Gli autori desiderano ringraziare Emilija Renke e Janet Yu per l&#39;assistenza tecnica. DCN è supportato anche da finanziamenti degli Stati Uniti Dipartimento della Difesa (DR080205, DM102823, OR09055 e OR090059). RDH è sostenuto da una borsa di studio dalla stazione Maryland Experiment agricoltura e una borsa di formazione NIH in Biologia Cellulare e Molecolare.

1. Determinare le condizioni di riscaldamento ottimale Primo, si deve determinare sperimentalmente la temperatura ottimale di incubazione e tempo da utilizzare per la fase di riscaldamento nel saggio. Per il nostro modello PlyC, è importante notare che E. coli co-trasformate con geni plyCA e plyCB su plasmidi di espressione separati è stato mostrato per formare un holoenzyme completamente funzionale PlyC 6. Il 96 ben preparato micropiastra nonché condizioni di crescita cellulare e la successiva tecnica replica plating sono state adattate da esempi forniti in letteratura 12-16. Un tempo di incubazione di 30 minuti sarà adatto a questo test come risulta da precedenti esperimenti di inattivazione termica dettare una rapida perdita di attività durante il breve periodo di incubazione in ambienti superiori a temperatura fisiologica (osservazioni non pubblicate). La temperatura di incubazione ottimale per PlyC stata chiarita dai seguenti passi: <ol><li> Transform l&#39;espressione costrutto pBAD24: plyCA (Amp r) nel competente E. coli ceppo DH5a pBAD33: plyCB (Cm r). </li><li> Piastra trasformanti su un Luria-Bertani (LB) agar integrato con ampicillina (100 ug / ml) e cloramfenicolo (35 mg / ml). Incubare le piastre per una notte a 37 ° C. </li><li> Con uno stuzzicadenti sterile, inoculare una colonia individuo in ogni fila di pozzetti (Figura 2a) in un contenitore sterile, chiaro, a fondo piatto da 96 pozzetti, con coperchio micropiastra che contiene 200 ml di LB integrato con ampicillina e cloramfenicolo. </li><li> Fissare posizionare la piastra a 96 pozzetti microtitolo su un 37 ° C agitando incubatore e far crescere i batteri durante la notte a 300 giri al minuto. </li><li> Recuperare la piastra a 96 pozzetti microtitolo da 37 ° C agitando incubatore e piastra replica a un nuovo 96 micropiastra così come segue: <ol class="lalpha"><li> Aggiungere 180 ml di LB integrato con ampicillina e cloramfenicoloa ciascun pozzetto della piastra di replica. </li><li> Trasferire 20 microlitri di batteri dalla piastra originale rispettivi pozzetti nella piastra replica. Ciò dovrebbe tradursi in un iniziale OD 600 di ~ 0.5. </li></ol></li><li> Fissare la piastra replica sul 37 ° C agitando incubatore e incubare la piastra per 1 ora a 300 giri al minuto, quindi aggiungere il inductant. Nel caso dei sistemi di espressione pBAD, il inductant è 0,25% arabinosio. Altri sistemi di espressione possono richiedere inductants diverse. Posizionare la piastra posteriore sul 37 ° C agitando incubatore e agitare a 300 rpm per un ulteriore 4 ore per consentire l&#39;espressione della proteina. I livelli di espressione in genere varia tra 10-20 mg di PlyC. </li><li> Una volta che l&#39;espressione della proteina è giunta alla conclusione, recuperare la piastra di replica e pellet i batteri mettendo la piastra a 96 pozzetti microtitolo in una centrifuga refrigerata che contiene un oscillante-Rotore che si adatta alle piastre da 96 microtitolazione bene. Centrifugare a 3000 rpm per 10 min a temperatura ambiente.</li><li> Rimuovere il surnatante supporti lentamente invertendo la micropiastra e delicatamente decantazione dei media. </li><li> Lisare le cellule aggiungendo 50 pl di reagente B-PER proteina batterica estrazione II a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Aumentare il volume di ciascun pozzetto a 120 microlitri con l&#39;aggiunta di 70 microlitri di tampone fosfato salino (PBS), pH 7,2. </li><li> Pellet i detriti cellulari insolubili facendo girare la piastra a 3000 rpm per 10 min a 4 ° C in centrifuga refrigerata. </li><li> Trasferire 110 microlitri del lisato grezzo solubile ai corrispondenti pozzetti di una piastra a 96 termociclatore bene. </li><li> 30 min usando il tempo di incubazione predeterminato, esporre i lisati solubili che risiedono nel pozzo 96 piastra termociclatore a un&#39;ampia gamma gradiente di temperatura 15-20 ° C. spanning Si noti, l&#39;obiettivo è quello di determinare a quale temperatura un particolare enzima perde&gt; l&#39;attività catalitica del 95%. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, incubare il 96 pozzettiPiastra termociclatore a 4 ° C per 5 minuti e trasferire 100 ul dei lisati solubili dalla piastra 96 ​​termociclatore bene alla loro posizione corrispondente nella finale micropiastra da 96 pozzetti. </li><li> Con un 12 canali multipipettor, aggiungere 100 microlitri di ceppo GAS D471 a ciascun pozzetto. Nota, D471 cellule sono originariamente liofilizzato da culture durante la notte e risospese con PBS pH 7.2 per ottenere un OD 600 di ~ 2.0. </li><li> Porre immediatamente la piastra a 96 pozzetti nello spettrofotometro per micropiastre e monitorare le cinetiche enzimatiche misurando la OD 600 ogni 15 sec per 20 min. L&#39;incubazione temperatura più bassa che corrispondeva a pozzetti che non avevano una variazione della densità ottica (AOD ≤ 0,1) è definita come la temperatura non permissive. </li></ol> Dopo una schermata di temperatura ampio viene eseguita per identificare la temperatura non permissive, i passi di cui sopra possono essere ripetute in un intervallo più stretto di temperature (5 ° -10 ° C) per chiarirel&#39;esatta temperatura non permissive per l&#39;enzima di interesse. Nota, la temperatura non permissive identificati in questo saggio può essere diverso rispetto alla temperatura di fusione chiarita con altri mezzi causa di differenze di volume, concentrazione, ecc 2. Generare la Biblioteca Mutant La creazione della libreria mutante da vagliare comporta casualmente incorporando le mutazioni da un soggetto a errori DNA polimerasi con una minima distorsione nucleotide nel gene plyCA utilizzando il kit di mutagenesi casuale GeneMorph II come segue: <ol><li> Progettare inneschi nucleotidiche con temperature di fusione simili (T m) tra 55-72 ° C con i siti di restrizione di scelta al 5 &#39;e 3&#39; del gene plyCA. </li><li> Dal momento che il tasso di mutazione desiderata è di 2-3 nucleotidi per plyCA (1,4 kb), utilizzare le concentrazioni dei componenti di reazione PCR e le condizioni termociclatore raccomandati dal produttore per f mutazione bassorequencies (0-4,5 per kb). </li><li> Clonare i geni mutagenizzate plyCA nel vettore di espressione pBAD24. </li><li> Trasformare i costrutti in un DH5a pBAD33: sfondo plyCB e trasformanti piastra su piastre di LB agar addizionato con ampicillina e cloramfenicolo. </li><li> Inoltre, la trasformazione e la piastra DH5a pBAD33: plyCB con il vettore di espressione contenente il gene pBAD24 WT plyCA. Le colonie di questa piastra serviranno da controlli durante lo screening. </li></ol> 3. 96 pozzetti Micropiastra Preparazione e condizioni di crescita delle cellule <ol><li> Riempire ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetto di microtitolazione con 200 pl di LB supplementato con ampicillina e cloramfenicolo. </li><li> Seguendo lo schema micropiastra (Figura 2b), selezionare con attenzione una colonia individuo dalle piastre di agar durante la notte con uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare i batteri nel pozzetto designato del 96 pozzetti microtitolo plate. È essenziale garantire una sola colonia per pozzetto viene inoculato. </li><li> Agitare il saldamente ancorato microtitolo da 96 pozzetti a 300 rpm notte a 37 ° C. </li></ol> 4. Replica Placcatura, Espressione induzione delle proteine ​​e Preparazione del lisato <ol><li> Seguire i passaggi 1,5-1,11 nella sezione intitolata &quot;Determinazione delle condizioni ottimali di riscaldamento&quot; con una modifica. Conservare la piastra originale a 4 ° C dopo la fase di replicazione delle piastre ha concluso. </li><li> Dopo passo 1,11, trasferimento 110 microlitri del lisato grezzo solubile ai corrispondenti pozzetti di una piastra a 96 termociclatore bene