiati solo a malapena. I pochi studi in vitro investigdall&#39;uso della impatto della malaria su HIV-1 hanno dimostrato che l&#39;esposizione ad antigeni solubili malarici può aumentare da HIV-1 e riattivazione in cellule immunitarie. Tuttavia, questi studi hanno utilizzato estratti di cellule intere di P. falciparum stadio schizonte parassiti e cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), il che rende difficile decifrare quale componente della malaria (s) è responsabile degli effetti osservati e quali sono le cellule bersaglio ospiti erano 4,5. Studi recenti hanno dimostrato che l&#39;esposizione di immature derivate da monociti cellule dendritiche al pigmento emozoina malarica aumentato la loro capacità di trasferire HIV-1 di cellule T CD4 + 6,7, ma che è diminuito da HIV-1 di macrofagi 8. Per far luce su questo processo complesso, l&#39;analisi sistematica delle interazioni tra il parassita della malaria e l&#39;HIV-1 in differenti popolazioni umane rilevanti cellulari primarie è criticamente necessaria. Diverse tecniche per indagare l&#39;impatto della HIV-1 sulla fagocitosi dei microrganismi e l&#39;effetto di tali patogeni in replicazione dell&#39;HIV-1 sono stati descritti. Noi qui presentiamo un metodo per studiare gli effetti di P. falciparum-infetti eritrociti sulla replicazione di HIV-1 in primarie umane derivate da monociti macrofagi. L&#39;impatto di esposizione parassita HIV-1 trascrizionali / traduzionale eventi viene monitorata mediante virus singolo ciclo pseudotyped in cui un gene reporter della luciferasi ha sostituito il gene Env, mentre l&#39;effetto sulla quantità di virus rilasciato dai macrofagi infettati è determinata misurando la HIV-1 proteina del capside p24 mediante ELISA in supernatanti cellulari.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells at JoVE.com

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Abbiamo sviluppato uno<em&gt; In vitro</em&gt; Malaria-HIV-1 co-infezione da modello per studiare l&#39;impatto di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Sul ciclo replicativo di HIV-1 in primarie umane derivate da monociti macrofagi. Questo sistema versatile può essere facilmente adattato ad altri tipi di cellule primarie sensibili a HIV-1.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

an-vitro-co-infection-model-to-study-plasmodium-falciparum-hiv-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

13.6K Views.  CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada. Abbiamo sviluppato uno In vitro Malaria-HIV-1 co-infezione da modello per studiare l'impatto di Plasmodium falciparum Sul ciclo replicativo di HIV-1 in primarie umane derivate da monociti macrofagi. Questo sistema versatile può essere facilmente adattato ad altri tipi di cellule primarie sensibili a HIV-1.

Video: An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sette passi per Stellate Cellule

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per la misurazione Risposte immunitarie Malaria nel contesto della coinfezione da HIV

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.