Questo lavoro è stato finanziato da Research per prevenire la cecità e la National Institutes of Health di sovvenzione EY10542.

1. Fette Retinal Preparazione <ol><li> Montare la camera (disegno illustrato nella figura 1). Posto due perle di grasso per vuoto, distanziati ~ 8-10 mm di distanza, attraverso la camera di registrazione per formare un canale per superfusate e in cui incorporare le fette retina. Aggiungere un secondo cordone di grasso di pochi millimetri più lontano al di là di ciascuna di queste due perle di grasso a fare da argine e limite di spillover. Mettere un piccolo pezzo triangolare di KimWipe alla fine della camera di fluido per assicurare il contatto con l&#39;elettrodo di riferimento. </li><li> Premere un pezzo di membrana di nitrocellulosa (~ 5 x 10 mm; pori 0,8 micron) piatto contro il microscopio vetrino in due piccole perle di grasso per vuoto. Evitare di mettere grasso direttamente sotto il centro della membrana di nitrocellulosa, come questo può impedire la retina di aderire. </li><li> Per preparare l&#39;affettatrice tessuto, rompere una doppia lama di rasoio bordo in 4 parti e allegare uno al braccio di taglio. Tagliate una fetta sottile di nitrocellulose membrana per assicurare che il bordo tagliente della lama di rasoio adagiata contro la camera di registrazione e consente di ridurre netto la membrana di nitrocellulosa. </li><li> Tenere un piccolo bicchiere di soluzione salina anfibio (Tabella 1) sul ghiaccio presso la stazione di dissezione. </li><li> Euthanize salamandra per decapitazione. Hemisect la testa sagitally e midollo attraverso il midollo spinale. Posizionare la metà della testa su un pezzo di cotone imbevuto di soluzione salina anfibio in cima a un blocco di linoleum. L&#39;altra metà della testa può essere avvolta con un tovagliolo di carta umida e conservato a 4 ° C per uso nel corso della giornata. </li><li> Enucleare l&#39;occhio. Utilizzando piccoli Vännäs forbici, tagliare la pelle che collega l&#39;occhio al orbita circostante. Previa separazione della parte anteriore dell&#39;occhio dal tessuto circostante orbitale, tirare l&#39;occhio avanti e far scorrere le forbici sotto l&#39;occhio per tagliare i muscoli oculari e nervo ottico, liberando l&#39;occhio dall&#39;orbita. </li><li> Posizionare l&#39;occhio enucleato su un letto di cotone sullablocco di linoleum. Gettare la mezza testa. Tagliare l&#39;eccesso di grasso orbitale dal posteriore dell&#39;occhio. </li><li> Fare una piccola incisione nel centro della cornea con una lama chirurgica tagliente. Rimuovere la cornea facendo scorrere Vännäs sottili forbici nell&#39;incisione e l&#39;estensione del taglio radialmente verso di serrata. Tagliare tutto attorno alla serrata ruotando il blocco di linoleum o il cotone tra i tagli. </li><li> Dopo il taglio tutto intorno all&#39;occhio, rimuovere la cornea e la lente estraendole dal lato dell&#39;oculare. Spostare il paraocchi risultante su una superficie dura del blocco linoleum inumidito con soluzione fisiologica anfibio. Tagliarlo a terzi con una lama di rasoio affilato, con un movimento di taglio sottile per assicurare che avete tagliato tutto il percorso attraverso la sclera. </li><li> Inserire uno o due pezzi di conchiglia oculare sulla membrana di nitrocellulosa con la superficie retinica rivolta verso il basso. Immergere i pezzi rimanenti con ulteriore soluzione salina e metterli in frigorifero a 4 ° C. ~ </li><li> Gepremere grado di valorizzare il pezzo di conchiglia oculare contro la membrana di nitrocellulosa con una pinza sottile. Immergere la membrana di nitrocellulosa e pezzo oculare con alcune gocce di soluzione salina fredda anfibi e macchia ai bordi con KimWipe per aiutare la retina di aderire. Ancora una volta, immergere il paraocchi e membrana di nitrocellulosa con alcune gocce di soluzione salina anfibio freddo e staccarsi la sclera / coroide / pigmentato retinico per isolare la retina (che può apparire rosa per la presenza di greggi rodopsina). Se necessario, tagliare