Ringraziamo Amanda Rychel per l&#39;assistenza allo sviluppo del time lapse protocollo e Lynn Pillitteri per la costruzione :: POLAR POLAR-eGFP. Siamo anche grati a ABRC per la prestazione del pm-rb costruire. Questo protocollo è stato sviluppato attraverso un sostegno da parte del PRESTO premio da Giappone Scienza e Tecnologia Agenzia. La ricerca sulle POLAR è stata sostenuta anche dalla University of Washington Libera Research Fund (RRF-4098) e la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP è un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), ed è un KUT HHMI-GBMF investigatore.

1. Seed Sterilizzazione <ol><li> Preparare soluzione di sterilizzazione delle sementi: candeggina per uso domestico al 33%, 0.1% Triton X-100. </li><li> Semi place trasportano desiderato costrutto fluorescente reporter (s) e genotipo (s) in 1.7 ml e applicare 1 ml di soluzione di sterilizzazione. Incubare il nutator per 15 min. </li><li> In una cappa sterile, utilizzare una pipetta per rimuovere la soluzione di sterilizzazione da tubo, lasciando dietro di semi. Lavare con 1 ml di acqua sterile. Ripetere quattro volte. </li><li> Incubare a 4 ° C per due o più giorni. </li></ol> 2. Preparazione di Slide media Camera <ol><li> Mescolare 20 ml di soluzione 0,5% di Agar Bacto (non puro agarosio) in acqua in un pallone da 200 ml, e microonde fino a dissoluzione. Prestare attenzione durante l &#39;ebollizione della soluzione. </li><li> Raffreddare la soluzione a circa 60 ° C. </li><li> Raccogliere 1 ml di soluzione di agar con una pipetta e lentamente si applicano al vetro di copertura all&#39;interno della scatola di controllo (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Sistema vetrino tedesco). Soluzione which è troppo caldo o applicato troppo velocemente, potrebbe fondersi colla o vetro crack. </li><li> Immediatamente aggiungere un secondo ml di soluzione di agar. Agar dovrebbe coprire completamente il fondo della camera di scorrimento. Questo supporto minimo è sufficiente a sostenere lo sviluppo di un impianto di cotiledone, che contiene sostanze nutritive immagazzinate, per quattro o cinque giorni, mantenendo l&#39;umidità e permettendo la diffusione del gas. </li><li> Diapositiva Cool di banco con camera coperto. Se il pallone è coperto ermeticamente, soluzione può essere salvata e riscaldato per un uso futuro. </li></ol> 3. Seed Dissection <ol><li> Rimuovere il tubo di sementi sterili da 4 ° C di stoccaggio. </li><li> Mettere un fazzoletto di carta sul palco di un microscopio da dissezione e bagnare con acqua. Regolare tessuto per creare una superficie liscia. Tessuto viene utilizzato per stabilizzare semi per dissezione. </li><li> Pipettare 20-30 semi dal tubo al tessuto, avendo cura di disporli in campo di applicazione dissezione di vista. </li><li> Utilizzando pinze taglienti (Roboz, # 5 punta biologia), Rimuovere con cautela il cappotto di seme dall&#39;interno piantina. Sia tegumenti esterni e interni devono essere rimossi. </li><li> Quando l&#39;imaging del cotiledone, è utile per rimuovere l&#39;ipocotilo e radichetta. Cotiledoni contengono sostanze nutrienti sufficienti per sviluppare per diversi giorni ai sensi del presente protocollo. Se intatta, l&#39;ipocotilo si raddrizzano e allungare notevolmente, spostando il cotiledone fuori del campo di vista time lapse. Utilizzare un bisturi per tagliare i cotiledoni liberi dell&#39;ipocotilo. </li><li> Tenere cotiledoni sezionati immersi in acqua, in un microtubo o simili. </li><li> Ripetere 3,4-3,6 finché il numero desiderato di cotiledoni è raggiunto. 15-20 dissezioni di successo si raccomanda prima del montaggio. </li></ol> 4. Cotiledoni di montaggio nella diapositiva Camera <ol><li> Utilizzando un piccolo (18 mm 2) coprioggetto, tagliare i media agar e sollevare l&#39;intero livello fino dalla base in vetro della diapositiva Camera. </li><li> Pipettare sezionato cotiledoni con un minimo di acqua in possesso ditubo nella scatola di controllo, sotto lo strato di agar sollevato. </li><li> Abbassare delicatamente l&#39;agar sui cotiledoni. Se l&#39;acqua in eccesso è presente, distaccandosi con un fazzoletto di carta, facendo attenzione a non disturbare i cotiledoni. I campioni non dovrebbero più muoversi facilmente quando montaggio è completo. </li><li> Posizionare il coperchio