Supportato da sovvenzioni NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​la Fondazione Hartwell, e la Fondazione Doris Duke Charitable. Dr. Paczesny è un investigatore della Hartwell Eric fondo e il programma di ricerca Amy Strelzer Manasevit.

1. Esperimento Giorno 0: Preparazione del campione e rivestimento di test ELISA Piastra con Anticorpo di cattura per IL-2Rα, REG3α e HGF <ol><li> Aliquote di campioni di plasma da analizzare viene tirato, scongelati e centrifugato a 12.000 rpm per 10 minuti per separare i coaguli in basso e lipidi sopra dal plasma. 150 pl di plasma non diluito saranno piastrate da ciascun campione su un 96-ben-V piastra inferiore (piastra sorgente) pipettando manuale secondo mappe predefinite. Le aliquote saranno avvolti in parafilm e mantenute in una camera umida a 4 ° C durante l&#39;intero processo, non più di 72 ore. </li><li> IL-2Rα e anticorpi di cattura HGF sarà ricostituito e diluito specifiche del costruttore e 50 pl saranno piastrate in ciascun pozzetto di rispettivi 96 pozzetti alta binding mezzo pozzetti quali vengono sigillati ed incubate per una notte a 4 ° C. In alternativa, le piastre possono essere molti essiccato a 37 ° C e conservato a 4 ° C per un uso successivo, dipendonozione sulla stabilità della proteina. </li><li> Anticorpo di cattura REG3α sarà diluito secondo il protocollo del produttore utilizzando un tampone di rivestimento fabbricante e 25 pl saranno piastrate in ciascun pozzetto di una a 384 pozzetti Nunc Maxi-Sorp piastra che viene quindi sigillato e incubate per una notte a 4 ° C. </li></ol> 2. Esperimento Giorno 1: IL-2Rα ELISA (Figura 1) <ol><li> L&#39;IL-2Rα targa di prova viene lavata, bloccata con Blotto in TBS, e lo standard è ricostituito e un 8-punto della curva standard viene preparata protocollo del produttore. </li><li> Dopo lavaggio della piastra dopo la fase di bloccaggio, 50 microlitri di plasma non diluito è placcato in duplicato dalla piastra sorgente alla piastra test ELISA, e 50 pl di ciascuno standard è placcato in duplicato. La piastrina è sigillata e incubata per 2 ore a temperatura ambiente su un rotatore piastra fissata a 300 rpm. </li><li> Il plasma viene recuperato dalla IL-2Rα piastra test ELISA e rimesso nelle Nazioni Unitediluito fonte piastra plasma. L&#39;ELISA è completato da protocollo produttore (con volumi regolate per mezzo pozzetti) e la densità ottica di ciascun pozzetto sarà letto utilizzando un lettore di piastre insieme a 450-570 nm, ed i dati memorizzati e analizzati. </li></ol> 3. Esperimento 1 ° giorno: REG3α ELISA (Figura 1) <ol><li> 10 microlitri di plasma non diluito viene trasferito in un separato v-bottom piastra sorgente. 90 microlitri di tampone fornito dal produttore di diluizione viene aggiunto a ciascun pozzetto per creare una piastra sorgente diluizione 1:10. </li><li> L&#39;ELISA REG3α viene eseguita per protocollo del produttore (con volumi regolato per piastre a 384 pozzetti) e la densità ottica di ciascun pozzetto sarà letto utilizzando un lettore di piastre impostato a 450-620 nm, ed i dati vengono memorizzati e analizzati. </li></ol> 4. Esperimento 1 ° giorno: Elafin e rivestimento di prova TNFR1 Piastra con Anticorpo di cattura <ol><li> Elafin e anticorpi di cattura TNFR1 sarà ricostituito e dilbuite per specifiche del costruttore e 50 microlitri si piastrate in ciascun pozzetto di rispettivi 96 pozzetti alta binding mezzo pozzetti quali vengono sigillati e incubate per una notte a temperatura ambiente per Elafin, ed a 4 ° C per TNFR1. </li></ol> 5. Esperimento Giorno 1-2: HGF ELISA (Figura 1) <ol><li> Dopo aver completato l&#39;IL-2Rα ELISA e assicurando la prova non ha bisogno di essere ripetuto, 60 microlitri di plasma non diluito viene trasferito in una nuova piastra sorgente e poi 60 ml di 1% BSA in PBS 1 x viene aggiunto a ciascun pozzetto per fare una 01:02 diluito plasma piatto di origine. </li><li> La piastra di prova HGF viene lavata, bloccata con Blotto in TBS, e lo standard è ricostituito e un 8-punto della curva standard viene preparata protocollo del produttore. </li><li> Dopo aver lavato la piastra dopo la fase di blocco, 50 pl di 1:2 plasma diluito è placcato in doppio con il piatto test ELISA, e 50 ml di ogni standard è placcato in duplice copia. La piastra è sigillato eincubate per una notte a temperatura ambiente su un rotatore piastra impostata a 300 RPM. </li><li> Il plasma diluito 1:02 venga recuperato dalla piastra HGF test ELISA e rimesso nel piatto 1:02 diluito fonte di plasma. L&#39;ELISA è completato da protocollo produttore (con volumi