il nervo ottico per liberare la retina. </li><li> Se la retina non abbia aderito strettamente, defluire la soluzione salina con un KimWipe per tirare la retina più saldamente giù sulla membrana di nitrocellulosa. Sostituire la soluzione salina. Ripetere, se necessario. </li><li> Riempire la camera con soluzione fisiologica fredda anfibio e trasferirlo alla fase della affettatrice tessuto. Affettare la retina e membrana di nitrocellulosa in strisce sottili, lavorando da un&#39;estremità all&#39;altra ruotando il micrometro nonioin 125 incrementi micron. Premere la lama di un rasoio delicatamente ma con fermezza attraverso la retina e la membrana di nitrocellulosa. </li><li> Trasferire le fettine di retina spostando strisce di membrana di nitrocellulosa al canale principale della camera di registrazione. Sollevare una striscia di membrana libera e poi tenerlo in posizione mentre si muove la camera di sotto di esso, avendo cura di tenere le fette sommersi. Incorporare i bordi della membrana di nitrocellulosa nelle strisce di grasso per vuoto, ruotando di 90 gradi per visualizzare gli strati retinici. </li><li> Premere la membrana di nitrocellulosa piatta contro la superficie di vetro. Anche se non c&#39;è retina su ogni pezzo, posto strisce di membrana di nitrocellulosa a intervalli regolari (~ 1 mm fra) lungo l&#39;intera lunghezza del canale di perfusione per contribuire a spezzare la tensione superficiale e migliorare il flusso di fluido. </li></ol> 2. Registrazioni Whole-cell accoppiati <ol><li> Dopo che tutte le fette sono stati trasferiti, spostare la camera di registrazione alla fase di un montante, fissomicroscopio palco e attaccare l&#39;elettrodo di riferimento di piombo. Focus sulle fette utilizzando una distanza lunga lavorazione, immersione in acqua, 40-60X obiettivo. Il microscopio deve essere posto su una tavola di aria per smorzare le vibrazioni e racchiuso in una gabbia di Faraday per ridurre le interferenze elettriche. </li><li> Superfuse le fette continuo ad una velocità di 1 ml / min con soluzione fisiologica anfibio gorgogliare 100% O 2. Collegare l&#39;aspirazione, facendo in modo che l&#39;afflusso e deflusso sono bilanciati. Deflusso può essere regolata ruotando l&#39;estremità smussata dell&#39;ago di aspirazione o spostando il KimWipe alla fine della camera più vicino o più lontano dall&#39;ago deflusso. Il preparato può essere conservato a temperatura ambiente o raffreddata con un dispositivo di Peltier o semplicemente impostando un pacco di ghiaccio sul palco microscopio. </li><li> Esaminare le fette con luce debole o infrarossi e identificare una coppia di celle - un fotorecettore (asta o cono) e la vicina cella orizzontale o bipolare - a bersaglio per la registrazione a cellula intera. Aste possono essere identified dai loro grandi corpi cellulari e ad asta segmenti esterni di rilievo (Figura 2A). I coni sono più piccolo di aste e avere piccoli segmenti esterni conici. Bipolare cellulare e somas cellule orizzontali sono nella fila più esterna di corpi cellulari nello strato nucleare interno (INL; Figure 2B e 2C). </li><li> Prima di preparare le fette, usare un estrattore pipetta per la fabbricazione micropipette di vetro borosilicato (1,2 diametro esterno mm, da 0,95 mm di diametro interno, con un filamento di vetro). La punta di ogni micropipetta dovrebbe essere ~ 1-2 micron di diametro. </li><li> Utilizzando un ago di riempimento non metallico (ad esempio, un prodotto con una siringa da 1 cc o una Microfil), riempire pipette con la soluzione intracellulare (Tabella 1) e fissare al supporto dell&#39;elettrodo. </li><li> Elevare leggermente l&#39;obiettivo microscopio. Posizionare la pipetta fotorecettore sotto l&#39;obiettivo e poi abbassarlo modo che la punta è posizionata appena sopra le fette. Ripetere con tegli seconda pipetta. </li><li> Regolare lo scostamento del livello corrente di base dell&#39;amplificatore. Controllare la resistenza pipetta con un 5-10 mV impulso depolarizzante. Usiamo