Il nostro protocollo descrive i metodi per interferire efficacemente con il turnover autofagico indotto da HSV-1 nelle cellule dendritiche. E in particolare, confrontiamo un inibitore basato su un inibitore con una strategia basata sul siRNA per bloccare l'autofagia prima dell'infezione. Mentre l'interferenza basata sull'inibitore con l'autofagia comprende effetti potenziali e specifici fuori bersaglio, la nostra strategia sviluppata basata su siRNA è più specifica per l'obiettivo.
È importante sottolineare che entrambe le tecniche presentate non influenzano le fasi di maturazione della malattia. A dimostrare la procedura saranno Petra Muhl-Zurbes, una tecnico, e Alexandra Duthorn, una studentessa universitaria, del mio laboratorio. Inizia raccogliendo cellule dendritiche immature o iDC risciacquando delicatamente le cellule liberamente aderenti dal fondo del pallone di coltura cellulare il quarto giorno dopo l'aderenza.
Aggiungere un cocktail di maturazione alle cellule per generare cellule dendritiche mature o mDC. Due giorni dopo l'induzione della maturazione, sciacquare gli mDC dal fondo del pallone di coltura cellulare. Ripetere il risciacquo due volte, quindi trasferire gli iDC e gli mDC in tubi da 50 millilitri nel rispettivo mezzo di coltura.
Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 300 volte g per cinque minuti. Rimorsiva delicatamente le cellule in cinque-10 millilitri di RPMI 1640 per pallone di coltura cellulare e combinare le rispettive sospensioni CC in un unico tubo. Quindi quantificare le celle utilizzando una camera di conteggio assicurandosi di evitare alterazioni della temperatura durante la gestione dei PC.
Trasferire due milioni di iDC o mDC in un tubo a due millilitri, centrifugarli a 3.390 volte g per 1-1/2 minuti e scartare il supernatante. Delicatamente il resuspend le cellule nel mezzo di infezione. Inibire la via di degradazione lisosomiale autofagosomale aggiungendo 10 spautina micromolare-1 o una bafilomicina micromolare A1 al mezzo di infezione un'ora prima dell'infezione.
Aggiungere DMSO per il controllo non trattato e incubare le cellule su un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius con scuotimento a 300 giri/min. Per gli studi sulle infezioni, inoculare le cellule con virioni HSV-1 a una molteplicità di infezione di due. Aggiungere il rispettivo volume di buffer MNT come un finto controllo e incubare le cellule su un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per un'ora con scuotimento.
Un'ora dopo l'infezione, raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 3.390 volte g per 1-1/2 minuti, quindi aspirare delicatamente l'inoculo e rimorsire le cellule nel mezzo DC. Cellule trattate con beffa di semi e cellule infette da HSV-1 ad una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro in una piastra a sei pozzetti. A 16-24 ore dopo l'infezione, raccogliere iDC utilizzando un raschietto cellulare o mDC risciacquando, trasferire le cellule in un tubo di blocco sicuro da 1,5 millilitri e raccoglierle tramite centrifugazione a 3,390 volte g per 1-1/2 minuti.
Ripetere la raccolta e la centrifugazione con le cellule rimanenti nei pozzi, quindi lavare il pellet una volta con un millilitro di PBS e rimescolare vigorosamente le cellule in miscela di lisi. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 10 minuti e quindi riscaldare a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire l'analisi della pagina SDS e del western blot per verificare i livelli di proteine LC3B1 e LC3B2, P62, ICP0 e ICP5 e GAPDH.
Il giorno 3.5 dopo l'aderenza, trasferire 12 milioni di iDC in un tubo da 50 millilitri, centrifugarli a 300 volte g per cinque minuti, quindi scartare il supernatante. In parallelo, eseguire l'analisi citometrica del flusso per monitorare lo stato di maturazione. Lavare delicatamente gli iDC in cinque millilitri di Opti-MEM senza fenolo rosso e centrifugarli a 300 volte g per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 200 microlitri di Opti-MEM regolando la concentrazione cellulare a sei milioni di cellule ogni 100 microlitri. Aggiungere 75 picomoli di siRNA specifico o strapazzato FIP200 a quattro elettrocuvette millimetrici e trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare nella rispettiva cuvetta. Pulsare direttamente gli iDC utilizzando un apparato di elettroporazione.
Dopo l'elettroporazione, trasferire gli iDC in piastre a sei pozzetti con mezzo CC fresco preri riscaldato, seminando le cellule ad una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro e posizionarle nell'incubatrice. Dopo 48 ore, esaminare microscopicamente la morfologia degli iDC elettroporati, quindi raccogliere le cellule con il raschietto cellulare e trasferirle in tubi da 15 millilitri. Risciacquare i pozzi con un millilitro di PBS integrato con 0,1%EDTA e trasferire la soluzione ai rispettivi tubi.
Quindi dividere le celle per ogni condizione di siRNA come descritto nel manoscritto. Utilizzare 500.000 cellule per valutare lo stato di maturazione e la vitalità cellulare, utilizzare un milione di cellule per l'analisi western blot per verificare l'efficienza di abbattimento specifica fip200 e utilizzare le cellule rimanenti per esperimenti di infezione HSV-1. Gli iDC e gli mDC generati sono stati analizzati fenotipicamente dalla citometria del flusso al fine di escludere la contaminazione con altri tipi di cellule e verificarne lo stato di maturazione.
Le cellule sono state macchiate con anticorpi CD3 e CD14 per escludere rispettivamente la contaminazione da cellule T e monociti. Le celle sono state macchiate per CD11c che funge da marcatore generale altamente espresso per i CD. Per valutare lo stato di maturazione, sono stati utilizzati anticorpi CD80, CCR7, CD83 e MHCII perché queste molecole sono altamente espresse su CD maturi.
La microscopia a fluorescenza e la citometria del flusso sono state utilizzate per determinare l'infezione da EGFP che esprime HSV-1. Forti segnali GFP indicano un'infezione quasi completa di iDC e mDC. L'analisi western blot è stata utilizzata per determinare se la spautina-1 o la bafilomicina A1 inibiscono il flusso autofagico nelle cellule infette da HSV-1.
Negli iDC, il flusso autofagico è dimostrato dal declino dell'espressione P62 e LC3B rispettivamente in assenza di spautina-1 e bafilomicina A1. Al contrario, l'infezione da HSV-1 degli mDC in assenza di spautina-1 non influisce sull'espressione di P62, mentre il trattamento con spautina-1 e BA1 ha indotto un accumulo di LC3B-II che riflette l'induzione dell'autofagia ma un fallimento del turnover autofagico negli mDC. La riduzione dei livelli proteici FIP200 con elettroporazione del siRNA provoca anche una forte diminuzione del flusso autofagico negli iDC infetti da HSV-1.
Questo protocollo di elettroporazione basato su siRNA per l'inibizione dell'autofagia non influisce sulla vitalità cellulare, sul fenotipo dell'immagine o sulla creazione dell'espressione proteica HSV-1 negli iDC. I nostri protocolli di elettroporazione offrono l'opportunità di fornire specie distinte di DNA o RNA in malattie e altri tipi di cellule primarie. Successivamente, è possibile eseguire una varietà di analisi molecolari, funzionali e di infezione.
La strategia basata sul siRNA per il silenziamento dell'espressione nella malattia apre la strada all'esplorazione della funzione di qualsiasi proteina di interesse, combinata anche con successivi test funzionali.