regolate per mezzo pozzetti) e la densità ottica di ciascun pozzetto sarà letto utilizzando un lettore di piastre insieme a 450-570 nm, ed i dati memorizzati e analizzati. </li></ol> 6. Esperimento 2 ° giorno: Elafin ELISA <ol><li> 10 microlitri di plasma non diluito viene trasferito in una nuova piastra sorgente e quindi 190 ml di 1% BSA in PBS 1 x viene aggiunto a ciascun pozzetto per fare 200 pl di plasma dluted 1:20. </li><li> L&#39;ELISA Elafin come eseguita secondo il protocollo del produttore (con volumi regolato per mezzo pozzetti), e la densità ottica di ciascun pozzetto sarà letto utilizzando un lettore di piastre impostato a 450-570 nm, ed i dati memorizzati e analizzati. </li></ol> 7. Esperimento Day 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 pl di 1% BSA in PBS viene aggiunto alla piastra sorgente 1:20 (ora contenente 100 pl di plasma 1:20) per ottenere 125 ml di plasma diluito 1:25. </li><li> L&#39;ELISA TNFR1 è completato da protocollo produttore (con volumi regolate per mezzo pozzetti) e la densità ottica di ciascun pozzetto sarà letto utilizzando un lettore di piastre impostato a 450-570 nm, ed i dati memorizzati e analizzati. </li></ol> 8. Esperimento 2 ° giorno: IL-8 ELISA <ol><li> 60 pl di plasma diluito 1:02 sarà trasferito in una nuova piastra sorgente e quindi 180 ml di IL-8 diluente viene aggiunto a ciascun pozzetto per fare un 1:06 diluito piastra sorgente plasma. </li><li> L&#39;IL-8 ELISA è completato da protocollo produttore (con volumi regolate per mezzo pozzetti) e la densità ottica di ciascun pozzetto sarà letto utilizzando un lettore di piastre impostato a 450-570 nm, ed i dati memorizzati e analizzati. </li></ol> Una volta che tutti i saggi ELISA sono stati completati, disusod magazzino plasma sarà sostituito nelle aliquote scongelati e congelati per un uso futuro.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<html> Il metodo sequenziale ELISA qui presentato consente la misurazione delle proteine ​​plasmatiche multiple su piccoli volumi di plasma che possono essere difficili da ottenere e / o insostituibili come campioni di soggetti umani con malattie rare o campioni di plasma ottenuti da topi 9,10. I test ELISA sequenziali sono tipicamente eseguite nell&#39;ordine del fattore di diluizione del plasma aumentando, con ELISA richiedono plasma diluito ≥ 1:10 tipicamente non dover essere recuperato, anche se questo può essere fatto se desiderato. La possibilità di eseguire sequenziale ELISA è limitato dal kit ELISA / protocolli in cui si mischia il plasma con altri reagenti o per i quali tamponi diluizioni differenti sono necessari per il plasma, il che esclude la ablility di riutilizzare un campione a causa delle preoccupazioni che un incompatibili buffer / reagente interferire con le prestazioni di un determinato test. Un&#39;attenta progettazione, 10 o più metodica ELISA può essere eseguita sul campione di plasma stesso. ENT &quot;&gt; I singoli laboratori potrebbe essere necessario regolare diluizioni del plasma al fine di ottenere risultati interpretabili basati sulla concentrazione plasmatica attesi della proteina di interesse nei campioni da parte dei soggetti di prova. differenze di attrezzature di laboratorio può comportare la necessità di ottimizzare l&#39;incubazione e lo sviluppo colorimetrico volte, numero di lavaggi e / o lavare ammollo volte al fine di ottimizzare qualsiasi dato ELISA. Per aumentare alta produttività e precisione e capacità di effettuare analisi in un modo economicamente vantaggioso, l&#39;uso di una piattaforma di movimentazione robotica liquido capace di analisi su piastre a 384 pozzetti ed un lavatore automatico con unità di impilaggio sono raccomandati. Questo apparecchio può aumentare l&#39;accuratezza e la precisione di analisi eseguite da più utenti, e contribuire a garantire la coerenza di analisi per ridurre le inter-e intra-saggio di variazione. Abbiamo usato sequenziale ELISA su piattaforme multiplex disponibili per due motivi: 1) La maggior parte dellecoppie di anticorpi per nuove proteine ​​non possono essere facilmente essere coniugati in perline o altro materiale così come lunga e costosa, 2) i singoli test ELISA sono più precisi di microarray multiplex o perline, secondaria ad una assenza di reattività crociata 11. Se un metodo affidabile viene stabilita effettuare multiplexati, bead-based microarrays, può essere in grado di sostituire il processo sequenziale ELISA, ma può essere limitata dalla capacità di coniugare gli anticorpi per perline e / o dal numero di proteine ​​desiderate essere analizzato.

