Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Ringraziamo Darwin Hang per la sua assistenza tecnica.

Animale Uso Dichiarazione: Gli animali sono stati curati in conformità con le linee guida descritte nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, utilizzando i protocolli approvati dalla University of Animal Care Minnesota e del Comitato Istituzionale Usa. 1) Preparazione delle soluzioni <ol><li> Prima di eseguire la registrazione elettrofisiologica, soluzioni intracellulari, extracellulari, enzimi e devono essere preparati. </li><li> Extracellulare soluzione: mescolare una bottiglia (8.8g) di media in polvere Ames &#39;(Sigma) con 1 l di H 2 O e 1,9 g di bicarbonato di sodio (23 mm). In tutti i punti la soluzione extracellulare è saturo di O% 95 2 / 5% CO 2 miscela di gas. Trasferire 200 mL in un recipiente per la conservazione della retina. Posto la soluzione rimanente nel contenitore perfusione sistema per perfusione gravità volta retina è montato. </li><li> Soluzione intracellulare: soluzione intracellulare avrebbe dovuto essere formulata in precedenza e poi aliquotati in 500-1000 microlitri aliquote e conservati a -20 ° C. Soluzione intracellulare varia a seconda della sperimentazione necessaria, per le registrazioni morsetto corrente mostrato qui usiamo (in mm): 125 K-gluconato, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH a 7,2 con KOH 5. Un tracciante fluorescente come 10 mM Alexafluor-594 idrazide (Invitrogen) possono essere aggiunte per visualizzare dendriti durante l&#39;esperimento, e neurobiotin (0,3%) può anche essere incluso per l&#39;analisi di anatomia delle cellule a seguito di registrazione. Quando si è pronti a registrare, scongelare soluzione intracellulare. </li><li> Soluzione enzimatica: Combina 10000 disponibilità Collagenasi (Chimica Worthington) con 83 mg di ialuronidasi (Chimica Worthington) in 4,150 ml di soluzione extracellulare. Conservare in aliquote di 50 microlitri a -20 ° C. Aliquote può essere utilizzato per diverse settimane. Quando si è pronti a trattare la retina, aliquota diluire in 500 ml di soluzione bollito extracellulare. </li><li> Soluzione tampone fosfato (PBS): in 800 ml di H 2 O aggiungere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,4 g di Na 2 HPO 4 e 0,24 g di KH 2 PO 4. Portare il pH a 7,4 con NaOH. Regolare il volume di 1 L. </li><li> Tampone fosfato 0,2 M: In 800 ml di H 2 O aggiungere 21,8 g di Na 2 HPO 4 e 6,4 g di NaH 2 PO 4. Portare al volume di 1 L. </li><li> Paraformaldeide Soluzione 4%: Heat 50ml H 2 O a 60 ° C. Aggiungi paraformaldeide 4g, mescolare per alcuni minuti. Aggiungere poche gocce di NaOH 1M (circa 5 gocce), continuando a mescolare fino a quando la soluzione è chiara. Aggiungere 50 ml di tampone fosfato 0,2 M in coppa. Controllare il pH con le strisce pH (~ 7,4). Filtrare e raffreddare. </li><li> Soluzione bloccante (siero di capra 10%, 0,5% TritonX100): in 1,8 ml di PBS aggiungere 0,2 ml di siero di capra e 10 L Triton X-100. TritonX-100 serve a permeabilise il tessuto. </li><li> Streptavidina soluzione (siero di capra al 5%, 0,5% TritonX100, 1:500 streptavidina 594): in 1,9 ml di PBS aggiungere 0,1 ml di siero di capra, 10 microlitri Triton X-100 e 4 ml di streptavidina 594. </li></ol> 2) Isolamento di retina da mouse Strumenti di dissezione necessari: 1 # 2 pinze, 2 # 5 pinze, forbici oftalmologica <ol><li> Eutanasia del mouse secondo protocolli approvati, in questo caso CO 2 asfissia e bulbo oculare enucleare delicatamente l&#39;inserimento di un angolo # 2 pinze dietro l&#39;occhio e il sollevamento fuori del bulbo oculare. </li><li> Posizionare il bulbo oculare in un piatto 35 millimetri di Petri con una soluzione extracellulare. Tagliare il nervo ottico e muscoli extraoculari ogni allegato o del tessuto connettivo con le forbici oftalmologica. Tagliare la cornea con una forbice oftalmologico ed estrarre la lente con # 5 pinze. Strappare la sclera con un paio di pinze # 5 e utilizzare le pinze per tagliare il nervo ottico in