sul vetrino della camera e slide passaggio alla fase microscopio. </li></ol> 5. Time Lapse Imaging <ol><li> Impostare invertito microscopio confocale per l&#39;immagine del fluoroforo desiderata (s). LSM700 parametri utilizzati: per la GFP, eccitazione a 488 nm e la raccolta con un filtro passa-banda a 440-530 nm, per la richiesta di offerta, eccitazione a 555 nm e la raccolta con un filtro passa-banda a 570-610 nm. </li><li> Controllare i campioni montati per danni. Programmare le posizioni dei intatte, montato correttamente cotiledoni nel software microscopio. Nello Zen 2009: Focus su un cotiledone con obiettivo 20x e spostare obiettivo al centro della scatola di controllo. In modalità di acquisizione, cambiare lo zoom a 0,5 e taglia &lt;/ Em&gt; di 48x48 pixel. Seleziona la casella Posizioni e panoramica immagine Scan ... pulsante sotto Posizioni, quindi aumentare il numero di piastrelle orizzontale e verticale a 30-35. Quando la scansione è completata, fare clic sul pulsante Posizioni nella scheda Dimensioni e mirino posto in ogni cotiledone ad osservare. </li><li> Impostare serie z che comprende l&#39;epidermide cotiledone di tutti Zen samples.In 2009: Fare clic sulla casella di controllo Z-Stack. Selezionare ogni posizione sotto Lista Posizione e fare clic sul pulsante Sposta. Concentrarsi sul piano superiore dell&#39;epidermide cotiledone e fare clic sul pulsante Prima Set in Z-Stack. Fuoco per la posizione più bassa in cui epidermide è utilmente visibile e fare clic sul pulsante Ultimo set. Fare clic sul pulsante accanto a ottimale, che mostra il miglior z-spessore di strato, per impostare. Controllare ogni cotiledone per confermare che le impostazioni comprendono tutti i campioni, i parametri z non può essere impostata per indivposizioni residuali in Zen 2009. </li><li> Impostare serie temporali a risoluzione desiderata e la lunghezza. Intervalli di 15-30 minuti per tre giorni sono efficaci per la dinamica della proteina nella divisione delle cellule dell&#39;epidermide. Questo intervallo può essere cambiata come necessario. Nello Zen 2009: Fare clic sulla casella di controllo di serie storica. In Time Series, impostare Cicli per il numero di immagini desiderate usando il cursore o digitando nel campo di testo. Imposta intervallo a 30 e utilizzare il menu a discesa per selezionare min. </li><li> Inizia xyzt multi-posizione di scansione. Si noti che il numero di posizioni deve essere limitato dalle specifiche di scansione, se il tempo di scansione totale è maggiore dell&#39;intervallo desiderato, i punti di tempo non sarà corretta. Un massimo di sei posizioni simultanee sono possibili quando l&#39;imaging GFP e RFP a 59 z-fette in un intervallo di 30 minuti con il nostro sistema. Nello Zen 2009: Grandezza Passare alla risoluzione desiderata e fare clic su Avvia esperimento. </li></ol> 6. Video Editing <ol><li> Dal file confocale di dati, fare una intensità massima z-proiezione di ogni tempo / posizione di combinazione e di esportazione di file di immagine in un formato lossless come TIFF. I nomi dei file devono essere in una serie per la posizione (ad esempio, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, ecc, non POLAR-GFP_0001_pos1) per il software per combinarli in un film. Nello Zen 2009: Copia Usa: Sottoinsieme nella scheda di elaborazione per dividere le posizioni in file separati, quindi di proiezione massima intensità. Infine, l&#39;esportazione in formato TIFF (File: Export, Full finestra immagine risoluzione - serie). </li><li> Utilizzare FIJI 7,8 per allineare le immagini successive eseguendo la macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Registrazione: bUnwarpJ). Modifica della modalità di registrazione su Mono. Tutte le Opzioni avanzate è possibile utilizzare i valori predefiniti. Per le lunghe sequenze time lapse, scaricare e installare la macro &quot;Affine + Coerentemente registrazione elastica Immagine 2D&quot;, che si applicherà bUnwarpJ ad una serie di immagini automaticamente, e aperto yi nostri dati utilizzando File: Import: Image Sequence di usarlo. Deselezionare MOPS estrazione punti di riferimento e di esecuzione. </li><li> Utilizzare FIJI / ImageJ o Quicktime Pro per aprire la sequenza di immagini allineate e salvare nel formato video desiderato (AVI è una buona scelta). </li></ol>