Acute graft-versus-host disease (GVHD), una delle principali cause di mortalità senza ricadute (NRM) dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT), viene misurata da una disfunzione in tre organi: la pelle, il fegato e gastrointestinali (GI) tratto 4. GVHD acuta si verifica in genere tra due e otto settimane dopo il trapianto, ma si può verificare in seguito, e spesso è clinicamente indistinguibile da altre post-HSCT complicanze quali la tossicità regime di condizionamento, infezioni o effetti collaterali dei farmaci. Attraverso l&#39;uso di strategie di proteomica e di high-throughput di convalida utilizzando sequenziale ELISA, abbiamo identificato 6 proteine ​​la cui concentrazione sono elevate al momento della comparsa di manifestazioni cliniche di GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF e IL-8, quando combinati in un 4-biomarker pannello può diagnosticare GVHD al momento della comparsa dei sintomi clinici e può prevedere post-trapianto sopravvivenza indipendentemente gravità GVHD 1. Elafin, un biomarker per GVHD della skin, in grado di discriminare tra eruzione GVHD e rash da altre cause, come eruzioni da farmaci e possono predire la sopravvivenza dei trapianti 2. Abbiamo recentemente identificato REG3α come biomarker di GVHD del tratto gastrointestinale inferiore, l&#39;organo bersaglio più associato con NRM. La concentrazione plasmatica di REG3α può identificare in modo affidabile GVHD come la causa per il post-trapianto diarrea e correlati alla gravità istologica di GVHD in diagnostici biopsie intestinali. Concentrazioni REG3α all&#39;esordio GI GVHD può anche prevedere la risposta alla terapia e GVHD NRM 3. L&#39;integrazione di questi biomarcatori convalidati GVHD in cura clinica è attualmente in fase di studio in studi clinici. Questi esperimenti sono stati eseguiti su piccole aliquote di plasma raccolti da pazienti sottoposti a trapianto tra il 2000 e il 2010, al momento di insorgenza GVHD che sono insostituibili e di quantità limitata. A causa della natura preziosa di questi campioni, abbiamo sviluppato un method di misurare concentrazioni di proteine ​​plasmatiche più in modo efficiente e riproducibile per eliminare eccesso di cicli gelo-disgelo, il tempo di scongelamento e l&#39;utilizzo del plasma. Questa tecnica può essere applicata per eseguire saggi ELISA per proteine ​​/ citochine multiple di interesse sullo stesso campione (s) fornito i campioni non devono essere miscelati con altri reagenti. Se kit ELISA non sono dotati di pre-rivestite piastre a 96 pozzetti mezzo pozzetti o 384 pozzetti può essere utilizzato per ridurre ulteriormente l&#39;uso di campioni / reagenti. Questo manoscritto si concentra sugli aspetti tecnologici di misurazione biomarcatori GVHD.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> IL-2 R alpha DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> Umano HGF DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> Umano IL-8 OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match MONTAGGIO umana PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL internazionale </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match kit universale </td><td> MBL internazionale </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Umano sTNFRI/TNFRSF1A DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Umano Trappin-2/Elafin DuoSet </td><td> R &amp; S Syderiva </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96 pozzetti in polistirene piastre inferiori coniche </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Usata per piatti di origine plasmatica </td></tr><tr><td> CoStar mezza e alta vincolanti piastre da 96 pozzetti </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> Per IL-2Rα, HGF, TNFR1 e elafin ELISA </td></tr><tr><td> 384 pozzetti Nunc MaxiSorp piastre </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> Per REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone Soluzione tampone fosfato, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Sieroalbumina bovina, Frazione V, shock termico trattato </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Blotto in TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> Agente bloccante per IL-2Rα HGF e TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> DulbeccoPBS </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> Tampone di lavaggio per IL-2Rα, HGF, Elafin e TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> Perossido Susbtrate TMB </td><td> Kirkegaard e Laboratori Perry </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> Tampone di lavaggio per IL-2Rα, HGF, Elafin e TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> Acido solforico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (Diluito a 2N) per la soluzione di stop </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Consigli proteomica scoperta strategie hanno la possibilità di identificare un gran numero di nuovi biomarker in grado di migliorare i test diagnostici e prognostici in ambito clinico e può aiutare a interventi terapeutici guida. Se la quantità di proteine ​​candidate sono identificati, può essere difficile per validare biomarcatori candidati in modo tempestivo ed efficace da campioni di plasma di pazienti che sono event-driven, di volume finito e insostituibili, come all&#39;inizio della acute graft-versus- host disease (GVHD), una complicazione potenzialmente pericolosa per la vita del trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT). Qui si descrive il processo di esecuzione ELISA commercialmente disponibili per sei proteine ​​convalidati GVHD: IL-2Rα 5, TNFR1 6, 7 HGF, IL-8 8, elafin 2, e REG3α 3 (noto anche come PAP1) in modo sequenziale per minimizzare cicli gelo-disgelo, Scongelati plasma nel tempo e l&#39;utilizzo di plasma. Per questa procedura si eseguire i test ELISA in ordine sequenziale come determinato dal fattore di diluizione del campione, come stabilito nel nostro laboratorio utilizzando quelle kit ELISA e protocolli con piccole modifiche per facilitare ottimali prestazioni sequenziali ELISA. I risultanti concentrazioni plasmatiche di biomarker possono essere raccolti e analizzati per i dati significativi emersi all&#39;interno di una coorte di pazienti. Mentre questi biomarcatori sono attualmente per scopi di ricerca, il loro inserimento nella cura clinica è attualmente in fase di studio in studi clinici. Questa tecnica può essere applicata per eseguire saggi ELISA per proteine ​​/ citochine multiple di interesse sullo stesso campione (s) fornito i campioni non devono essere miscelati con altri reagenti. Se kit ELISA non sono dotati di pre-rivestite piastre a 96 pozzetti mezzo pozzetti o 384 pozzetti può essere utilizzato per ridurre ulteriormente l&#39;uso di campioni / reagenti.

