Questo lavoro è finanziato dalla sovvenzione del NIH 1R03AI090465.

1. Ricevere i dati <ol><li> I dati di traiettoria possono essere raccolti con palmari GPS, GPS-enabled applicazioni intelligenti di monitoraggio telefono, così come A-GPS (Assisted GPS) dispositivi come quello impiegato nel nostro studio, uno spot dispositivo tracker bambino. </li><li> Dati di traiettoria in genere viene salvato in termini di tempo-latitudine-longitudine record. Un intervallo di tempo desiderato deve essere impostato in base alle esigenze applicative. Spesso l&#39;intervallo più frequente è desiderata per lo spazio-temporali studi attività. </li><li> Convertire i dati in valori separati da virgole, o. Csv con colonne separate per id record, latitudine, longitudine, e di tempo, rispettivamente. Poi convertire i. Csv file in uso comune Geographic Information Systems (GIS) formato di file (ad esempio ESRI shapefile 8). </li><li> Caricare in uno shapefile di poligoni di costruzione e un altro del confine dell&#39;area di studio con l&#39;analizzatore traiettoria. Impostare il &quot;estrusione&quot; degli edifici adeguatamente per un 3D display e impostare il &quot;estrusione&quot; e &quot;trasparenza&quot; dello strato limite correttamente per visualizzare uno spazio-tempo cubo 6, 9 con il x, y rappresentano dimensioni spazio e la dimensione z rappresenta il tempo. </li></ol> 2. Pre-elaborazione <ol><li> Sono disponibili due opzioni per la pre-elaborazione dei dati grezzi rumorosi traiettoria. Si può scegliere dal menu a discesa del menu di pre-elaborazione. </li><li> Se &#39;Interactive&#39; viene scelto, una proiezione 2D della traiettoria 3D è stato creato per facilitare la visualizzazione e la selezione. Manipolare lo schermo 3D per esaminare la traiettoria grezzo nello spazio e nel tempo. Individuare errori nei dati in base alla velocità di forma e / o topologia di segmenti di binario. Pronto punti (vertici) con realistico ad alta velocità o cambio di direzione improvviso significare errori. Selezionare e rimuoverli dalle traiettorie originali. Selezionare e rimuoverli da entrambi la traiettoria 3D o la sua proiezione 2D. </li><li> Un cluster di punti di traccia con appuntite shapes (Figura 1) nello spazio e una lunga durata temporalmente significare errori che sono più probabilmente causati da luogo chiuso in cui il segnale GPS è debole. Se un gruppo di questi punti è selezionata, il programma può calcolare il centroide spazio-temporale dei punti selezionati e regolare la traccia di passare attraverso il baricentro. </li><li> In alternativa, se &#39;Automatic&#39; è scelto dal pre-trattamento di menu, impostare l&#39;ingresso e posizioni di uscita nonché parametri empirici che determinano la velocità anomala alta e brusca svolta di punti. Il programma cerca attraverso i dati di traiettoria caricati e viene eseguito automaticamente in base a un algoritmo che simula la visuale approccio di rilevamento degli errori. </li></ol> 3. Traiettoria Segmentazione &amp; Space Caratterizzazione di attività <ol><li> Segmentazione della traiettoria richiede il livello di edificio, in modo da assicurarsi che il file viene caricato forma dell&#39;edificio. </li><li> Fare clic sullo strumento di segmentazione nella barra degli strumenti per avviare la funzione.Impostare l&#39;ingresso e uscita e trova il file di forma edificio come livello di riferimento. Utilizzare i nomi di costruzione di etichettare la traiettoria segmentato. L&#39;algoritmo identifica i segmenti interni basato su criteri predefiniti o di default come velocità, durata, ecc di punti di traccia, così come la topologia spaziale con riferimento agli edifici. </li><li> Istruzioni spazio strumento di attività summarization per caricare in traiettorie segmentati e calcolare gli attributi riassuntive selezionate per caratterizzare uno spazio di attività, come ad esempio raggio attività totale, raggio a un certo periodo di tempo, il rapporto del tempo totale trascorso in casa vs all&#39;aperto, e così via. </li><li> Gli attributi possono essere esportati in un foglio di calcolo per gli usi di modellazione