tranne per il controllo positivo pozzetti A1-D1. Per quanto riguarda i lisati di controllo positivo (lisati cioè non riscaldati), 100 pl trasferimento dei lisati ai corrispondenti pozzetti in una nuova 96 micropiastra bene che servirà come piastra di saggio finale per l&#39;esperimento e memorizzare su ghiaccio. </li></ol> 5. Solubile Trattamento Termico del lisato <ol><li> Riscaldare il controllo negativo e solubile mutante lisati attualmente confinato nella piastra 96 ​​termociclatore bene nel termociclatore per 30 min al ottimizzato non permissivo temperatura di incubazione determinata nel passaggio 1. </li><li> Dopo non permissivo temperatura di incubazione, incubare la piastra a 96 pozzetti termociclatore a 4 ° C per 5 min. </li><li> Trasferire 100 ul dei lisati solubili dalla piastra 96 ​​termociclatore pure alle loro posizioni identiche nella finale 96 pozzetti microtitolo saggio già contenente i lisati controllo positivo solubili. </li><li> Con un 12 canali multipipettor, aggiungere 100 microlitri di ceppo GAS D471 a ciascun pozzetto. Porre immediatamente la piastra nello spettrofotometro per micropiastre. </li><li> Monitorare le cinetiche enzimatiche misurando la OD 600 ogni 15 sec per 20 min. <ol class="lalpha"><li> Una variante PlyC con progredito comportamento termico è definito come un costrutto che può diminuire la densità ottica originale del 50 percento in meno di 900 secondi alnon permissivo temperatura. Inoltre, i controlli positivi (cioè non riscaldata, WT PlyC) necessario visualizzare WT attività catalitica (t 1/2 ≤ 100 sec) e controlli negativi (ossia riscaldata, WT PlyC) dovrebbe essere privo di attività. </li></ol></li><li> Una volta che una variante PlyC con progredito comportamento termico è identificato, recuperare la piastra originale conservato a 4 ° C e batteri inoculare dall&#39;individuo ben specifica al mutante di interesse in mezzi freschi LB addizionato con ampicillina e cloramfenicolo. Crescere l&#39;inoculo notte a 37 ° C. </li><li> Estrarre e purificare il DNA plasmidico dalla cultura e quindi inviare per il sequenziamento al fine di individuare le mutazioni nucleotidiche che dedurre una migliore comportamento termico a PlyCA. Inoltre, integrare una piccola aliquota della coltura durante la notte con 10% glicerolo e conservare a -80 ° C per un ulteriore uso. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo, illustrato in figura 1, presenta una metodologia ben 96 micropiastra che permette di utilizzare evoluzione diretta ad aumentare la termostabilità di qualsiasi enzima bacteriolytic. Attraverso l&#39;uso di un soggetto a errori DNA polimerasi, si possono introdurre mutazioni casuali che aumentano la stabilità cinetica della molecola tradotto bacteriolytic di interesse, che è tipicamente dovuta a riorganizzazioni molecolari costituiti aumentando elettrostatica, ponte disolfuro e interazioni idrofobiche che generano migliorata imballaggio molecolare, modifiche avanzate di reti di carica di superficie o il rafforzamento di uno stato di oligomerizzazione maggiore 17-18. Dopo l&#39;introduzione di mutazioni nucleotidiche, una procedura di screening esteso è stato poi utilizzato per identificare mutazioni che sono termicamente benefico. I risultati rappresentativi qui presentate sono basate su un round di mutagenesi casuale. In realtà, è stato suggerito chealmeno tre cicli successivi di mutagenesi casuale, ciascuno utilizzando il mutante più robusto come enzima piombo, seguito da rimescolamento del DNA è appropriato per questi tipi di studi diretti comportamento evoluzione termica 2. E &#39;importante capire che, mentre questo protocollo identifica mutazioni che aumentano la stabilità cinetica, queste varianti non necessariamente sono aumentati termostabilità. Una molecola è considerata termostabile quando si ha la capacità di mantenere la sua struttura ad alta temperatura. Tuttavia, nel saggio presentato, l&#39;attività residua dei lisati mutanti non sono saggiati alla stessa temperatura che erano inizialmente incubate a durante la fase di trattamento