Gli autori desiderano ringraziare Travis Wheeler e l&#39;officina meccanica presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e Fisiologia, Università di Pittsburgh per la costruzione del palco campione crio-fluorescenza, Changlu Tao e Cheng Xu presso l&#39;Università di Scienza e Tecnologia della Cina per il tecnico assistenza, e il Dr. Teresa Brosenitsch per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (GM082251 &amp; GM085043).

1. HeLa Cell Culture on Carbon-rivestito, Oro EM Finder Grids <ol><li> Scarica luminescente il carbonio-lato di un R2 da 200 maglie / 2 Quantifoil oro EM griglia finder sotto i 25 mA per 25 sec. </li><li> Rivestire la griglia EM con fibronectina, da galleggianti che, carbonio rivolto verso il basso, su un 40 microlitri goccia di 50 mg / ml soluzione fibronectina, poi disinfettare sotto luce UV per 2 ore in una cappa di coltura di tessuti. </li><li> Piastra cellule HeLa sulla griglia ad una densità di 2 x 10 4 cellule / ml (totale 2 cultura ml) in un piatto fondo di vetro cultura e crescere le cellule a 37 ° C, con il 5% di CO 2, in DMEM supplementato con 4,5 g / L di L-glutammina e glucosio, 10% di siero fetale di vitello siero, 100 unità / ml di penicillina, e 100 pg / ml streptomicina, per circa 18 ore. Cellule HeLa sono infettate dopo coltura O / N. </li></ol> 2. HIV-1 e live-cell imaging <ol><li> Aggiungi un tracker cellula fluorescente (Red CMTPX, 1 ml / 2 ml) nella cultura con fondo di vetropiatto (dal punto 1.3) e incubare il piatto a 37 ° C per 10 minuti, per consentire up-take del colorante fluorescente. </li><li> Lavare le cellule con PBS e aggiungere 50 microlitri mezzo fresco pre-riscaldato. </li><li> Porre la capsula sulla camera di live-cell, a 37 ° C, di un Campo sweep microscopio confocale a scansione. Selezionare più campi (10-15 posizioni) che contengono 1-3 cellule / quadrati, con le celle tra due fasi di mitosi, quando sono più spread-out e piatta (vedi figure 2c e 2d), dal momento che richiede cryoEM regioni relativamente sottili di campione. Conservare queste posizioni per il futuro di imaging (passo 2.5). </li><li> Infettare le cellule con VSV-G pseudo-tipizzate HIV-1 particelle contenenti GFP-Vpr (usiamo 40 pl di un campione contenente 40 ng / ml di p24). Quando aggiungendo le particelle del virus nel fondo del piatto, fare attenzione a non disturbare la griglia EM, poiché le posizioni per l&#39;imaging sono già stati selezionati e memorizzati. </li><li> Subito dopo l&#39;aggiunta di virioni, raccogliere TIme-lapse ad alta velocità immagini confocali 3D, nelle posizioni precedentemente selezionati (dal punto 2.3) per 20-40 min. </li><li> Immagini confocali sono state acquisite utilizzando MetaMorph e analizzati dal automatizzato di monitoraggio di particelle 3D per la dinamica delle particelle singole utilizzando il software Imaris (vedere Figura 1). Dal momento che stiamo correlando il comportamento dinamico di diffrazione limitata HIV-1 particelle con ultrastruttura cellulare, time-lapse live-cell imaging e il monitoraggio delle particelle 3D sono fondamentali per il risultato. Tuttavia, per una struttura grande e statico, una semplice immagine di fluorescenza (senza live-cell) sarebbe sufficiente per l&#39;analisi correlativa. </li></ol> 3. Frozen-idratato EM Preparazione del campione Per ridurre al minimo l&#39;intervallo di tempo tra la raccolta dell&#39;ultima immagine confocale e crio-fissazione del campione, la FEI Vitrobot (o altro dispositivo di vetrificazione) deve essere iniziato e preparato per immersione-congelamento durante la raccolta di immagini di fluorescenza live-cell confocale.