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	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64 (1983).</li><li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Mitosis+and+Morphogenesis:+Point+and+Counterpoint.">Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint.</a> Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. 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Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).</li><li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division,+Cell+Growth,+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis.">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. 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O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo time-lapse tecnica confocale per studi longitudinali di espressione della proteina fluorescente tag e localizzazione in singole cellule dell&#39;epidermide cotiledone Arabidopsis, che nel caso delle proteine ​​che cambiano dinamicamente POLARI e gli altri è fondamentale per una corretta comprensione della loro funzione. Precedentemente, sostenuta immagini time lapse è stato utilizzato per esaminare infezione fungina Arabidopsis radice 11 e crescita meristema 5,12, ma ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> One-camera di scorrimento </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> O due-camera (155379) </td></tr><tr><td> Microscopio a scansione laser confocale </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Zen 2009 software </td></tr><tr><td> 20x lente dell&#39;obiettivo </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0.8, Plan-Apochromat </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Benz (Nazionale) </td><td> 431TBL </td><td> Si illumina dal basso </td></tr><tr><td> # 5 pinze, biologia punta </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-4978 </td><td> Punte molto sottilisono critiche </td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

Imaging nella dinamica in vivo del comportamento cellulare durante una sequenza di sviluppo può essere una potente tecnica per capire la meccanica del patterning tessuto. Durante lo sviluppo degli animali, la proliferazione cellulare e gli eventi chiave di patterning avvenire molto rapidamente. Per esempio, in Caenorhabditis elegans tutte le divisioni cellulari necessarie per il piano di corpo larvale vengono completate entro sei ore dopo la fecondazione, con sette cicli mitotici 1; le mitosi sedici o più di embriogenesi Drosophila si verificano in meno di 24 ore 2. In contrasto, le divisioni cellulari durante lo sviluppo della pianta sono lenti, tipicamente dell&#39;ordine di un giorno 3,4,5. Questo impone una sfida unica e la necessità di lungo termine di imaging in tempo reale per documentare comportamenti dinamici di divisione cellulare e di eventi di differenziazione durante l&#39;organogenesi pianta. Epidermide Arabidopsis è un sistema eccellente modello per la segnalazione inquirenti, il destino della cellula, e lo sviluppo delle piante. Nel cotiledone, questo tessuto è composto da aria e ad acqua cellule resistenti pavimentazione intervallati da stomi uniformemente distribuito, valvole che si aprono e chiudono per controllare lo scambio di gas e la perdita di acqua. Spaziatura corretta di questi stomi è fondamentale per la loro funzione, e il loro sviluppo segue una sequenza di divisione asimmetrica e gradini di differenziazione cellulare per produrre l&#39;epidermide organizzata (Fig. 1). Questo protocollo permette l&#39;osservazione di cellule e proteine ​​nell&#39;epidermide più giorni di sviluppo. Questo lasso di tempo permette una precisa documentazione di cellule staminali divisioni e differenziazione delle cellule epidermiche, tra cui stomi e le cellule epidermiche pavimentazione. Proteine ​​fluorescenti possono essere fusi a proteine ​​di interesse per valutare la dinamica durante la divisione cellulare e processi di differenziazione. Questa tecnica permette di comprendere la localizzazione di una nuova proteina, POLAR 6, durante la fase di proliferazione di cellule di lignaggio stomatica-in the cotiledone epidermide Arabidopsis, in cui è espresso in cellule precedenti eventi divisione asimmetrica e si muove a una caratteristica zona della corteccia cella poco prima della divisione si verifica. Le immagini possono essere registrate e video razionalizzato facilmente realizzato utilizzando il software di pubblico dominio per visualizzare la localizzazione dinamica delle proteine ​​e tipi di cellule che cambiano nel corso del tempo.

<html> Una serie di punti temporali informativi raccolti con questo metodo è illustrato nella figura 3. Le membrane cellulari sono etichettati con RFP (pm-rb) e GFP è fusa alla proteina POLAR sotto il suo promotore nativo (POLAR :: POLAR-GFP) 6 A 30 minuti scala di tempo, vediamo divisioni cellulari con i cambiamenti nella localizzazione delle proteine precedute. Divisioni cellulari asimmetriche nella forma lignaggio degli stomi delle cellule staminali-come precursori chiamati stomi...

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Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Descriviamo un protocollo mediante diapositive da camera e media per immobilizzare cotiledoni di impianto per l&#39;imaging confocale dell&#39;epidermide più giorni di sviluppo, documentazione differenziazione stomatica. Proteine ​​fluoroforo-tag possono essere monitorati in modo dinamico attraverso l&#39;espressione e la localizzazione subcellulare, aumentare la comprensione dei ruoli possibili durante la divisione cellulare e la differenziazione delle cellule-tipo.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

13.6K Views.  University of Washington. Descriviamo un protocollo mediante diapositive da camera e media per immobilizzare cotiledoni di impianto per l'imaging confocale dell'epidermide più giorni di sviluppo, documentazione differenziazione stomatica. Proteine ​​fluoroforo-tag possono essere monitorati in modo dinamico attraverso l'espressione e la localizzazione subcellulare, aumentare la comprensione dei ruoli possibili durante la divisione cellulare e la differenziazione delle cellule-tipo....

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Ricerca

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Utilizzo di Scanner Flatbed per la raccolta ad alta risoluzione e ritardi Immagini della Arabidopsis Root gravitropica risposta

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Un metodo Versatile per il montaggio di Arabidopsis lascia per l'Imaging di time-lapse videomicroscopia

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...