termico e quindi uno può essere selezionato per mutazioni che promuovono refolding anziché termostabilità maggiore 19. Mentre stiamo estrapolando comportamento termico come indicazione di stabilità termica, stabilità termica vera deve essere misurata empiricamente biophysmetodi ical quali dicroismo circolare (CD), calorimetria a scansione differenziale (DSC) e la scansione differenziale fluorimetria (DSF). I dati preliminari di esperimenti di CD e DSF suggeriscono che numerosi candidati individuati dalla metodologia presentata effettivamente visualizzare termostabilità progredito (dati non riportati). Anche se la metodologia qui presentata è specifico per l&#39;attuazione aumentato comportamento termico a PlyC, questo stesso metodo può inoltre essere impiegato per migliorare l&#39;attività termica ad altri enzimi bacteriolytic con alcune piccole modifiche alle variabili come tamponi, i tassi di mutazione, le condizioni di riscaldamento e sistemi di espressione. Una variabile critica associato con questo saggio si riferisce al tasso di mutazione del nucleotide error-prone DNA polimerasi. Abbiamo scelto di utilizzare il soggetto a errori Mutazyme DNA polimerasi II nel nostro saggio evoluzione diretta a causa di evidenze sperimentali suggeriscono questo particolare enzima mostra il minor numero di errori conriguarda nucleotidi che sono casualmente incorporati nel gene di interesse rispetto ad altre tecniche di mutagenesi random, quali l&#39;uso di idrossilammina, mutator E. coli e altri soggetti a errori DNA polyermases 20. In generale, i tassi di mutazione inferiori tendono ad essere più desiderabile per due ragioni. Primo, termostabilità ingegneria a proteine ​​costituito tipicamente relativamente poche sostituzioni di amminoacidi. Tassi di mutazione elevate possono causare drammatici alterazioni strutturali a particolari molecole che possono causare definitivamente misfolding strutturale e differenze funzionali. Ad esempio, l&#39;incorporazione di glicina e residui di prolina può disturbare alfa strutture elicoidali secondarie 21. In secondo luogo, gli alti tassi di mutazione nucleotidiche aumentare le possibilità di incorporare prematuri codoni di stop, con conseguente molecole tronche che sono biologicamente inattivo. In generale, i tassi di mutazione più bassi sono da preferire in quanto risultato di errore inferiore tassi nel accumulzione delle mutazioni adattive mentre i tassi più elevati di mutazione generare mutazioni neutrali o deleterio 22. Per ogni ciclo di mutagenesi casuale, un&#39;altra variabile critica che si deve ottimizzare comporta la temperatura di incubazione usato durante il processo di screening. Selezione del sperimentale non permissivo temperatura è relativamente difficile. Inizialmente abbiamo usato una temperatura di incubazione, che era di 10 ° C superiore alla temperatura non permissiva di PlyC, però dopo aver visionato 3000 mutanti, siamo stati in grado di individuare eventuali mutazioni vantaggiose. Tenendo presente metodologie evoluzione diretta consistono di identificazione sequenziale benefiche sostituzioni amminoacidiche che hanno effetti additivi, è stato determinato che una temperatura meno stringente deve essere usato durante il processo di screening anche se è aumentata la probabilità di generare falsi positivi. Come tale, abbiamo utilizzato una temperatura di incubazione era solo pochi gradi sopra la non pressione maxtemperatura ive e ricontrollati candidati selezionati per escludere i falsi positivi. Abbiamo deciso di utilizzare una temperatura di incubazione che non era troppo temperato (≤ 1 ° C superiore a quella minima non permissivo temperatura) e viceversa non troppo duro (≥ 5 ° C superiore a bassa temperatura non permissive). La temperatura ideale abbiamo deciso di utilizzare in questa particolare dosaggio era un moderato 2 ° C superiore al determinato sperimentalmente non permissivo temperatura. Scegliendo una temperatura troppo mite si tradurrà in un più alto tasso di falsi positivi identificazione del ~ 20% abbiamo osservato (Tabella I) quando si