<ol><li> Accendere il dispositivo vetrificazione e impostare la temperatura clima a 22 ° C, il bersaglio umidità al 100%, il tempo blotting a 7 secondi, e l&#39;attesa e drenare il tempo di 1 sec. </li><li> Posizionare il contenitore griglia nel stantuffo dewar e preparare etano liquido freddo. Montare il dewar sul dispositivo vetrificazione. </li><li> Subito dopo il live-cell imaging confocale (sezione 2), posizionare il piatto di coltura su un blocco di rame raffreddato a ghiaccio e trasferirlo alla sala di preparazione del campione cryoEM. Caricare la griglia EM sulle pinzette specializzati e rapidamente asciugare lontano qualsiasi supporto sulla griglia. L&#39;assorbente è manuale, con carta da filtro, dopo che 4 ml di soluzione di 15 nm perline oro mescolato con 0,2 micron microsfere fluorescenti vengono immediatamente immessi in rete. Le perle oro usati come marcatori fiduciali per aiutare raccolta dati tomografici e allineamento. Le microsfere fluorescenti sono utilizzati per aiutare correlazione tra le immagini fluorescenti e cryoEM (Cfr. Figure 2c-2F). </li><li> Caricare le pinzette sul dispositivo vetrificazione e istruire il dispositivo per cancellare e immergersi congelare in etano liquido 16. I parametri blotting ottimizzati per ottenere risultati migliori sono: tempo di macchia, 7 sec; macchia offset, 0, tempo di scarico, 1 sec, temperatura, 22 ° C, e l&#39;umidità, al 100%. </li><li> Trasferire la griglia frozen-idratato ad un supporto per l&#39;imaging cryoEM cryoET immediato, o ad un dewar di azoto liquido stoccaggio per un uso successivo. </li></ol> 4. Cryo-microscopia a fluorescenza luce È necessario un sistema di home-built, camera campione crio-fluorescenza e fase (Figura 3) per effettuare passaggi 4,1-4,10. Le specifiche dettagliate e descrizione della fase possono essere trovati in giugno et al. 15. <ol><li> Riempire un auto-pressione di azoto liquido dewar di azoto liquido, almeno 2 ore prima di iniziare la microscopia ottica crio-fluorescenza (vedi Figura 3a). </li><li> Montare un autocostruito crio-fFase campione luorescence 15 (figura 3) su un microscopio a fluorescenza invertito, come ad esempio una Olympus IX 71. </li><li> Collegare l&#39;ingresso di azoto liquido della fase di crio-campione per la auto-pressione dewar e posizionare la presa di protezione troppo pieno di azoto liquido in un contenitore idoneo. Collegare una linea di gas azoto secco a un manicotto posto sopra la lente obiettivo una lente caldo e dal gelo. </li><li> Posizionare una piattaforma di blocco di rame (freccia nera nella figura 3b) nella camera di crio-stadio per il caricamento della griglia campione congelato-idratato. Raffreddare e riempire la camera del crio-stage in rame con azoto liquido attraverso la linea di ingresso dalla auto-pressione di riempimento dewar. </li><li> Quando la crio-stadio raggiunge la temperatura dell&#39;azoto liquido (in ~ 4-6 min), trasferire il contenitore griglia (dal punto 3.5) per la crio-stage. </li><li> Posizionare la griglia campione congelato-idratato nella cartuccia campione EM sul blocco rame e clip la gliberati in posizione utilizzando un anello a C (se si utilizza una cartuccia Polara microscopio), o posizionare un anello di rame pre-raffreddata in cima (nero punta di freccia in Figura 3d), per mantenere la griglia in posizione e anche per un facile recupero della griglia dopo crio-imaging di fluorescenza (se per un non-Polara crio-microscopio elettronico). </li><li> Posizionare la cartuccia (dal punto 4.6) nella camera interna del crio-stadio (bianco punta di freccia in Figura 3b). </li><li> Cerca e trova le stesse particelle di virus dai dati live-cell imaging. Poiché la griglia EM ha un indice, è semplice per localizzare la stessa particella in griglia in entrambe le immagini dal vivo di cellule e immagini crio-florescence. </li><li> Acquisire crio-DIC e immagini GFP nelle posizioni individuate in crio-condizione utilizzando un microscopio ottico con un lungo lavoro (2,7-4 mm) lente dell&#39;obiettivo. Durante la rappresentazione crio-fluorescenza, controllare periodicamente il livello di azoto liquido nella crio-stadio e riempirlo, se necessario, per mantenere la fase di esempio -170° C. </li><li> Al completamento di crio-imaging di fluorescenza, riportare accuratamente la cartuccia campione alla piattaforma di blocco rame e conservare la cartuccia in un dewar di azoto liquido per future analisi cryoET con