quantitativa. </li></ol> 4. Densità superficiale Mapping <ol><li> Densità di superficie mostra la densità delle attività nello spazio con la dimensione temporale è crollato. Sono disponibili tre opzioni dal menu a discesa del menu mappatura densità superficiale. </li><li> Se l&#39;opzione &#39;densità di punti Track&#39; è selezionato, compilare la finestra di dialogo con le informazioni di input e di output e scegliere di visualizzare sia in 3D o 2D. Tutti i vertici dei dati di traiettoria vengono utilizzati per calcolare la densità dei punti kernel. Figura 2 mostra una superficie di densità. </li><li> Se la &#39;densità percorso Track&#39; è selezionata, l&#39;algoritmo calcola e visualizza la densità di percorsi individuali viaggiato (Figura 3). </li><li> Se l&#39;opzione &#39;densità Re-campionato punto&#39; è selezionata, l&#39;algoritmo di ri-campioni i dati di traiettoria con un intervallo di tempo e le mappe le densità di punti distribuiti in modo uniforme nel tempo. Questa opzione è progettata per i dispositivi di monitoraggio per la raccolta punti di monitoraggio a intervalli di tempo irregolari a causa della diversa sensibilità dei dispositivi in varie condizioni fisiche o le traiettorie segmentati. Figura 4 mostra le superfici di densità 2D e 3D di traiettorie segmentati. </li><li> Se &#39;temporale di messa a fuoco&#39; è stato selezionato per unny delle opzioni di cui sopra, temporale di messa a fuoco 10 può essere eseguita per esaminare i modelli di attività in periodi di tempo diversi. Ad esempio, le superfici di densità di attività in tempi diversi in un giorno possono essere visualizzati per una facile identificazione di hot spot attraverso il tempo (Figura 5). </li></ol> 5. Densità Stima Volume e Volume Rendering <ol><li> Volume di visualizzazione Densità utilizza la nozione di uno spazio-tempo cubo come nella visualizzazione di traiettorie. Il nucleo di visualizzazione quali è la disaggregazione di spazio in voxel 11. Il nostro approccio per visualizzare il volume prima densità stima del volume di densità in voxel singoli contando il numero di spazio-temporali tracce che si intersecano con i voxel. Si può fare clic su &#39;calcolo del volume di densità&#39; nel menu di visualizzazione densità di volume per questo passo. </li><li> Le stesse tre opzioni sono disponibili per la visualizzazione densità di volume come per la visualizzazione densità superficiale. </li><li> Fare clic su Avanti &#39;Rappresentazione volumetrica&#39; per lanciare l&#39;interfaccia di visualizzazione 3D del volume per il rendering interattivo dei volumi 12. Impostando il numero di divisioni lungo ogni asse, si possono esaminare i cluster a scale diverse. Un fattore z viene utilizzato per impostare l&#39;esagerazione verticale per una migliore visualizzazione. Uno strato di riferimento, come gli edifici possono essere caricati per aiutare la visualizzazione pure. I risultati di renderizzazione di volume può essere regolato in modo interattivo manipolando la funzione di trasferimento che controlla la mappatura di densità di colore. (Figura 6). </li></ol> 6. Altre analisi di dati esplorativi (EDA) e visualizzazioni <ol><li> Una procedura è disponibile per creare serie animata da visualizzare in Google Earth. Sotto &#39;Altro&#39;, fare clic su &#39;Esporta in KML per EDA&#39; di accedere a questa procedura. Esso crea un file di 13 kml che si apre in Google Earth per l&#39;animazione interattiva della traiettoria. </li><li> Si può seguire la traiettoria di travel &#39;ambiente in tempo scorrendo lungo la linea temporale in Google Earth. </li><li> Una procedura è disponibile per visualizzare le connessioni tra i luoghi di interesse attraverso &#39;l&#39;analisi di connessione&#39;. Ad esempio, le connessioni tra i diversi edifici in un campus universitario sono derivati ​​da dati di traiettoria segmentati che sono stati raccolti dagli studenti (Figura 7). </li><li> Sulla base delle connessioni derivate, punti caldi, come gli edifici con il traffico più in uscita o in entrata e hub che collegano i luoghi più trafficate possono essere identificate. </li></ol>