utilizza una temperatura moderata incubazione. Inoltre, utilizzando una temperatura di incubazione che è troppo dura potrebbe concludersi con l&#39;incapacità di identificare mutanti con significativamente migliorato comportamento termico. Ad esempio, utilizzando una temperatura di incubazione di ≥ 5 ° C avrebbe comportato l&#39;impossibilità di individuare ilpromettendo mutante 29C3 così come la maggior parte degli altri candidati selezionati durante il primo round di screening. In sommatoria, forniamo un protocollo per enzimi di ingegneria bacteriolytic per acquisire una migliore stabilità cinetica. Inoltre, questo saggio stesso, senza le fasi di riscaldamento, può essere usato per individuare mutazioni che aumentano l&#39;attività catalitica. Aumentare sia l&#39;attività catalitica e stabilità termica è un ostacolo importante allo sviluppo di fronte a qualsiasi enzima terapeutico. Mentre i dettagli di questo protocollo sono specifiche del PlyC endolysin, il metodo può essere adattato a qualsiasi enzima bacteriolytic con solo alcune modifiche. Abbiamo presentato risultati preliminari dal solo primo ciclo di mutagenesi che convalida la funzionalità del test, con conseguente attuazione e l&#39;identificazione di mutazioni che generano un aumento termostabilità molecolare di rilevante entità.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> B-PER II proteica batterica reagente di estrazione </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78260 </td></tr><tr><td> GeneMorph II Kit mutagenesi casuale </td><td> Agilent Technologies </td><td> 200500 </td></tr><tr><td> Cancella 96 pozzetti, fondo piatto piastra con un coperchio </td><td> BD Vacutainer Labware Medical </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96 Piastre PCR Bene Nonskirted </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td> Rotore basculante </td><td> Eppendorf </td><td> A-2-DWP </td></tr><tr><td> Ampicillin Sodium Salt </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td></tr><tr><td> Cloramfenicolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP904 </td&gt; </tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> pBAD24 vettore di espressione </td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> pBAD33 vettore di espressione </td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

Evoluzione diretta è definito come un metodo per sfruttare selezione naturale per ingegnerizzare proteine ​​di acquisire proprietà particolari che non sono associati con la proteina in natura. La letteratura ha fornito numerosi esempi per quanto riguarda l&#39;attuazione di evoluzione diretta a modificare con successo specificità molecolare e catalisi 1. Il vantaggio principale di utilizzare evoluzione diretta anziché più razionale approcci per l&#39;ingegneria molecolare riguarda il volume e la diversità delle varianti che possono essere proiettati 2. Una possibile applicazione di evoluzione diretta consiste nel migliorare la stabilità strutturale di enzimi bacteriolytic, come endolysins. Batteriofago codificare ed esprimere endolysins di idrolizzare un legame covalente critica nel peptidoglicano (cioè della parete cellulare) di batteri, con conseguente lisi della cellula ospite e la liberazione dei virioni progenie. In particolare, questi enzimi hanno la capacità di indurre lisi estrinsecamente a susceptbatteri commestibili in assenza di fago ed inoltre sono stati convalidati in vitro e in vivo per il loro potenziale terapeutico 3-5. L&#39;oggetto del nostro studio coinvolge l&#39;evoluzione diretta PlyC endolysin, che è costituito da subunità PlyCA e PlyCB 6. Quando purificata e ha aggiunto estrinsecamente, il holoenzyme PlyC lisa streptococchi di gruppo A (GAS), così come altri gruppi di streptococchi in una manciata di secondi e, inoltre, è stato validato in vivo contro GAS 7. Significativamente, il monitoraggio cinetica enzimatica residua dopo incubazione di temperatura elevata e di distinte prove che perde PlyC attività litica bruscamente a 45 ° C, suggerendo una vita breve terapeutico, che può