<html> Il flusso di lavoro biomarker e tempi indicati nella Tabella 1 e Tabella 2, rispettivamente. Una volta completato, le concentrazioni di 6 diverse proteine ​​sono state quantificate sullo stesso campione di plasma utilizzando un totale di 150 ml di plasma. Placcatura i campioni in duplicato per test consente di assicurazione interna della qualità, con il CV inferiore al 10% è ottimale. Per una esecuzione sequenziale ELISA su piatti più consistenti, densità ottica dello standard elevato sono preferiti e permette una migliore inter-piastra affidabilità delle misurazioni; curva standard OD può essere paragonato a cercare tra le piastre di valutare per incoerenza ELISA prestazioni (Figura 2). Tempi di sviluppo utilizzando tetrametilbenzidina substrato colorimetrico e alta concentrazione di OD osservato per ciascun biomarker nel nostro laboratorio sono elencati nella Tabella 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Flusso di lavoro per IL-2Rα, REG3α e HGF ELISA. Dopo che i campioni di plasma sono stati placcati sulle IL-2Rα targhe di prova ELISA che venga recuperato per fare piastre fonte di diluizione per l&#39;ELISA altri. Per l&#39;ELISA HGF, il plasma viene recuperato per preparare la piastra di diluizione 1:06 per IL-8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Densità ottiche per la curva standard di 7 piatti diversi ELISA misura concentrazioni REG3α corrispondenti ai 1084 pazienti testati per il primo biomarcatore REG3α GI relazione GVHD 3. DO coerente tra le piastre assicurare coerenti e proteine ​​di concentrazione tra le piastre. Le concentrazioni di proteinein campioni di plasma sono determinati confrontando densità ottica del campione per le densità ottiche della curva standard. <table border="1"><tbody><tr><td> Esperimento Giorno 0 </td><td> 1. Preparare i campioni </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF e REG3α cattura Ab </td></tr><tr><td> Esperimento 1 ° giorno </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (attraverso placcatura campione) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin e TNFR cattura Ab </td></tr><tr><td> Esperimento 2 ° giorno </td><td> 1. HGF ELISA completamento </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Ricongelare inutilizzatoplasma </td></tr></tbody></table> Tabella 1. GVHD Biomarker Panoramica del flusso di lavoro <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Giorno 0 </td><td colspan="3"> Preparazione del campione e pernottamento incubazione corpo cattura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Tempo (h) </td><td> 0,0 </td><td> Blocco </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Campioni argentati, dorati </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Reclaim campioni di plasma; rilevamento Ab </td><td> Blocco; Preparare i campioni (diluizione 1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> I campioni placcati (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidina-HRP </td><td> Rilevamento Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidina-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> Piastra di lettura </td><td> TMB </td><td> Blocco; Preparare i campioni (1:2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Piastra di lettura </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td> I campioni placcati (1:2) </td><td> Cattura Ab (incubazione per una notte) </td><td> Cattura Ab (incubazione per una notte) </td><td></td></tr><tr><td> Giorno 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tempo (h) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim plasma, rilevamento Ab </td><td> Blocco; Preparare i campioni (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Esempio di placcatura (1:2) </td><td> Blocco, un&#39;ulteriore diluizione di 1:20 campioni diluizione 1:25 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Esempio di placcatura (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Piastra di lettura </td><td> Rilevamento Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Preparare campioni (diluizione 1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Rilevamento Ab </td><td> Esempio di placcatura (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Piastra di lettura </td&gt; <td> HRP </td><td> Rilevamento Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Piastra di lettura </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Piastra lettura </td></tr><tr><td colspan="2"> Dopo il completamento </td><td colspan="6"> Sostituire plasma originario in aliquote e congelare per un uso successivo </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Timeline per l&#39;esecuzione di ELISA. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plasma Fattore di diluizione </td><td> Alta Concentrazione standard </td><td> Substrato Tempo di sviluppo (minuti) </td><td> Alta OD </td><td> Curva </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01:01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Lineare </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4-parametro </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4-parametro </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4-parametro </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 01:20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4-parametro </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Lineare </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Dettagli ELISA per 6 Biomarcatori GVHD.