un sistema Polara. Se si utilizza un non-Polara crio-microscopio elettronico, rimuovere l&#39;anello di rame, recuperare la griglia del campione, trasferirli in un contenitore griglia, e conservare il campione in un liquido di azoto dewar fino a quando il campione viene esaminato da cryoET. </li><li> Per l&#39;analisi dei dati, sovrapporre le immagini crio-DIC e GFP acquisite (dal punto 4.9, vedere la Figura 4b) e correlare le posizioni dei segnali GFP nell&#39;immagine crio-fluorescenza con quelli ottenuti nella serie live-cell imaging. </li></ol> 5. Crio-elettroni tomografia <ol><li> Caricare la cartuccia campione nella stazione crio-trasferimento di un microscopio elettronico equipaggiato con una pistola ad emissione di campo, come ad esempio G2 Polara microscopio. </li><li> In modalità a basso dosaggio di ricerca con un ingrandimento di 140X, identify e salvare i quadrati della griglia associati (dal punto 4.11) in un file di scena. </li><li> In modalità a basso dosaggio di ricerca con un ingrandimento di 3500 X, inserire un 100 micron obiettivo diaframma, ricerca e salvare tutte le posizioni correlate con segnali GFP in un secondo file palco. </li><li> In modalità a bassa dose di esposizione, trovare un&#39;area vuota per regolare l&#39;intensità del fascio ad una dose di 1 o 2 e - / A 2 e perfezionare l&#39;asse di inclinazione, utilizzando la funzione y palco, bruciando via il ghiaccio in una regione di carbonio senza importanza con diverse perline d&#39;oro. </li><li> In modalità bassa dose-fuoco, regolare la distanza di messa a fuoco per ~ 3 micron e regolare l&#39;angolo di allineare la direzione di messa a fuoco per essere parallelo all&#39;asse di inclinazione. </li><li> In modalità a basso dosaggio di ricerca, recuperare posizioni salvate (dal punto 5.3), regolare l&#39;altezza eucentrica campione e controllare il range di inclinazione per l&#39;area di interesse. Acquisire un&#39;immagine di proiezione con una bassissima dose di elettroni (~ 1 e - / a 2) a 8 a 10 micron di sfocatura, in manifestazionimodalità ure, per confermare le particelle del virus correlate per tomografia crio-elettroni. </li><li> Passare alla modalità a basso dosaggio-focus. In TEM menù automatico funzioni, precedere l&#39;altezza eucentrica automatizzato e concentrare le funzioni di messa a fuoco. </li><li> Impostare i parametri per l&#39;acquisizione di un tilt-serie. Per la figura 4 in questo lavoro, angoli di inclinazione che vanno ± 70 °, al di sotto e al di sopra di 45 °, al 3 ° e 2 ° di inclinazione con incrementi, rispettivamente, sono stati utilizzati, con un 6 micron defocus e circa 70 e - / A 2 dose totale. </li><li> Ripetere i passi 5.7 e 5.8 per tutte le posizioni salvate. Software Batch tomografia può essere utilizzato per la raccolta dati automatizzata per più posizioni per aumentare il throughput. </li></ol> 6. Ricostruzione tridimensionale utilizzando IMOD 17 <ol><li> Ispezionare la serie tilt crudo per regolare i valori minimi e massimi di densità e di determinare se vi è alcun fine di essere esclusi a causa della grande spostamento dell&#39;immagine. </li><li> Avviare eTomo e pannello tomogramma configurazione utilizzando tipo di asse, dimensioni in pixel, diametro fiduciali, ecc. Poi creare script com. </li><li> Configurare la finestra principale in modo tale che le varie fasi del calcolo tomogramma possono essere regolati / seguite contemporaneamente. Modificare i parametri necessari ed eseguire i programmi specifici che sono necessari per ogni fase di lavorazione (vedi eTomo esercitazione, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> Nella fase finale, creare uno stack completo allineata (con un errore medio residuo inferiore a 0,6) e ricostruire tomogrammi utilizzando un algoritmo di retroproiezione ponderata in IMOD. </li><li> Denoising potenziali aree di interesse con un programma 3D non lineare anisotropa diffusione bordo migliorando implementato in IMOD con i parametri appropriati per migliorare il contrasto e la nitidezza. </li></ol>

