Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 a KD e RW). Siamo grati a Thomas Eulero (Töbingen, Germania) per la luce QDS software stimolazione.

La seguente descrizione presuppone che lo sperimentatore ha una conoscenza di base della struttura della retina, patch-clamp la registrazione e la microscopia a due fotoni. Per informazioni utili sulla realizzazione e il funzionamento di una patch-clamp setup e due fotoni sistema di imaging vedere Rif [7-12]. 1. Animali e di preparazione dei tessuti <ol><li> Tenere il mouse adattato all&#39;oscurità per almeno 3 ore Nel frattempo, preparare 1-2 l di soluzione extracellulare costituito da (in mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucosio ed equilibrare a pH 7.4 con il gas con CarboGen (5% di CO 2 in O 2) a temperatura ambiente. </li> un <li> Euthanize il mouse in una tenuta d&#39;aria da camera di CO 2 overdose seguita da dislocazione cervicale. Questa procedura e le seguenti operazioni devono essere eseguite nelle tenebre. Utilizzare dim lunghezza d&#39;onda di illuminazione (lunghezze d&#39;onda di bloccare dei passi da una fonte di luce fredda da un 690 nm-longpass filtro) per sostenere una visione personale, mantenendo gli occhi dell&#39;animale scuro-adattato (topi hanno solo una visione povera nella parte rossa dello spettro della luce). Per i lavori di illuminazione completo uso tenebre infrarossi (&gt; 800 nm) e indossare occhiali per visione notturna. </li><li> Enucleare gli occhi con un paio di forbici curve iris e trasferirli in un piatto di soluzione extracellulare posta sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Rimuovere la cornea e il corpo ciliare aprendo il bulbo dell&#39;occhio lungo la serrata (al confine tra retina e corpo ciliare) con un paio di forbici a molla (per prima cosa usare un bisturi per forare un punto di partenza per il taglio). Togliere le lenti e attentamente separato la retina da dell&#39;epitelio pigmentato. Se l&#39;orientamento della retina è cruciale per il vostro studio, indicare piace in Ref. [12]. Tagliare il nervo ottico tra retina e dell&#39;epitelio pigmentato e rimuovere la retina dalla oculare. Si noti la direzione delle superfici della retina: la parte interna del arricciato-up retina è la Gangllato celle Ioni; l&#39;esterno è il lato dei fotorecettori. </li><li> Rimuovere il vitreo dalla superficie interna della retina con delicatezza tirando fuori con l&#39;aiuto di uno stuzzicadenti di legno. A tal fine, utilizzare un piccolo volume di soluzione extracellulare che copre appena la retina. I bastoncini vitreo per lo stuzzicadenti e possono essere trascinati fuori centrifuga della retina. Quindi, applicare incisioni breve lungo il perimetro della retina per facilitare l&#39;appiattimento del tessuto. </li><li> Trasferire la retina nella camera di registrazione fotorecettore rivolto verso il basso, lo stese sul fondo di vetro (si usa un pennello fine) e immobilizzare con una con corde in nylon telaio in acciaio inossidabile. Preparare la retina secondo nello stesso modo e tenerlo scuro-adattato in carboxygenated soluzione extracellulare per un uso successivo. </li></ol> 2. Registrazioni <ol><li> Installare la camera di registrazione al buio sotto un microscopio laser a scansione verticale e superfuse la preparazione della retina continuamente (non inferiore a 5 ml / min) con carboxygenated soluzione extracellulare riscaldata a 35 ° C. Il microscopio (anche dotato di una lampada sensibile camera CCD) si trova su una ammortizzante tavolo aria all&#39;interno di una gabbia di Faraday per elettronica schermatura. Coprire la gabbia con un non-tenda trasparente per mantenere la preparazione al buio. Abbiamo anche a schermo spento la luce dal monitor dei computer da rosso pellicola trasparente. </li><li> Tune il laser a infrarossi per 850-870 nm o lunghezze d&#39;onda maggiori, passare alla modalità-locked condizione, e l&#39;uso di eccitazione a due fotoni per visualizzare GFP cellule che