tipicamente pipette che vanno dal 10-15 MW, il risultato della lunga conicità dell&#39;albero e bassa osmolarità delle soluzioni anfibi pipetta. Con le soluzioni di mammiferi superiori osmolarità, queste stesse pipette presentano valori di resistenza di ~ 8-12 MW. Mentre abbiamo utilizzato diametri punta più grandi, con valori di resistenza di 3-4 MW in soluzioni di anfibi, i vantaggi forniti da una resistenza di accesso più basso sono compensati da una maggiore difficoltà di tenuta sulle membrane cellulari e una più rapida carrellata delle correnti di calcio e di altri secondo messaggero risposte e minuscole. </li><li> Applicando una pressione leggera, posizione positiva la pipetta post-sinaptica in modo che viene a contatto con il corpo cellulare orizzontale o bipolare. Poi posizionare la pipetta presinaptica in modo che viene a contatto con il corpo cellulare di un fotorecettore asta o cono. Registrazioni APPEar di essere più stabile quando puntali contattare il segmento interno piuttosto che il soma, soprattutto in coni. </li><li> Se il controllo della resistenza, rilasciare la pressione positiva sulla pipetta postsinaptico. Talvolta, il rilascio di pressione positiva è sufficiente a formare un sigillo gigaohm. Se non, applicare aspirazione delicata con una siringa da 1 ml o per bocca. Dopo la resistenza di punta è cresciuta fino a&gt; 100 MW, applicare un potenziale di -60 mV tenuta. Dopo aver ottenuto un sigillo gigaohm, null eventuali transienti di capacità pipetta e ripetere la procedura di tenuta per il fotorecettore pipetta, applicando un potenziale di -70 mV tenuta. </li><li> Rupture la patch utilizzando la bocca o una siringa per applicare l&#39;aspirazione a ciascuna cella, a sua volta. Rods, coni, e le cellule bipolari volontà tipicamente rottura con aspirazione delicata. Ottenimento cellula intera configurazione con una cella orizzontale può richiedere un maggiore aspirazione (cioè con una siringa da 3 cc) in combinazione con forti impulsi di tensione veloci annesse &quot;zapping&quot; feature dell&#39;amplificatore patch clamp. Rottura della membrana e la creazione di cellula intera configurazione sarà evidente dalla comparsa di transienti di capacità di cellule intere. </li><li> Confermare l&#39;identità della cellula post-sinaptica fisiologicamente applicando una luce flash e fornire una serie di gradini di tensione da -120 a +40 mV a incrementi di 20 mV (figure 3 e 4). </li><li> Per valutare se la coppia di cellule sono sinapticamente collegato, fornire una breve (25-100 ms), 60 mV passo depolarizzazione del fotorecettore (a -10 mV, vicino al picco del L-tipo corrente di calcio voltaggio-dipendenti) e guardare per correnti post-sinaptici della neurone secondo ordine (Figura 5). Un forte passo depolarizzante deve evocare una veloce, transitoria verso l&#39;interno corrente post-sinaptica nel post-sinaptica orizzontale o OFF cellula bipolare causato da una raffica di rilascio delle vescicole dal cono (Figura 5). </li></ol>

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B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming.">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li><li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses.">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La preparazione fetta retina è dimostrato molto utile per analizzare la circuiteria e meccanismi impiegati dalla retina per elaborare informazioni visive. La possibilità di ottenere registrazioni integrali cellulari contemporaneamente da neuroni pre-e post-sinaptica è stata particolarmente utile in questo sforzo. Accoppiati registrazioni integrali delle cellule sono molto più facili da realizzare con fette che con le preparazioni retina piana di montaggio, perché i diversi strati della retina sono esposti. Inoltre, a causa delle loro grandi neuroni della retina, salamandre hanno una lunga storia come preparazione della retina e quindi forniscono un modello di sistema particolarmente ben caratterizzati. Con la pratica, fette sani di salamandra retina possono essere preparati regolarmente. A pochi passi chiave possono fare la differenza tra successo e fallimento. 