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High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Convalida elevato throughput di biomarcatori candidati multipli può essere eseguita da ELISA sequenziale per minimizzare gelo / disgelo e l&#39;uso di campioni di plasma preziosi. Qui, dimostriamo come eseguire in sequenza ELISA per sei diversi biomarcatori plasmatici convalidati<sup&gt; 1-3</sup&gt; Di graft-versus-host disease (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; Il campione di plasma stesso.

High Throughput sequenziale ELISA per la convalida dei biomarcatori di acuta Graft-versus-host disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

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Medicine

15.7K Views.  University of Michigan. Convalida elevato throughput di biomarcatori candidati multipli può essere eseguita da ELISA sequenziale per minimizzare gelo / disgelo e l'uso di campioni di plasma preziosi. Qui, dimostriamo come eseguire in sequenza ELISA per sei diversi biomarcatori plasmatici convalidati 1-3 Di graft-versus-host disease (GVHD) 4 Il campione di plasma stesso.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Ricerca

Medicina

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal procedura chirurgica invasiva di indurre infarto miocardico nei topi

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput Caratterizzazione di cellule staminali adulte Engineered per consegna di fattori terapeutici per le strategie neuroprotettive

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

Studio In Vivo del metabolismo del glucosio nei topi di dieta-federazione di grassi utilizzando Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e Test di tolleranza dell'insulina (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...