<ol>
	<li>Stoddard, S. T., Morrison, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+movement+in+the+transmission+of+vector-borne+pathogens.">The role of human movement in the transmission of vector-borne pathogens.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 3 (7), e10 (2009).</li><li>Morens, D. M., Folkers, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+emerging+and+re-emerging+infectious+diseases.">The challenge of emerging and re-emerging infectious diseases.</a> Nature. 430, 242-249 (2004).</li><li>Viboud, C., Bjornstad, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony,+waves,+and+spatial+hierarchies+in+the+spread+of+influenza.">Synchrony, waves, and spatial hierarchies in the spread of influenza.</a> Science. 312, 447-451 (2006).</li><li>Shoval, N., Isaacson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+tracking+technologies+to+the+study+of+pedestrian+spatial+behaviour.">The Application of tracking technologies to the study of pedestrian spatial behaviour.</a> The Professional Geographer. 58 (2), 172-183 (2006).</li><li>Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+GIS+design+for+exploring+interactions+of+human+activities.">Spatio-temporal GIS design for exploring interactions of human activities.</a> Cartography and Geographic Information Science. 33 (1), 3-19 (2006).</li><li>Kwan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+geovisualization+of+activity-travel+patterns+using+three-dimensional+geographical+information+systems:+a+methodological+exploration+with+a+large+data+set.">Interactive geovisualization of activity-travel patterns using three-dimensional geographical information systems: a methodological exploration with a large data set.</a> Transportation Research Part C. 8, 185-203 (2000).</li><li>Dem&#353;ar, U., Virrantaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space-time+density+of+trajectories:+exploring+spatio-temporal+patterns+in+movement+data.">Space-time density of trajectories: exploring spatio-temporal patterns in movement data.</a> International Journal of Geographical Information Science. 24 (10), 1527-1542 (2010).</li><li>Kraak, M., Koussoulakous, A., Fisher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A visualization environment for the space-time cube. , 189-200 (2004).</li><li>MacEachren, A. M., Polsky, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatial+relationships+among+health,+environmental,+and+demographic+statistics:+interface+design+issues.">Visualizing spatial relationships among health, environmental, and demographic statistics: interface design issues.</a> , 880-887 (1997).</li><li>Levory, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+surfaces+from+volume+data.">Display of surfaces from volume data.</a> IEEE Computer Graphics and Application. 8 (5), 29-37 (1998).</li><li>Drebin, R. A., Carpenter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+Rendering.">Volume Rendering.</a> Computer Graphics. , (1998).</li><li>Lee, W., Krumm, J., Zheng, Y., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trajectory+preprocessing.">Trajectory preprocessing.</a> Computing with Spatial Trajectories. , 3-34 (2011).</li><li>Han, B., Comaniciu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+kernel+density+approximation+and+its+application+to+real-time+visual+tracking.">Sequential kernel density approximation and its application to real-time visual tracking.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. , (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo usato aggiuntivo meccanismo di ArcGIS sviluppare l&#39;interfaccia. Tutte le operazioni interattive sono state realizzate in C + +. Tutto il trattamento automatico e funzioni di analisi sono state sviluppate utilizzando Python. Dati AGPS, o dati GPS raccolti da pedonale presenta sfida unica nel pre-elaborazione, come gli errori possono essere enormi a causa di adiacenza agli edifici e alle frequenti fermate interne. Inoltre, la messa a fuoco di pre-elaborazione non dovrebbe essere la...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> WorldTracker GPRS </td><td> Monitoraggio Il Mondo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Un personal computer per eseguire l&#39;analisi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ArcGIS software </td><td> ESRI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Traiettoria Analyzer Estensione </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trajectory data analyses for pedestrian space-time activity study