1) Assicurarsi che la lama di un rasoio è montato sul affettatrice tessuto in modo che adagiata contro la superficie del vetro e fette pulito anche se sia il tessuto e underlying membrana di nitrocellulosa. Se hai fatto un taglio netto attraverso la membrana di nitrocellulosa, si dovrebbe sentire un lieve scatto come la lama di un rasoio colpisce la superficie del vetrino. 2) Assicurarsi che la retina ha aderito alla membrana di nitrocellulosa. Altrimenti, la retina può galleggiare lontano dalla membrana durante qualsiasi fase delle procedure. 3) Non esporre le fette tagliate per aria, per non danneggiare molte delle cellule superficiali. 4) Verificare che le fette e la membrana di nitrocellulosa piatte contro il vetrino in modo che gli strati della retina sono evidenti sotto il microscopio da dissezione. 5) Bilanciare i tassi di afflusso e deflusso superfusate al fine di evitare di eccedere la camera di registrazione. Questo impedisce improvvisi cambiamenti nei livelli di soluzione, che possono causare movimenti bruschi tissutali. 6) Selezionare una coppia sana di cellule vicine l&#39;una all&#39;altra. Le cellule con citoplasma lisci sono più sani di cellule con citoplasma granuloso. Le cellule più profonde nella fetta hanno più probabilità di conservare intatto sinaptica concontatti. 7) Assicurarsi che la punta della pipetta non si è rotto o sfiorato altro tessuto o detriti sulla strada giù per le cellule. 8) Controllare la resistenza pipetta per assicurare che non sia ostruito da detriti o una bolla, entrambi i quali possono rendere difficile ottenere una registrazione cellula intera qualità. Invece di fissare la retina di carta da filtro di nitrocellulosa, alcuni ricercatori incorporare retine in un blocco di agar e utilizzano un vibratome per tagliare fette retiniche. Anche se non abbiamo provato questo approccio, Kim et al. Dell&#39;11 discutere i vantaggi di entrambi gli approcci. Nella loro esperienza, l&#39;approccio di agar-based offre una resa più coerente di fette piane con strati retinici ben delineati, ma l&#39;approccio del filtro di carta a base di rendimenti fotorecettori sane. Coni e bastoncelli sono responsabili della trasduzione luce in variazioni di potenziale di membrana. Con le registrazioni appaiate il potenziale di membrana di aste o coni può essere MANIPULAted direttamente e quindi la capacità di generare risposte leggeri, mentre utile per identificare i tipi di cellule, non può essere essenziale. Abbiamo quindi spesso prepariamo fettine in luce bianca. Tuttavia, anche se preparato sotto illuminazione brillante, salamandra neuroni retinici possono generare grandi risposte leggeri come illustrato dalle risposte in fig. 3. Ciò è dovuto in parte relativamente grande serbatoio di cromoforo nella grande volume segmento esterno ma può anche riflettere la capacità delle cellule di rigenerare Müller 11-cis-retinale per coni 12. Per ottenere risposte completamente chiari scuri adatti, si possono preparare le fettine sotto illuminazione a infrarossi. Per dissezioni sotto la luce a infrarossi, attribuiamo GenIII immagine intensificatori (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) per gli oculari del microscopio da dissezione e illuminare il tessuto con una torcia LED a infrarossi. Per accorciare e altre procedure che non sono condotte sotto il microscopio da dissezione, ci avvaliamo di un ima da testage intensificatore. Per il posizionamento delle pipette di patch, visualizziamo le fette con una telecamera CCD a raggi infrarossi sensibile (ad es Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) montato sul montante, microscopio fisso stadi. Con queste precauzioni, si possono ottenere risposte asta espositrici sensibilità singola fotone 6, 13. Una limitazione di lavorare in fette retina è che lunghi processi cellulari di grande campo neuroni retinici