<ol>
	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry.">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li><li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes.">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li><li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages.">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

Gli autori dichiarano alcun interesse finanziario in competizione.

Abbiamo presentato una serie di semplici protocolli di fornire un approccio correlativo avanzato per analizzare gli eventi cellulari dinamici usando time-lapse imaging di fluorescenza confocale, live-cell seguita da cryoET. Il nostro sviluppo metodologico di correlare 3D live-cell imaging ad alta risoluzione cryoET è fondamentale per studiare molti problemi biologici complessi, come ad esempio la visualizzazione (non statico, come riportato in precedenza) e diffrazione di particelle rare, dinamiche limitate virali e le...

Tomografia crio-elettroni (cryoET) è una tecnica di imaging potente che permette a tre dimensioni (3D) visualizzazione di cellule e tessuti e fornisce approfondimenti nell&#39;organizzazione di organelli nativi e strutture cellulari a risoluzione molecolare in un close-to stato fisiologico 1. Tuttavia, il contrasto di intrinsecamente bassa macchia preparato congelato-idratato, combinata con la loro sensibilità alle radiazioni, rende difficile individuare aree di interesse all&#39;interno di una cella e successivamente eseguire con successo la serie di inclinazione senza danneggiare l&#39;area bersaglio. Per superare questi problemi, un approccio correlativo che combina microscopio ottico ed elettronico è necessario. Caratteristiche specifiche evidenziate dalla marcatura fluorescente vengono identificati e localizzati al microscopio ottico a fluorescenza, e quindi le loro coordinate sono trasferiti al microscopio elettronico per l&#39;acquisizione dei dati strutturali resolution 3D elevate. Questo metodo correlativo aiuta localizzare il bersaglio unaReas di interesse da affrontare. A causa della limitazione dello spessore del campione con cryoEM (&lt;300 nm), attualmente solo le regioni periferiche della cellula sono adatti per l&#39;analisi strutturale 3D da CryoET. Riducendo ulteriormente lo spessore dei campioni congelati-idratato vitreo sezionamento 8 o da crio-fascio ionico focalizzato (FIB) fresatura 9 sarebbe espandere la capacità di rappresentazione correlativa. In precedenza, i metodi correlativi sono stati utilizzati principalmente per facilitare l&#39;acquisizione dei dati cryoET per grandi e statico delle strutture 10-13. In questi studi, sono stati implementati crio-fasi di accettare griglie cryoEM e sta su sia un microscopio verticale o di un microscopio invertito 10,11,14. Anche se il passaggio griglie sembra abbastanza semplice nei loro disegni, ci sono ulteriore trasferimento di passaggi necessari per la griglia EM, aumentando la probabilità che la griglia può essere deformato, danneggiato e contaminato. Abbiamo recentemente dimostrato un progresso tecnico inmicroscopia correlativa che ci permette di visualizzare direttamente gli eventi dinamici che sono per loro natura difficili da catturare, come l&#39;HIV-1 e le interazioni delle cellule ospiti nelle fasi iniziali di infezione 15. Abbiamo compiuto questo attraverso la progettazione e l&#39;attuazione di una fase di campionamento crio-microscopia luce che si adatta un sistema a cartuccia per ridurre al minimo i danni del campione a causa di manipolazione della rete, facilitando così la correlazione. Il nostro design include un supporto integrato della cartuccia campione, consentendo sia crio-microscopia luce e crio-elettroni da eseguire, in sequenza, sullo stesso supporto del campione, senza trasferimento del campione, semplificando così il processo correlativo. Inoltre, abbiamo anche implementato una procedura di correlazione precisa e affidabile utilizzando fluorescenti sfere di lattice come marker fiduciali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