cui la retina e sclera riunisce presso la disco ottico. Buccia delicatamente la retina dalla oculare. Suggerimento: ogni passo su entrambe le retine prima di passare alla fase successiva per minimizzare i tempi. </li><li> Usare pinze per rimuovere vitreo attaccati alla retina. Questa operazione può essere eseguita da &quot;afferrare&quot; il vitreo trasparente sopra la retina con una pinza. Il vitreo, se rimosso correttamente, dovrebbe essere visibile come una chiara, sostanza gelatinosa sulle pinze. Suggerimento: Sfogliatrici retine a metà dopo la rimozione del corpo vitreo ci permetterà di ottimizzare la quantità di tessuto utilizzabile e fare montaggio nella camera più facile. </li><li> Mantenere la retina in ossigenato soluzione extracellulare a temperatura ambiente in un ambiente buio con il minimo di luce ambiente fino a quando non sono pronti per essere digerito. Retina possono essere memorizzati in questo modo per ~ 6 ore. </li></ol> 3) Il trattamento della retina con miscela di enzimi e di montaggio in camera di registrazione <ol><li> Diluire una parte di collagenasi / ialuronidasi in 500 ul di soluzione extracellulare, soluzione posto in una capsula di Petri 35 millimetri ed il trasferimento della retina. </li><li> Mantenere la retina-contengonoING piastra di Petri, coperto e al buio, in una O2 95% / 5% CO 2 ambiente per 15 minuti con agitazione. Questa fase aiuta a digerire qualsiasi residuo vetroso e consente un accesso più facile allo strato delle cellule gangliari. Suggerimento: per le retine da animali giovani con meno vitreo o se gli effetti avversi sono stati osservati, il tempo può essere ridotto a ~ 5 minuti. </li><li> Rimuovere retina da enzimi contenenti medie e lavare ampiamente in soluzione extracellulare </li><li> Trasferire la retina in camera di registrazione 6 con lo strato dei fotorecettori rivolto verso il basso. Liberano dal liquido rimanente sia con una pipetta o tessuto e stendere i lati della retina per appiattire tessuto facendo attenzione a toccare solo i bordi della retina, in particolare evitando il contatto con lo strato di cellule gangliari. Mettere un anello di platino con più di retina in nylon mesh per ancorare il tessuto e subito riempire la camera con la soluzione extracellulare. </li><li> Montare la camera di registrazione sul palco microscopio, allegare tubo per perfusione gravità e di aspirazione del vuoto e allegare filo di terra. </li></ol> 4) la localizzazione delle cellule gangliari EGFP esprimere e di stimolazione luminosa <ol><li> Profumato la retina dalla forza di gravità con una soluzione extracellulare a 1 tassi mL / min o più veloce. Suggerimento: se tasso di perfusione è troppo lento, il tessuto non sarà sufficientemente ossigenato e segnalazione sinaptica possono essere disturbati. </li><li> Riempire una pipetta di registrazione con soluzione intracellulare e inserirla nel supporto pipetta. Suggerimento: Pipette con resistenze nel range da 3 a 5MΩ dare i migliori risultati. </li><li> Visualizza la retina sotto infrarossi contrasto differenziale di interferenza (DIC) ottiche a basso ingrandimento (obiettivo 10X, NA 0,3) di localizzare la pipetta di registrazione. La luce infrarossa viene utilizzato per minimizzare l&#39;esposizione della retina alla luce visibile e minimizzare l&#39;adattamento alla luce. Sposta in alto ingrandimento (obiettivo 40X, NA 0,8) e porta elettrodo in vista appena sopra il tessuto. </li><li> A forte ingrandimento (obiettivo 40X), illuminare la retina con epifluorescenza (480 nm per EGFP) e selezionare una cella fluorescente ganglio e segnare su un monitor con del nastro (Figura 1A). </li><li> Sotto illuminazione DIC e infrarossi, la posizione l&#39;elettrodo di registrazione presso la cellula gangliare mirati (Figura 1A). Pulire l&#39;area immediatamente copertura delle cellule, applicando leggera pressione positiva di elettrodi di registrazione con una siringa di plastica 12cc collegato al titolare pipetta con tubi in polietilene. L&#39;amplificatore, zero