possono perdere molti dei loro dendriti durante la procedura di affettatura. Fettine retina sono quindi più utili per studiare la fisiologia delle cellule in cui i contatti sinaptici coinvolgono processi vicino al corpo cellulare. Retine di anfibi e mammiferi condividono molti degli stessi tipi cellulari e utilizzano meccanismi fisiologici simili 14-16. Mentre salamandra retina è un buon modello per molti aspetti della retina dei mammiferi, una differenza importante sembra essere la presenza di un percorso dedicato asta nei mammiferi che involves contatti specializzati rod cellule bipolari sul IAI amacrine 14. Un&#39;ulteriore limitazione della retina salamandra è il piccolo numero di strumenti genetici sviluppati appositamente per questa specie. Tuttavia, gli anticorpi e reagenti shRNA che colpiscono regioni ben conservate in altre specie possono essere utilizzati con successo in salamandra, come tante piccole molecole inibitrici e reagenti peptidici. Inoltre, con alcune modifiche nella tecnica, le fette della retina possono essere preparati da altre specie, in cui alcuni di questi strumenti sono più facilmente disponibili. Oltre la sua utilità per la registrazione a cellula intera accoppiato, la retina preparazione fetta salamandra è anche soggetto a una varietà di altri approcci. Come discusso sopra, le fette retina possono essere utilizzati per studiare le risposte di luce in combinazione con diversi protocolli di voltage clamp 17. Neuroni della retina possono essere caricati anche con coloranti fluorescenti sensibili al Ca 2 +, Cl - o Na+ Introdotta attraverso la pipetta di patch o con vasca-applicazione 15,18-20. Un peptide fluorescente che si lega al nastro sinaptica 21 può essere introdotto attraverso la pipetta di patch e utilizzata per l&#39;imaging del nastro 10 o, se coniugato a fluoresceina, per acutamente e selettivamente danneggiare il nastro 22. Abbiamo anche utilizzato le fette della retina in combinazione con punti quantici di monitorare i movimenti dei singoli canali del calcio in asta e cono terminali sinaptici 23. Così, la fetta retinica verticale è un preparato sperimentale versatile per studiare i meccanismi sinaptici di base e le funzioni di trattamento uniche eseguite alla prima sinapsi in via di segnalazione visiva.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue slicer</td>
 <td>Stoelting</td>
 <td>51425</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Double edge razor blades</td>
 <td>Ted Pella, Inc</td>
 <td>121-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitrocellulose membranes</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AAWP02500</td>
 <td>Type AAWP 0.8 mm pore</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass pipettes</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW120F-4</td>
 <td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl pellet</td>
 <td>Warner</td>
 <td>E206</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroFil</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>MF34G-5</td>
 <td>34 ga. Filling needle, 67 mm long</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation

Uno dei compiti centrali nella retina neuroscienze è capire la circuiteria di neuroni retinici e come tali connessioni sono responsabili per sagomare i segnali trasmessi al cervello. I fotoni sono rilevati nella retina da coni e bastoncelli fotorecettori, che convertono l&#39;energia in un segnale elettrico, la trasmissione ad altri neuroni della retina, dove viene trasformato e comunicato agli obiettivi centrali del cervello attraverso il nervo ottico. Importanti prime intuizioni circuiteria retinica e l&#39;elaborazione visiva provenivano dagli studi istologici di 1,2 Cajal e, più tardi, da registrazioni elettrofisiologiche dell&#39;attività chiodare delle cellule gangliari della retina - le cellule della retina 3,4 uscita. Una comprensione dettagliata dell&#39;elaborazione visiva nella retina richiede una comprensione della segnalazione ad ogni passo