Tomografia crio-elettroni (cryoET) permette la visualizzazione 3D delle strutture cellulari a risoluzione molecolare in uno stato prossimo al fisiologico 1. Tuttavia, visualizzazione diretta dei singoli complessi virali nel loro ambiente cellulare ospite con cryoET è impegnativo 2, a causa della natura infrequenti e dinamica di ingresso del virus, in particolare nel caso di HIV-1. Mentre time-lapse live-cell imaging ha prodotto una grande quantità di informazioni su molti aspetti del ciclo di vita del virus HIV-1 3-7, la risoluzione offerta dalla microscopia live-cell è limitata (~ 200 nm). Il nostro lavoro è stato finalizzato a sviluppare un metodo di correlazione che permette la visualizzazione diretta di eventi precoci di infezione da HIV-1, combinando live-cell a fluorescenza microscopia ottica, microscopia a crio-fluorescenza, e cryoET. In questo modo, i segnali cellule vive e crio-fluorescenti possono essere usate per guidare con precisione il campionamento in cryoET. Inoltre, le informazioni strutturali ottenute da cryoET può be integrato con i dati funzionali dinamici acquisita attraverso live-cell imaging di fluorescenza bersaglio marcato. In questo articolo video, forniamo i dettagli sui metodi e protocolli di indagine strutturale del virus HIV-1 e interazioni ospite-cellulari utilizzando 3D live-cell imaging ad alta velocità correlativo e ad alta risoluzione cryoET analisi strutturale. Cellule HeLa infettate con HIV-1 particelle sono stati caratterizzati in primo luogo dalla microscopia confocale live-cell, e la regione che contiene la stessa particella virale è stata poi analizzati mediante tomografia crio-elettroni per i dettagli strutturali 3D. La correlazione tra le due serie di dati di imaging, imaging ottico ed elettronico di imaging, è stato realizzato utilizzando una fase microscopio ottico a fluorescenza crio-casa-costruita. L&#39;approccio qui descritto sarà prezioso, non solo per lo studio delle interazioni delle cellule virus-ospite, ma anche per applicazioni più ampie in biologia cellulare, come la segnalazione cellulare, il traffico di recettore di membrana, e molti altri processi cellulari dinamici. &lt;/ P&gt;

Per caratterizzare il comportamento dinamico delle particelle del virus, cellule HeLa infettate con HIV-1 sono state ripreso mediante microscopia confocale live-cell ad alta velocità ed i movimenti delle particelle sono state analizzate mediante rilevamento automatizzato particella 3D (Figura 1). Per evitare che il lasso di tempo di alcuni minuti che si possono verificare tra raccolta dell&#39;ultima immagine live-cell confocale e tuffo di congelamento (che può essere abbastanza a lungo per perdere co...

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Descriviamo un metodo di microscopia correlativa che combina 3D live-cell microscopia a luce fluorescente ad alta velocità e la tomografia crio-elettroni ad alta risoluzione. Dimostriamo la capacità del metodo correlativo di imaging dinamico, piccoli HIV-1 particelle interagiscono con le cellule HeLa ospitanti.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. Descriviamo un metodo di microscopia correlativa che combina 3D live-cell microscopia a luce fluorescente ad alta velocità e la tomografia crio-elettroni ad alta risoluzione. Dimostriamo la capacità del metodo correlativo di imaging dinamico, piccoli HIV-1 particelle interagiscono con le cellule HeLa ospitanti.

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Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Studiare la Stechiometria di Epidermal Growth Factor Receptor in cellule intatte con correlativa Microscopia

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Ricerca

Bioingegneria

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Analisi meccanica dinamica ambientale per predire il comportamento di rammollimento di impianti neurali

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...