esprimono. Attenuare la potenza laser utilizzando filtri a densità neutra controllata dal software di scansione laser fino a un grado che è appena sufficiente per un chiaro riconoscimento della cellula fluorescente </li><li> Per i patch-clamp registrazioni in current-clamp micropipette utilizzare la modalità di vetro (usiamo tubi in vetro borosilicato di 1,5 mm di diametro esterno e lo spessore della parete 0,225 mm) riempiti con una soluzione intracellulare composta da (in mm) 125 K-gluconato, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titolato a pH 7.4 con KOH (dando una resistenza pipetta di circa 5 MΩ). Da notare che altre condizioni sperimentali come voltage-clamp registrazione richiedono una soluzione diversa. Se le iniezioni sono colorante desiderata, aggiungere una sonda fluorescente (usiamo 10 mM Alexa Fluor 594) o di una molecola tracciante (3% Neurobiotin). Inserire la micropipetta nel supporto e assicurarsi che l&#39;elettrodo di riferimento (filo d&#39;argento clorurati) è in contatto con la soluzione extracellulare nella camera di registrazione. </li><li> Applicare una pressione al micropipetta e bersagliare un GFP che esprimono cellulare (usiamo un duplice obiettivo 40-immersione in acqua; NA 1,25). Amacrine corpi cellulari si trovano nello strato delle cellule gangliari (direttamente sotto la superficie con l&#39;orientamento attuale della retina), così come nella parte prossimale dello strato nucleare interno (circa 55-75 micron nelle profondità della preparazione). Prima micropipetta contatto con la cellula bersaglio, la membrana limitante interna (una guaina fatta di gliali endfeet) alla retinasuperficie deve essere penetrato. Penetrazione di successo è riconosciuto da soluzione intracellulare che viene cacciato dalla punta micropipetta e stacca la membrana limitante interna dal tessuto di fondo della retina come si può osservare su un&#39;immagine trasmissione a infrarossi catturata dalla IR-CCD. </li><li> Approccio alla cella desiderata mettendo a confronto la posizione soma dei due fotoni immagine con l&#39;immagine della IR-CCD che mostra la posizione della micropipetta registrazione. Si noti che questo passaggio non è facile da realizzare e richiede una certa pratica, perché la GFP-esprimere la cella deve essere riconosciuto nell&#39;immagine trasmissione a infrarossi al fine di indirizzare la micropipetta verso di esso. Targeting corretto si ottiene quando la punta micropipetta cause fossette della superficie cellulare che può essere visto in due fotoni immagine. Alternativa a questa procedura, utilizzare un colorante fluorescente (per esempio Alexa Fluor 594, 100 mM) nella soluzione intracellulare per rivelare la posizione micropipetta in due fotoni immagine. Eccitazione a due fotoni a raggi infrarossi permette di fluorescenza del colorante sufficiente per rendere la micropipetta discernibile. A tal fine, regolare il campo di rilevamento del software di scansione laser per coprire anche fluorescenza rossa. </li><li> Scaricare la pressione dalla micropipetta e ottenere un whole-cell patch-clamp in configurazione current-clamp mode. Una registrazione utilizzabile dovrebbe dare un potenziale di membrana di -50 a -55 mV e durare almeno 20 minuti. </li><li> Presente stimoli visivi creati da un software stimolazione (usiamo QDS da Thomas Eulero, Università di Tubinga, Germania) 11 sul monitor del computer. Regolare la posizione spaziale della stimolazione ad essere centrato sulla cella registrato: Segnare la posizione delle cellule sul monitor che mostra l&#39;immagine di trasmissione del IR-CCD e il centro un luogo-come stimolo su di esso. Regolare l&#39;intensità dello stimolo con l&#39;inserimento di filtri a densità neutra nel percorso del fascio. Per la calibrazione dello spettro di monitorare e vedere l&#39;intensità Ref. [14]. Scegli un prolonged interstimulus intervallo (ad esempio, 15 s) per evitare di adattamento. Includere un fotodiodo sul percorso del raggio di