È ben noto che il movimento umano nelle dimensioni spaziali e temporali ha un&#39;influenza diretta sulla trasmissione della malattia 1-3. Una malattia infettiva si diffonde in genere attraverso il contatto tra individui infetti e suscettibili nei loro spazi di attività sovrapposte. Pertanto, l&#39;attività quotidiana mobilità-informazione può essere utilizzata come indicatore per misurare l&#39;esposizione a fattori di rischio di infezione. Tuttavia, una difficoltà maggiore e quindi la ragione per scarsità di studi di trasmissione di malattie infettive in scala micro derivano dalla mancanza di dati dettagliati mobilità individuale. In precedenza nel trasporto e turismo di ricerca dettagliati spazio-temporali dei dati relativi all&#39;attività spesso invocati lo spazio-tempo tecnica di diario, che richiede di registrare i soggetti attivamente le proprie attività nel tempo e nello spazio. Questo è molto impegnativo per i partecipanti e la collaborazione da parte dei partecipanti influisce notevolmente sulla qualità dei dati 4. Modernotecnologie come il GPS e le comunicazioni mobili hanno reso possibile la raccolta automatica dei dati di traiettoria. I dati raccolti, tuttavia, non è ideale per modellare umani spazio-temporali attività, limitata dalla precisione dei dispositivi esistenti. Non ci è inoltre strumento prontamente disponibili per l&#39;elaborazione efficiente dei dati per lo studio del comportamento umano. Vi presentiamo qui una serie di metodi e di un sistema integrato di ArcGIS desktop-based interfaccia visiva per le analisi di pre-elaborazione e spazio-temporale dei dati di traiettoria. Forniamo esempi di come tale processo possa essere utilizzato per modellare umani spazio-temporali delle attività, in particolare con i dati di errore pedonali ricchi di traiettoria, che potrebbero essere utili in studi sulla salute pubblica come la modellazione trasmissione di malattie infettive. La procedura presentata include pre-processing, segmentazione traiettoria, spazio caratterizzazione attività, stima della densità e la visualizzazione, e alcuni altri metodi di analisi esplorative. Pre-processing è la pulizia dei dati rumorosi traiettoria grezzi. Si introduce una visuale interattivo pre-elaborazione interfaccia così come un modulo automatico. Segmentazione della traiettoria 5 comporta l&#39;identificazione delle parti interne ed esterne di pre-lavorati spazio-temporali tracce. Ancora, sia segmentazione interattiva visiva e segmentazione automatica sono supportati. Segmentati spazio-temporali tracce vengono quindi analizzati per derivare le caratteristiche del proprio spazio di attività come stima raggio Densità attività ecc e visualizzazione sono utilizzati per esaminare grandi quantità di dati di traiettoria per modellare punti caldi e interazioni. Dimostriamo sia la mappatura densità superficiale e volume 6 il rendering densità 7. Abbiamo anche un paio di altre analisi esplorativa dei dati (EDA) e gli strumenti di visualizzazioni, come il supporto di animazione Google Earth e analisi della connessione. La suite di analitica e metodi visivi presentati in questo documento può essere applicato a tutti i dati di traiettoria per space-time attività consiste nello studio.

I dati sono stati raccolti dalla traiettoria volontariato studenti universitari da Kean University (NJ, USA) nella primavera del 2010. Lo scopo era quello di studiare i modelli di attività degli studenti che catturati influenza (diagnosticata dal medico o auto-diagnosi) rispetto a coloro che non hanno. Al fine di illustrare le modalità e le procedure presentate in questo documento abbiamo preso le traiettorie raccolti all&#39;interno dell&#39;area suburbana campus per generare i risultati rappresentativi. Traiettorie ...

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Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

Una serie di metodi di elaborazione spazio-temporali vengono presentati per analizzare dati di traiettoria umani, come quelli raccolti utilizzando un dispositivo GPS, al fine di modellazione pedonali spazio-temporali attività.