eventuali compensazioni di tensione. Elettrodo posto su cellule gangliari selezionato fino a una fossetta appare sulla superficie cellulare. </li><li> Con l&#39;amplificatore in modalità morsetto tensione, applicare un impulso di testare e monitorare la corrente che passa attraverso la pipetta. Applicare una pressione negativa per creare tenuta tra elettrodi e cellule. Rilascio della pressione negativa quando cellula comincia a sigillare e attendere corrente di mantenimento è indicativo di un sigillo GΩ elettrico tra membrana della cellula e pipetta. Applicare gli impulsi gentile di pressione negativa fino transitori capacitivi apparire e quindi rilasciare qualsiasi applicazione di pressione. Suggerimento: se l&#39;accesso (serie) la resistenza è alta (&gt; 30MΩ), questo può essere migliorata da ulteriori, molto gentile, gli impulsi di pressione negativa. </li><li> Una volta un sigillo stabile è stato raggiunto applicare un impulso di pressione negativa. Dopo modalità cellula intera si ottiene, permettono cellula di adattarsi buio per 5 minuti. Record, in modalità corrente morsetto, risposta a tutto campo, la stimolazione luce bianca (Figura 1B). </li><li> Successivamente alla registrazione, Alexafluor-594 sarà diffusa al dendriti. Il tracciante possono essere visualizzate in epifluorescenza a 594 nm e utilizzato per determinare se una cellula gangliare è On-, Off-o bi-stratificato per il passaggio tra ottica e infrarossa epifluorescenza DIC 5. </li><li> Se neurobiotin è inclusa nella pipetta e retina sta per essere trattati per immunoistochimica, allora pipetta deve essere delicatamente retratto per fornire minima rottura della membrana. </li></ol> 5) Analisi di anatomia delle cellule gangliari registrati Riempimento con neurobiotin permette per un&#39;analisi più dettagliata morfologica delle cellule gangliari a seguito della registrazione. Suggerimento: se specifiche correlazioni tra una cellula gangliare registrato e morfologia dettagliata è desiderato, può essere meglio per la registrazione e compilare un solo RGC per la preparazione. <ol><li> Se neurobiotin è stato incluso nella soluzione intracellulare poi posto la retina in soluzione paraformaldeide e fissare una notte a 4 ° C. </li><li> Sciacquare in PBS, almeno 2 ore, almeno 6 ricambi. Trasferire la retina di un piatto contenente soluzione di blocco. Lasciare in blocco soluzione per 2 ore, temperatura ambiente su agitatore. </li><li> Sostituire la soluzione di saturazione con la soluzione Streptavidina. Incubare 2 giorni a 4 ° C su agitatore. Sciacquare la retina in PBS, 6 risciacqui, 20 min ciascuna. </li><li> Montare la retina con Vectashield in un vetrino.La retina deve essere posto con le cellule gangliari in su. Eseguire la microscopia confocale (Figura 1C). </li></ol> Rappresentante Risultati Se la retina è sana e la dissezione ha avuto successo, le cellule gangliari individuo dovrebbe essere visibile sotto DIC a forte ingrandimento (Figura 1A). Retine malsano avrà grandi, nuclei granulato e dovrebbe essere scartato. Se la risposta sinaptica di una cellula gangliare dato è intatto, allora la cellula deve rispondere di esordio luce o offset con potenziali d&#39;azione e, nel caso di cellule gangliari intrinseca fotosensibile (Figura 1B), una depolarizzazione prolungata. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Localizzazione, registrazione e colorazione di una cella fluorescente gangliari della retina. (A) RGC GFP positive visualizzati sotto illuminazione epifluorescente con ingrandimento 40X (pannello a sinistra) e sotto illuminazione DIC (pannello di destra). (B) risposta Synaptic luce di un M2 cellule gangliari della retina fotosensibile intrinsecamente registrato per intero a cellule modalità morsetto corrente da RGC fluorescente. (C) M1 delle cellule gangliari della retina intrinsecamente fotosensibile che è stato identificato in epifluorescenza, mirati per intero a cellule di registrazione, pieno di neurobiotin, e poi trattati per immunoistochimica.