tenere traccia dei tempi stimolo. </li><li> Avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte luce (si usa una frequenza di campionamento di 10 kHz, con filtraggio a 5 kHz per non spiking cellule; per la registrazione di picco di una frequenza di campionamento più alto come 20 kHz è consigliato). Utilizzare il software leggero stimolo per attivare il software di registrazione. </li><li> Per tingere il riempimento lasciare che la diffusa fluorescente agente nella cella registrato per 30-45 minuti prima con attenzione ritraendo la micropipetta dalla cella. Fare attenzione a non estrarre il corpo cellulare. Se il non-tracciante fluorescente Neurobiotin è stato utilizzato, ha bisogno di visualizzazione legandosi a streptavidina coniugato con un fluoroforo (usiamo streptavidina Cy3, 1:400 per tutta la notte a 4 ° C dopo 20 min paraformaldeide fissazione della retina, per tingere accoppiamento Gli studi di incubazione streptavidina può essere prolungata fino a 3 d). In alternativa, le iniezioni possono essere eseguite anche conelettrodi forte (&gt; 100 MW), quando il colorante è guidato iontophoretically nella cella impalato (impulsi rettangolari: 0,25-1 nA, 100 ms, intervallo di 100 ms, tempo totale 3-6 minuti). </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: I seguenti risultati provengono da uno studio su un topo che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il promotore per la tirosina idrossilasi 13,14, l&#39;enzima che catalizza il fattore limitante nella sintesi delle catecolamine (TH:: GFP mouse). In base alla luminosità della GFP-segnale due distinte popolazioni cellulari si distinguono (Figura 2A). Cellule che esprimono il livello più alto GFP possiedono corpi cellulari situati nello strato nucleare interno (INL, figura 2A) o spostato nello strato delle cellule gangliari (GCL, Figura 2B) e stratificare nel mezzo dello strato interno plessiforme (IPL, Figura 2C) . Essi sono stati identificati come cellule di tipo 2 14-16 e potrebbe essere studiati sistematicamente in relazione alla morfologia (Figura 3) ed eleggereattività rical (Figura 4), ​​anche se la sua densità di popolazione ammonta solo a 250 cellule / mm 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del setup sperimentale. Eccitazione a due fotoni (luce rossa percorso punteggiato) di fluoroforo che esprimono le cellule della retina intatta consente visivo mira da una micropipetta (percorso verde emissione di luce). La retina è sottoposta a stimoli ottici proiettata attraverso il condensatore del microscopio (percorso giallo chiaro), e le risposte cellulari leggeri vengono registrati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> Figura 2. GFP-cellule che esprimono in un flatmount della retina di un TH:: mouse GFP. Due popolazioni si distingue per la luminosità del GFP-segnale: di tipo 1 le cellule (cellule DA) situato nel INL mostrando fluorescenza debole (A, vedi frecce) e il tipo intensamente etichettati 2 cellecon i corpi cellulari sia nel INL (A, vedi frecce) o sfollati nella GCL (B) e una stratificazione dendritica nello strato S3 della IPL (C). Barre di scala, 50 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> Figura 3. Morfologia di una cellula di tipo 2 iniettato il tracciante Neurobiotin. Il tracciante è stata successivamente visualizzati con streptavidina Cy3-binding (magenta). Il microscopio, che è anche il segnale che raffigura GFP (verde), è una proiezione di pile immagine che copre il GCL e IPL. Scala bar, 50 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> Figura 4. Risposte luce di una cellula di tipo 2 si trova nella GCL. Risposta modello da luce bianca a pieno campo illuminazione di intensità crescente nella gamma scotopica. Intensità dello stimolo è dato in photoisomerizations per asta al secondo (Rh * / asta / s). Uno stimolo prolungato di 3 s è stato usato per una migliore distinteione dei componenti risposta all&#39;esordio stimolo (ON risposta) e offset (OFF risposta).