limitare lo sviluppo ulteriore di questo enzima. Ulteriori studi rivelano la mancanza di stabilità termica è osservato solo per la subunità PlyCA, mentre la subunità PlyCB è stabile fino a ~ 90 ° C (osservazioni non pubblicate). Oltre a PlyC, ci sono several esempi in letteratura che descrivono la natura termolabile di endolysins. Per esempio, il endolysin LysK Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 e Pal perdere attività spontaneamente a 42 ° C, 43,5 ° C e 50,2 ° C, rispettivamente 8-10. Secondo l&#39;equazione di Arrhenius, che riguarda la velocità di una reazione chimica alla temperatura presente nel sistema particolare, un aumento termostabilità si correlano con un aumento della speranza shelf life 11. A questo fine, evoluzione diretta ha dimostrato di essere un utile strumento per alterare l&#39;attività termica di varie molecole in natura, ma non ha mai questa particolare tecnologia state sfruttate con successo per lo studio di enzimi bacteriolytic. Allo stesso modo, i conti di successo del processo di attuazione della stabilità strutturale di questa particolare classe di antimicrobici tutto sono inesistenti. In questo video, ci avvaliamo di una nuova metodologia che utilizza un errore-pruno polimerasi DNA seguita da un processo di screening ottimizzato utilizzando un formato a 96 pozzetti di micropiastre per identificare mutazioni della subunità PlyCA del endolysin PlyC streptococcica che correlano ad un aumento della stabilità cinetica enzimatica (Figura 1). I risultati dopo un solo giro di mutagenesi casuale suggerisce la metodologia sta generando varianti PlyC che conservano più di due volte l&#39;attività residua rispetto al wild-type (WT) PlyC dopo il trattamento temperatura elevata.

Al termine del primo turno di mutagenesi casuale, oltre 6.000 PlyC mutanti sono stati selezionati e un totale di 35 mutanti con potenziale aumentato comportamento termico sono stati individuati, selezionati e sequenziati. Analisi genomica, riassunti nella Tabella I, suggerisce che dei 35 candidati, 7 dei costrutti WT sequenze contenute PlyCA a livello della traduzione, corrispondente a falsi positivi identificati dal test. Dei rimanenti 28 candidati, la gamma mutazione era 1-6 mutazioni nucleotidiche con un tasso di mutazione medio di 2,75 nucleotidi per plyCA gene, che si trovava nel campo di 2-3 mutazione nucleotidica eravamo targeting. A livello traduzionale, questa particolare mutazione nucleotidica e frequenza ha prodotto un amino acido gamma mutazione di 1 a 5 amminoacidi, con un tasso di mutazione media di 1,9 mutazioni aminoacidiche per PlyCA polipeptide. Dei 28 candidati con almeno un amminoacido Mutatione, quattro di questi costrutti mutanti sono stati scelti casualmente per l&#39;ulteriore caratterizzazione per verificare che il processo di screening estensivo della metodologia evoluzione diretta era effettivamente funziona correttamente. Gli enzimi mutanti PlyC state purificate ad omogeneità&gt; 95% sulla base delle analisi SDS-PAGE come precedentemente descritto 6-7. Cinetica enzimatica di WT PlyC e ciascuno dei quattro mutanti PlyC stati caratterizzati pari a concentrazioni molari dopo incubazione enzimi purificati a varie temperature elevate. Attività è stato monitorato dopo aggiunta di D471 GAS misurando la densità ottica a 600 ogni 15 nm a 20 min sec. L&#39;attività è stata definita come la velocità massima residua dell&#39;enzima dopo incubazione di calore. Dei quattro candidati scelti casualmente per l&#39;ulteriore caratterizzazione, mutante 29C3 mostrato il comportamento più avanzato termico. Il comportamento termico di WT PlyC e 29C3 stata studiata a diverse temperature, mentre incubando e saggiare per l&#39;attività in PBS pH 7,2 a80 Nm e 40 concentrazioni nM, rispettivamente. Gli esperimenti 45-50 ° C incubazione (Figura 3) sono state eseguite in un termociclatore dove sono state incubate i campioni in una parete sottile piastra 96 termociclatore bene in un volume totale di 120 microlitri. Il 35 ° C, 40 ° C e 45 ° C esperimenti di incubazione (Figura 4 e 5) sono state eseguite in un blocco di calore in cui i campioni sono stati incubati in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml in un volume totale di 1,3 ml. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. WT PlyC e 29C3 mostrato alcuna differenza significativa nella stabilità cinetica a temperatura ambiente (25 ° C) come descritto nel primo gruppo di barre in figura 3. Tuttavia, dopo un breve periodo di incubazione per 30 minuti da temperature comprese tra 45-50 ° C, l&#39;attività di 29C3 era sostanzialmente maggiore attività specifica al WT costruire temperatura in ogni punto. Per esempio, WT PlyC visualizzata una perdita del 44% dell&#39;attività al 45,2° C mentre 29C3 mostrato solo una perdita del 2% in attività alla stessa temperatura. Studi a lungo termine incubazione paragonando l&#39;attività residua sia PlyC WT e 29C3 state addizionalmente effettuata a 35 ° C e 40 ° C che coinvolge la misurazione di attività residua a 24 e 48 punti temporali hr. A 35 ° C, 41% 29C3 visualizzato e attività 176% rispetto WT PlyC a 24 e 48 ore di incubazione punti temporali, rispettivamente (figura 4a). A 40 ° C, 28% 29C3 visualizzato e attività 107% rispetto WT PlyC a 24 e 48 ore di incubazione punti temporali, rispettivamente (Figura 4b). L&#39;attività residua di WT PlyC e 29C3 stata controllata anche ogni 20 min per un totale di 3 ore a 45 ° C. WT PlyC stato solo in grado di trattenere il 21% di attività dopo una incubazione 3 ore a questa temperatura, mentre 29C3 è stato in grado di trattenere il 46% di attività. L&#39;emivita (t 1/2) per WT PlyC e 29C3 erano 67 e 147 minuti, rispettivamente, suggeriscono<html> zione che 29C3 ha un 2,2 volte più elevata stabilità cinetica a 45 ° C (Figura 5). <table border="1"><tbody><tr><td> Totale Round 1 Candidati </td><td> 35 </td></tr><tr><td> I candidati con sequenza WT PlyCA </td><td> 7 </td></tr><tr><td> I candidati con ≥ 1 Mutazione Amino Acid </td><td> 28 </td></tr><tr><td> - Tariffa Media Mutation nucleotidi (nt / plyCA) </td><td> 2,75 </td></tr><tr><td> - Gamma mutazione nucleotidica (nt) </td><td> 1-6 </td></tr><tr><td> - Media Mutation Amino Acid Tasso (AA / PlyCA) </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td> - Gamma Amino Acid Mutazione (AA) </td><td> 1-5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Candidato Pool analisi genomica. pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Regia metodologia di analisi l&#39;evoluzione. Nel evoluzione diretta, si parte con l&#39;enzima di piombo, che sarebbe PlyC WT per il primo turno. Una libreria di mutanti PlyC contenenti mutazioni casuali imparziali nucleotidiche del gene plyCA viene costruito da un soggetto a errori DNA polimerasi, clonato nel vettore di espressione pBAD24 e trasformato in E. coli ceppo DH5a già contenente pBAD33:. plyCB trasformanti individuali vengono inoculati nel loro specifico proprio pozzetto di una piastra a 96 pozzetto della micropiastra. Attraverso un processo di screening ampio, singoli mutanti PlyC che sono cataliticamente attivo dopo incubazione a una temperatura non ammissibile sono classificati come mutanti con maggiore stabilità cinetica. Theconstruct visualizzare il comportamento più progredito termica diventa di conseguenza l&#39;enzima principale per il prossimo ciclo di mutagenesi casuale. Nel complesso, ci sono tre giri completi di random mutagenesi seguito da rimescolamento del DNA causando una molecola bacteriolytic con evoluto comportamento termico. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> Figura 2. 