<ol>
	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

Questa tecnica è applicabile a qualsiasi registrazioni delle cellule gangliari della retina da una retina isolata. Anche se in linea di mouse usato soprattutto intrinsecamente fotosensibili, melanopsina che esprimono RGCs sono etichettati con EGFP 2, 5, questo protocollo è facilmente trasferibile anche ad altre linee fluorescente RGC o può essere generalizzata a registrare da RGCs selezionati casualmente pure. Questa tecnica è particolarmente prezioso perché il pergolato dendritiche di ogni RGC e dei suo...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

I primi passi nella visione di vertebrati hanno luogo quando la luce stimola i coni e bastoncelli della retina 1. Queste informazioni vengono quindi segregati in quello che sono conosciuti come i percorsi di ON e OFF. Il segnale di fotorecettori informazioni luce alle cellule bipolari (BCS), che depolarizza in risposta ad un aumento (On ​​jacket) o diminuisce (Off jacket) di intensità luminosa. Questa separazione di informazioni luce viene mantenuta al livello delle cellule gangliari della retina (RGCs), che hanno dendriti stratificando sia nel sublamina Off dello strato interno plessiformi (IPL), dove ricevono input eccitatorio diretto da Off jacket, o stratificazione in il sublamina Uno degli IPL, dove ricevono input eccitatorio diretto da On jacket. Questa separazione di informazioni riguardanti aumenti o diminuzioni di illuminazione (On e Off percorsi) è conservato e segnalato al cervello in parallelo. Il RGCs sono le cellule di uscita della retina, e sono quindi una cellula importante studiare per capire come le informazioni luce viene segnalata a nuclei visiva nel cervello. I progressi della genetica dei topi negli ultimi decenni hanno portato ad una serie di linee fluorescenti topo giornalista dove vengono etichettati specifiche popolazioni di RGC con una proteina fluorescente per permettere l&#39;identificazione dei sottotipi RGC 2 3 4 e specifici mirati per la registrazione elettrofisiologiche. Qui, vi presentiamo un metodo per registrare le risposte luce da cellule gangliari fluorescente in un intatto, preparazione isolato della retina. Questa preparazione isolato retina permette di registrazioni dal RGCs dove il pergolato dendritiche è intatto e gli ingressi in tutto il pergolato intero dendritiche RGC sono conservati. Questo metodo è applicabile su una varietà di sottotipi di cellule gangliari ed è suscettibile di una vasta gamma di tecniche fisiologiche cella singola.

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Questo articolo fornisce una descrizione del modo di sezionare e registrare dalla preparazione della retina isolata nel topo. In particolare, viene descritto come registrare le risposte luce da una popolazione di cellule gangliari fluorescente e successivamente identificare e analizzare la sua morfologia.

Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  University of Minnesota. Questo articolo fornisce una descrizione del modo di sezionare e registrare dalla preparazione della retina isolata nel topo. In particolare, viene descritto come registrare le risposte luce da una popolazione di cellule gangliari fluorescente e successivamente identificare e analizzare la sua morfologia.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Neuroscienze

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Una lesione del nervo ottico Modello Crush murini per studiare la sopravvivenza delle cellule gangliari della retina

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparazione delle sezioni ricrello della retina

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Isolamento della retina di topo e trattamento con metanolo per lo studio delle cellule gangliari retiniche

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autore in primo piano: Preparazione a montatura intera a base di metanolo per lo studio delle cellule gangliari retiniche  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Preparato a base di metanolo a montaggio intero per lo studio delle cellule gangliari retiniche

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...