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

Topi sono stati trattati e sacrificati in conformità alle direttive istituzionali per il benessere degli animali e le leggi sulla sperimentazione animale emessi dal governo tedesco.

Questo metodo offre la possibilità di studiare le proprietà elettriche dei neuroni specifici della retina intatta sotto guida visiva senza influenzare le condizioni di adattamento della retina. E &#39;particolarmente adatto per la caratterizzazione di cellule che sono attualmente piuttosto poco studiato a causa della bassa densità di popolazione come la maggior parte delle popolazioni di cellule amacrine. Eccitazione a due fotoni permette ad alta risoluzione ed elevato contrasto di immagini anche da parti più profonde del tessuto 17, un prerequisito per il targeting preciso e di successo patch-bloccaggio delle cellule in particolare nel INL con la sua alta densità di corpi cellulari. La retina del mouse isolato è praticabile per 3-4 ore in condizioni sperimentali. Se la retina secondo è conservato nella più completa oscurità sotto gas CarboGen continuo, mantiene il colore viola di fotopigmento greggi e può essere utilizzato dopo aver terminato gli esperimenti con la retina per primo. In principio, intese a promuovere l&#39;cella selezionata con la micropipetta in wholemount retina è un po &#39;impegnativo e richiede una certa pratica, soprattutto quando si lavora al buio. Tra cui un colorante fluorescente in micropipetta può semplificare la procedura, perché cellulare e micropipetta sono visibili sotto eccitazione a due fotoni, allo stesso tempo. Tuttavia, l&#39;aggiunta di componenti per la soluzione intracellulare può impedire la formazione di gigaseal o causare la qualità di registrazione a soffrire. Una volta realizzato con successo, una buona registrazione può durare per circa 1 h. Considerando che la luce di eccitazione a infrarossi è di per sé scarsamente assorbita dal fotorecettori retinici, eccitato GFP che esprimono le cellule emettono luce nella parte visibile dello spettro. Tuttavia, fluorofori sono eccitati solo in un piccolo volume focale che non è destinata a cambiare la condizione di adattamento della retina. Tanto più, l&#39;eccitazione è necessaria solo per il targeting e può essere spento durante la registrazione di risposte luce. Il usefulness di questo approccio è già dimostrato da studi su popolazioni di cellule amacrine 14,18 da cui registrazioni elettrofisiologiche altrimenti sarebbe stata possibile solo per caso 12. Infine, questa potente tecnica può essere ulteriormente esteso includendo un approccio farmacologico 14, Ca 2 + 19 o immagini utilizzando cellule iniettate per gli studi di immunocitochimica e microscopia elettronica. In questo modo, la posizione funzionale di un tipo di cellula di cui i circuiti della retina possono essere svelati.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Occhiali per visione notturna </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Germania </td><td> Xtron F1 </td><td> include una fonte di luce 800 nm </td></tr><tr><td> Filtro ottico </td><td> Schott, Mainz, Germania </td><td> RG9 </td><td> longpass filtro con taglio a 690 nm </td></tr><tr><td> Iris forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14061-09 </td><td> curvo con lama mm 22 </td></tr><tr><td> Primavera forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15000-00 </td><td> dritto con 3 lama mm </td></tr><tr><td> Registrazione camera </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Germania </td><td> 2-100 500 0180 tipo A (TC) </td><td> Teflon camera con fondo antiscivolo montato vetro di copertura (circa 0,15 millimetri, n. 200-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Flusso di riscaldamento </td><td> I sistemi multicanale, Reutlingen, Germania </td><td> PH01, TC01 </td><td> perfusione cannula riscaldabile con temperatura sEnsor e di controllo della temperatura </td></tr><tr><td> Microscopio a scansione laser </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> controllati da software Leica confocale </td></tr><tr><td> Air tavolo </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Tsunami in modo bloccato laser Ti: zaffiro </td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> PCO AG, Kelheim, Germania </td><td> PixelFly QE </td><td> compreso il software di controllo </td></tr><tr><td> Micropipetta di vetro capillari </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Germania </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta estrattore </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> colorante fluorescente </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> non tracciante fluorescente </td></tr><tr><td> Streptavidina Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Germania </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motorizzato Mini25 unità manipolatore con display SM-5 </td></tr><tr><td> Patch-clamp amplificatore </td><td> npi electronic GmbH, Tamm, Germania </td><td> SEC-05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> Digitalizzatore </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione dati software WinWCP </td><td> John Dempster, dell&#39;Università di Scozia, Glasgow, UK </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> Stimolo visivo generatore QDS </td><td> Thomas Eulero, Università di Tübingen, Germania </td><td></td><td> deve essere fatto funzionare su un computer separato controllare 2 monitor (interfaccia utente, stimolo monitor) </td></tr><tr><td> I filtri a densità neutra </td><td> GTI, Mainz, Germania </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