nella via da fotorecettore alle cellule gangliari retiniche. Tuttavia, molti tipi di cellule retiniche sono buried profondità nel tessuto e quindi relativamente inaccessibile per registrazione elettrofisiologica. Questa limitazione può essere superata lavorando con fette verticali, in cui cellule che risiedono all&#39;interno di ciascuno degli strati retinici sono chiaramente visibili ed accessibili per la registrazione elettrofisiologica. Qui, descriviamo un metodo per rendere le sezioni verticali di retine da larvale salamandre tigre (Ambystoma tigrinum). Mentre questa preparazione è stato originariamente sviluppato per le registrazioni con microelettrodi taglienti 5,6, si descrive un metodo per la doppia tensione registrazioni clamp whole-cell da fotorecettori e cellule orizzontali e bipolari di secondo ordine in cui manipoliamo potenziale di membrana del fotorecettore e contemporaneamente registrazione post- risposte sinaptiche nelle cellule orizzontali o bipolare. I fotorecettori della salamandra tigre sono considerevolmente più grandi di quelli delle specie di mammiferi, rendendo questa una preparazione ideale in cui intraprendere til suo approccio sperimentale tecnicamente impegnativo. Questi esperimenti sono descritti con un occhio verso sondare le proprietà di segnalazione del nastro sinaptica - una struttura sinaptica specializzata trovato in una solo una manciata di neuroni, tra coni e bastoncelli fotorecettori, che è adatto per il mantenimento di un alto tasso di tonico rilascio di neurotrasmettitori 7 , 8 - e come esso contribuisce alle proprietà uniche di segnalazione di questa prima sinapsi retina.

Tracce rappresentativi di risposte luce da neuroni in fettine verticali di retina salamandra sono mostrati in Figura 3. Il cono, cellula orizzontale e OFF cellule bipolari tutti mostrano una corrente verso l&#39;esterno in risposta alla comparsa della luce. Il prominente corrente verso l&#39;interno seguendo la luce del flash nelle registrazioni delle cellule orizzontali e bipolare è causato dalla maggiore rilascio di glutammato da fotorecettori come depolarizzano all&#39;offset luce. L&#39;ON cellula bipolare risponde con una corrente interna all&#39;esordio luce derivante da un metabotropici segno invertente glutammato recettore cascata di segnalazione e l&#39;attivazione di canali TRPM1 9. Cellule orizzontali e cellule bipolari possono essere distinti l&#39;uno dall&#39;altro dalla loro relazioni IV (Figura 4). Cellule orizzontali in genere hanno una resistenza di ingresso lineare o interiormente rettificazione IV e bassa (&lt;500 MW; Figura 4A), mentre le cellule bipolari hanno una elevata resistenza di ingresso(0,5-2 GΩ) e verso l&#39;esterno-rettifica I - V (Figura 4B) La Figura 5 mostra i risultati rappresentativi di registrazioni di una coppia di celle di cono orizzontale (Figura 5A) e cono-OFF coppia cellule bipolari (Figura 5B).. In ciascuna, depolarizzante il cono a -10 mV da un potenziale di -70 mV possesso evocato una corrente nel cono e veloce EPSC verso l&#39;interno nella cella orizzontale o bipolare calcio voltaggio-dipendenti. Questa forte stimolo è sufficiente per svuotare la piscina facilmente riapribile di ~ 20 vescicole da ciascun nastro sinaptica, causando una EPSC di ~ 47 pA / nastro 10. L&#39;EPSC cella orizzontale in figura 5A era 232 pA, suggerendo che essa ha ricevuto 5 contatti a nastro dal cono presinaptica. Una stima simile dal 178 pA EPSC nella cellula bipolare off (Figura 5B) suggerisce che essa ha ricevuto 4 contatti a nastro dal cono presinaptica. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Anfibio salina </td><td> Pipetta presinaptica </td><td> Pipetta postsinaptica </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mm </td><td> 3,5 mm </td><td> 3,5 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mm </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1.8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-glutammato * </td><td></td><td> 40 MM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-gluconato ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 MM </td></tr><tr><td> Tetraethylammonium Chloride </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mm </td><td> 9 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolarità **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutammato è fatto neutralizzando 40 mM di acido L-glutammico con 40 mM CsOH nella soluzione pipetta. ** A 1 m stock di Cs-gluconato è fatto neutralizzando una soluzione di CsOH con il 45-50% di acido D-gluconico. *** Il pH deve essere regolato con NaOH per la soluzione extracellulare e CsOH per le soluzioni pipetta. **** Mantenendo l&#39;osmolarità delle soluzioni pipetta appena sotto quella della soluzione extracellulare impedisce il rigonfiamento delle cellule e migliorando la longevità della registrazione. Tavolo1. Componenti e dei parametri per le soluzioni intracellulari ed extracellulari standard utilizzati in questo protocollo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figura 1. Disegno della camera di registrazione. (AC) superiore, laterale, e viste in sezione della camera di registrazione che mostra dimensioni. La camera è ricavato da un pezzo di spessore di 2 mm di acrilico. (D) camera assemblato. Superfusate entra nella camera attraverso un cm di lunghezza 10 di tubo in Teflon (tubo di afflusso; tipo 24LW). Superfusate è rimosso applicando leggera aspirazione ad una smussato calibro 20 tubo metallico all&#39;altro lato della camera. Adiacente a questo tubo di uscita è un elettrodo di riferimento pellet Ag / AgCl. Il piombo da questo elettrodo di riferimento è collegato all&#39;ingresso di riferimento del headstage. Un piccolo triangolo di KimWipeviene posto sopra l&#39;elettrodo di riferimento per mantenerla in contatto con la soluzione e regolare il flusso della soluzione nel tubo di efflusso. La base della camera è formata ponendo un vetrino per microscopio nei bordi incassati della camera. La slitta è tenuta in posizione con una goccia di grasso per vuoto. Strisce di membrana di nitrocellulosa con fette retiniche sono inseriti in perline di grasso per vuoto che formano un canale per soluzione di fluire. Prima di procedere a fette, un x 10 mm pezzo di membrana di nitrocellulosa 5 è fissata alla camera con due piccole perle di grasso per vuoto. Un pezzo di conchiglia oculare è posizionato lato vitreale giù su questa membrana di nitrocellulosa e sollevò via una volta che le aderisce retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figura 2. Coppie di celle dye-riempita in vepreparazione fetta rtical. A) Immagini di un bastone e cella orizzontale sinapticamente-accoppiata che erano pieni di contrasto coloranti fluorescenti introdotte tramite la pipetta di patch durante la registrazione a cellula intera simultanea. Lucifer giallo (2 mg / ml) è stato incluso nella soluzione asta pipetta (giallo) e B sulfarhodamine (1 mg / ml) è stato incluso nella soluzione di pipetta cella orizzontale (viola). Immagini fluorescenti sono state catturate utilizzando un disco di filatura microscopio confocale (Perkin Elmer Ultraview LCI) equipaggiato con una camera CCD raffreddata (Orca ER) e montato al microscopio palco fisso (Nikon E600 FN con 60X, 1.0 NA obiettivo immersione in acqua). Queste immagini sono state sovrapposte immagini in campo chiaro delle corrispondenti sezioni della retina utilizzando Adobe Photoshop. B) Immagini di un cono e sinapticamente-accoppiati OFF cellule bipolari. Il terminale assone delle cellule bipolari ramifica in più esterno (S1) sublamina dello strato plessiforme interno, vicino al confine con lo strato nucleare interno. <strong&gt; C) Immagini di un cono e cellula orizzontale sinapticamente-accoppiato. Si noti che i morsetti del cono sono considerevolmente più grande del terminale assone dell&#39;asta. Sebbene le cellule orizzontali possono essere identificati dal loro forma oblunga corpi cellulari, corpi cellulari di ON-OFF e cellule bipolari di tipo nel INL non