Le analisi per i dati di traiettoria pedonale Lo spazio-tempo di attività di studio

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

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Biologia

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Computer-Generated modello animale Stimoli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform routine activities, but prosthetic suspensions using traditional socket technology can prove to be cumbersome and uncomfortable for a person with limb loss.  Moreover, for those with high proximal amputations, limited residual limb length may prevent exoprosthesis attachment all together. Osseointegrated implant technology is a novel operative procedure which allows firm skeletal attachment between the host bone and an implant. Preliminary results in European amputees with osseointegrated implants have shown improved clinical outcomes by allowing direct transfer of loads to the bone-implant interface.  Despite the apparent advantages of osseointegration over socket technology, the current rehabilitation procedures require long periods of restrictive load bearing prior which may be reduced with expedited skeletal attachment via electrical stimulation.  The goal of the osseointegrated intelligent implant design (OIID) system is to make the implant part of an electrical system to accelerate skeletal attachment and help prevent periprosthetic infection. To determine optimal electrode size and placement, we initiated proof of concept with computational modeling of the electric fields and current densities that arise during electrical stimulation of amputee residual limbs.  In order to provide insure patient safety, subjects with retrospective computed tomography scans were selected and three dimensional reconstructions were created using customized software programs to ensure anatomical accuracy (Seg3D and SCIRun) in an IRB and HIPAA approved study.  These software packages supported the development of patient specific models and allowed for interactive manipulation of electrode position and size. Preliminary results indicate that electric fields and current densities can be generated at the implant interface to achieve the homogenous electric field distributions   required to induce osteoblast migration, enhance skeletal fixation and may help prevent periprosthetic infections.  Based on the electrode configurations experimented with in the model, an external two band configuration will be advocated in the future.

There is a need to develop alternative prosthesis attachment due to limb loss attributed to vascular occlusive diseases and trauma. The goal of the work is to introduce an osseointegrated intelligent implant design system to increase skeletal fixation and reduce periprosthetic infection rates for patients needing osseointegrated technology.

Analisi di un Sistema di bioelettrica Osteointegrata Intelligent Design impianto per amputati

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Eviscerazione delle Vitreous Mouse e Retina per analisi proteomica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Miglioramento Tecnica Swiss-laminazione per intestinale Preparazione del tessuto per immunoistochimica e analisi immunofluorescenza

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily through modulating protein-protein interactions. Similar to ubiquitin modification, SUMOylation is directed by a sequential enzyme cascade including E1-activating enzyme (SAE1/SAE2), E2-conjugation enzyme (Ubc9), and E3-ligase (i.e., PIAS family, RanBP2, and Pc2). However, different from ubiquitination, an E3 ligase is non-essential for the reaction but does provide precision and efficacy for SUMO conjugation. Proteins modified by SUMOylation can be identified by in vivo assay via immunoprecipitation with substrate-specific antibodies and immunoblotting with SUMO-specific antibodies. However, the demonstration of protein SUMO E3 ligase activity requires in vitro reconstitution of SUMOylation assays using purified enzymes, substrate, and SUMO proteins. Since in the in vitro reactions, usually SAE1/SAE2 and Ubc9, alone are sufficient for SUMO conjugation, enhancement of SUMOylation by a putative E3 ligase is not always easy to detect. Here, we describe a modified in vitro SUMOylation protocol that consistently identifies SUMO modification using an in vitro reconstituted system. A step-by-step protocol to purify catalytically active K-bZIP, a viral SUMO-2/3 E3 ligase, is also presented. The SUMOylation activities of the purified K-bZIP are shown on p53, a well-known target of SUMO. This protocol can not only be employed for elucidating novel SUMO E3 ligases, but also for revealing their SUMO paralog specificity.

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Unlike ubiquitin ligases, few E3 SUMO ligases have been identified. This modified in vitro SUMOylation protocol is able to identify novel SUMO E3 ligases by an in vitro reconstitution assay.

In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...