Studiare le proprietà fisiologiche e le connessioni sinaptiche dei neuroni specifici nel tessuto intatto è una sfida per quelle cellule che la mancanza cospicua caratteristiche morfologiche o mostrare una bassa densità di popolazione. Ciò vale in particolare per le cellule amacrine della retina, una classe di interneuroni straordinariamente multiformi che compongono circa 30 sottotipi nei mammiferi 1. Pur essendo una parte cruciale della elaborazione visiva modellando l&#39;uscita della retina 2, la maggior parte di questi sottotipi non sono stati studiati fino ad ora in un contesto funzionale, perché incontrando queste cellule con un elettrodo di registrazione è un evento raro. Recentemente, una moltitudine di linee di topi transgenici che è disponibile esprimere marcatori fluorescenti come una proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di promotori di recettori di membrana o enzimi che sono specifici per solo un sottoinsieme di neuroni in un tessuto dato 3,4. Questi pre-etichettati cellule sono quindi accessible per la regia microelettrodo targeting sotto controllo microscopico, permettendo lo studio sistematico delle loro proprietà fisiologiche in situ. Tuttavia, l&#39;eccitazione di marcatori fluorescenti è accompagnata dal rischio di fototossicità per il tessuto vivente. Nella retina, questo approccio è ulteriormente ostacolata dal problema luce di eccitazione provoca una stimolazione appropriata dei fotorecettori, così infliggendo fotopigmento sbiancamento e il trasferimento dei circuiti della retina in una luce-adattato condizione. Questi inconvenienti sono superati dai con eccitazione a infrarossi fornito da un laser mode-locked in brevi impulsi del campo di femtosecondi. Eccitazione a due fotoni fornisce energia sufficiente per l&#39;eccitazione fluoroforo e al tempo stesso limita l&#39;eccitazione per un volume di tessuto di piccole minimizzare i pericoli di fotodanneggiamento 5. Inoltre, lascia la retina risponde agli stimoli visivi in quanto la luce infrarossa (&gt; 850 nm) è solo scarsamente assorbito dal fotopigmenti 6. in situ da GFP che esprimono le cellule che sono visivamente bersaglio eccitazione a due fotoni. La retina è preparato e mantenuto al buio e può essere sottoposto a stimoli ottici che vengono proiettate attraverso il condensatore del microscopio (Figura 1). Patch-clamp registrazione di risposte luce può essere combinato con colorante riempimento per rivelare la morfologia e per controllarne il gap di giunzione mediata colorante attacco alle cellule vicine, in modo che la cellula bersaglio può da studiare su diversi livelli sperimentali.

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Questo articolo descrive la registrazione delle singole cellule da fluorescente tag popolazioni neuronali della retina topo intatto. Con l&#39;eccitazione a due fotoni infrarossi cellule transgenetically etichettati sono stati mirati per patch-clamp per lo studio di registrazione le loro risposte luce, proprietà del campo recettivo, e la morfologia.

Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K Views.  University of Oldenburg. Questo articolo descrive la registrazione delle singole cellule da fluorescente tag popolazioni neuronali della retina topo intatto. Con l'eccitazione a due fotoni infrarossi cellule transgenetically etichettati sono stati mirati per patch-clamp per lo studio di registrazione le loro risposte luce, proprietà del campo recettivo, e la morfologia.

Video: Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intatta Caratterizzazione istologica di Microdevices Brain-impiantati e il tessuto circostante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

Isolamento di distinte popolazioni cellulari dal cervelletto in via di sviluppo da Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In Vitro Caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche di fibre afferenti coliche in ratti

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...