possono essere facilmente distinguibili prima della registrazione. Tuttavia, si può bersaglio sfollati cono-driven OFF cellule bipolari che hanno corpi cellulari nel ONL e può essere distinto dal Coni per l&#39;assenza di segmenti interni ed esterni. La barra della scala è di 20 micron. <img alt="Figura 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figura 3. Correnti registrate sotto morsetto di tensione tra quattro diversi neuroni della retina in risposta ad un luminoso 500 msec lampo di luce bianca luce evocata. Il cono (A), cellula orizzontale <strong&gt; (B), e al largo delle cellule bipolari (C) tutti hanno risposto alla luce con una corrente verso l&#39;esterno. (D) L&#39;on cellula bipolare ha risposto allo stesso stimolo luce con una corrente verso l&#39;interno. Il rumore di fondo esposto dalla cellula bipolare off (C) riflette un rilascio continuo di vescicole sinaptiche nel buio che diminuisce quando fotorecettori iperpolarizzare in luce. Risposte da questi quattro cellule sono state ottenute in registrazioni separati utilizzando fette preparate sotto la luce bianca. L&#39;intensità dello stimolo luminoso bianco utilizzato in questi esempi risposte prodotta in cellule orizzontali e bipolari equivalenti a 580 nm flusso di fotoni di 1 x 10 5 fotoni / sec / 2 micron. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Figura 4. Corrente-tensione (IV) rapporti di hcellule bipolari e orizzontali off. (A) Pannello superiore, correnti di membrana evocati da una serie di 150 msec di tensione passi da -120 a +40 mV applicata in incrementi di 20 mV (pannello inferiore) a una cella orizzontale. Cellule orizzontali hanno tipicamente una bassa resistenza di ingresso e relazioni lineari o interiormente rettificazione IV. (B) IV rapporto di una cella bipolare off in risposta ad una serie di gradini di tensione. Cellule bipolari hanno una maggiore resistenza di ingresso e un IV esteriormente rettifica, dovuto all&#39;attivazione di correnti di potassio voltaggio-dipendenti. <img alt="Figura 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figura 5. Esempi di registrazione dei dati appaiati. (A) Registrazione della corrente di calcio voltaggio-dipendenti cono (Cone I Ca </sub&gt;) in risposta ad una fase 100 msec a -10 mV da un potenziale di -70 mV (Cone V m) azienda. Tenuta e capacitanza transienti sono stati sottratti utilizzando una perdita sottrazione protocollo P / 8. Un veloce corrente eccitatorio postsinaptico (EPSC; HC PSC) è stata registrata contemporaneamente da una cellula orizzontale, mostrando che queste due cellule sono sinapticamente accoppiati (B) L&#39;EPSC è stato registrato in una cella bipolare off in risposta allo stesso stimolo in un altro. cono.

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Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Descriviamo la preparazione di sottili fettine di retina da acquatico salamandre tigre (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) E spiegare come utilizziamo queste fette di studiare l&#39;elaborazione sinaptica nella retina ottenendo doppia tensione registrazioni clamp whole-cell da fotorecettori e cellule orizzontali e bipolari di secondo ordine.

Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  University of Nebraska Medical Center. Descriviamo la preparazione di sottili fettine di retina da acquatico salamandre tigre ( Ambystoma tigrinum) E spiegare come utilizziamo queste fette di studiare l'elaborazione sinaptica nella retina ottenendo doppia tensione registrazioni clamp whole-cell da fotorecettori e cellule orizzontali e bipolari di secondo ordine.

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Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Ricerca

Neuroscienze

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

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Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Slice Cervello biotinilazione: An

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di

zebrafish