96 pozzetti microtitolo modelli per il dosaggio evoluzione diretta. Lo schema micropiastra durante la determinazione delle condizioni ottimali di riscaldamento (Figura 2a) consiste di inoculando un singolo clone parentale WT PlyC in ciascuna riga della micropiastra. Lo schema micropiastra durante lo screening mutante (Figura 2b) consiste di inoculo ciascun pozzetto della colonna 1 con un unico clone parentale WT PlyC così come inoculo in ciascun pozzetto colonne 2-12 con un distinto clone PlyC mutante. Wells A1-D1 sono designati per i controlli positivi dei genitori, che coPretendi di WT PlyC non costrutti esposti a non consentita temperatura di incubazione. Wells E1-H1 sono designati per i controlli negativi parentali, che consistono di WT PlyC costrutti che sono esposti a non ammessa temperatura di incubazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> Figura 3. Analisi dell&#39;attività cinetica residua confronto WT PlyC e 29C3. Enzimi sono purificati ad omogeneità e incubate per 30 minuti in un termociclatore a concentrazioni molari uguali ai due temperatura ambiente o ad un gradiente di temperatura da 45-50 ° C. Enzimatica correla con la massima velocità visualizzata dopo incubazione temperatura specifica. Con l&#39;eccezione di 25 ° C e 47,7 ° C, la variazione di attività tra WT e 29C3 a ciascuna temperatura correlata ad un valore p &lt;0,05. Tutti i dati sono riportati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> Figura 4. Analisi dell&#39;attività cinetica residua confronto WT PlyC al 29C3 a 35 ° C e 40 ° C. Le concentrazioni molari di pari purificato WT PlyC 29C3 e sono stati incubati in un blocco di calore a 35 ° C (Figura 4a) o 40 ° C (Figura 4b). L&#39;attività enzimatica residua è stata misurata a 24 e 48 punti temporali hr. L&#39;attività visualizzata da ciascun costrutto è stato normalizzato alla velocità massima visualizzata al tempo zero punto. La variazione di attività tra WT e 29C3 in ogni punto la temperatura e il tempo correlato ad un valore di p &lt;0.05. Tutti i dati sono riportati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> Figura 5. Attività di analisi cinetica residua a confrontoWT PlyC al 29C3 a 45 ° C. Le concentrazioni molari di pari purificato WT PlyC 29C3 e sono stati incubati in un blocco di calore a 45 ° C e l&#39;attività enzimatica residua è stata misurata ogni 20 minuti per 3 ore. L&#39;attività visualizzata da ciascun costrutto è stato normalizzato alla velocità massima visualizzata al tempo zero punto. Con l&#39;eccezione dei punti dati a 20 min, la variazione di attività tra WT e 29C3 ad ogni tempo correlato ad un valore p &lt;0,05. Tutti i dati sono riportati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.

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A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes | Immunology and Infection | Video

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Un nuovo metodo evoluzione diretta specifico campo dell&#39;ingegneria termostabilità stato sviluppato e validato per conseguenza enzimi bacteriolytic. Dopo un solo ciclo di mutagenesi casuale, un enzima evoluta bacteriolytic, PlyC 29C3, visualizzato superiore a due volte l&#39;attività residua rispetto alla proteina wild-type, dopo incubazione temperatura elevata.

Un nuovo metodo di screening per l&#39;Evoluzione diretta di enzimi termostabili bacteriolytic

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

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17.8K Views.  University of Maryland. Un nuovo metodo evoluzione diretta specifico campo dell'ingegneria termostabilità stato sviluppato e validato per conseguenza enzimi bacteriolytic. Dopo un solo ciclo di mutagenesi casuale, un enzima evoluta bacteriolytic, PlyC 29C3, visualizzato superiore a due volte l'attività residua rispetto alla proteina wild-type, dopo incubazione temperatura elevata.

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Metodo di particelle agglutinazione per l&#39;identificazione Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Selezione di Plasmodium falciparum Parassiti per Cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Una strategia rapido per l&#39;isolamento di nuovi Faustoviruses da campioni ambientali Utilizzando<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Analisi di co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori e gli enzimi

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

Visualizzazione del peptide batterico per la selezione di nuovi enzimi biotinylami

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...