Questo lavoro è stato essenzialmente il sostegno da 5-UO1-ES016045 con il parziale supporto da 1-R21-R44-ES019498 e ES021116. DMW è stato sostenuto dal NIEHS Training Grant Tossicologia ambientale T32-ES007020. Attrezzatura è stato fornito dal Centro per le Scienze Salute ambientale P30-ES002109.

1 Preparazione di Chip <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere il gel chip dalla confezione e posto in un lato di un singolo-ben piatto rettangolare, gel basso. </li><li> Lavare il gel in 25 ml di PBS 1X per 15 min, ripetere due volte. </li><li> Impostare gel sulla lastra di vetro ed orientamento etichetta di gel di conseguenza. </li><li> Premere delicatamente un fondo piastra a 96 pozzetti rovesciata sul gel; assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra pozzo senza fondo sono all&#39;interno della zona del gel. </li><li> Utilizzare 1,5 &#39;&#39; legante clip su ciascun lato della piastra di bloccaggio per fissare il vetro. </li><li> Aspirare l&#39;eccesso di tampone PBS in ogni pozzetto. </li></ol> 2. celle di carico <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparare sospensioni cellulari: <ol><li> Per linee cellulari di sospensione, diluire la sospensione cellulare in media per ottenere una concentrazione finale di 10 5 -10 6 cellule / ml. </li><li> Per le linee di cellule aderenti, seguire le normali Detaching protocolli / tripsinizzazione e dilute cellule staccate in media per una concentrazione finale di 10 5 -10 6 cellule / ml. Se le cellule si aggregano, passare sospensione cellulare in un filtro cella per ottenere una sospensione di cellule singole. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. </li><li> Coprire la piastra con la pellicola di gel per evitare l&#39;evaporazione dei media. </li><li> Consentono alle cellule di carico per almeno 30 min a 37 ° C incubatore. </li><li> Rimuovere chip dalla incubatori e aspirare i media da ogni pozzetto. </li><li> Rimuovere clip legante e senza fondo piastra a 96 pozzetti; tenere il chip con la lastra di vetro in un angolo e lavare delicatamente con 1x PBS per rimuovere le cellule in eccesso su agarosio. </li><li> Controllare il carico delle cellule utilizzando un microscopio in campo chiaro con una lente obiettivo 4X. Se il caricamento insufficiente si osserva, ripetere dal punto 2.1. </li><li> Posizionare Chip caricato su una superficie piana (banco di laboratorio). Chip Overlay con 1% a basso punto di fusione (LMP) agarosio che è pre-riscaldato a 37 ° C. Utilizzare circa 2̵1, 3 ml di agarosio LMP è necessario per ogni chip. </li><li> Consenti sovrapposizione solidificare prima a temperatura ambiente per 3 minuti e poi passare a 4 ° C frigorifero per 5 minuti per la completa gelificazione. </li></ol> 3 Dosaggio e Riparazione NOTA: Per studiare il DNA al basale livello di danno, passare alla Fase 4. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Allineare con cura i pozzi del chip (creato da bloccaggio precedente) con i pozzetti di una nuova piastra a 96 pozzetti fondo. Re-pressa la piastra a 96 pozzetti fondo sulla chiusura superiore e sicuro con clip legante. </li><li> Aggiungere 100 ml di chimica di dose desiderata in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti; eseguire dosaggio / terapia in ghiaccio o 4 ° C frigorifero per tempo desiderato. </li><li> Dopo il dosaggio, prodotti chimici di aspirato di ogni bene e sciacquare via chimica residua utilizzando 1x PBS. Se il danno diretto è studiato qui, passare alla Fase 4. </li><li> Per studiare la cinetica di riparazione, permettere cellule nel chip di riparare insupporti a 37 ° C. Lyse (passare al punto 4) in punti temporali specifici. NOTA: riparazione può essere effettuata on-chip con una piastra a 96 pozzetti fondo collegato, o il chip può essere tagliato in pezzi separati dopo la rimozione della piastra a 96 pozzetti fondo. </li></ol> 4. Lysis <ol style="margin-left: 40px;"><li> Per eseguire alcalino test della cometa: <ol><li> Fate lavorare tampone di lisi alcalina con l&#39;aggiunta di 1% Triton X-100 di soluzione alcalina lisi magazzino (2.5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, Tris 10 mM, pH 10). Preparare circa 25 ml di lavoro tampone di lisi per ogni chip. </li><li> Pre-gelo di lavoro tampone di lisi alcalina a 4 ° C. </li><li> Immergere chip fresco tampone di lisi alcalina di lavoro e consentire lisi di eseguire O / N a 4 ° C frigorifero. </li></ol></li><li> Per eseguire Comet assay neutrale: <ol><li> Fate lavorare tampone di lisi neutralità aggiungendo 1% Triton X-100 e il 10% DMSO alla soluzione di lisi magazzino neutro (2.5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Preparare circa 25 ml di lavoro tampone di lisi per ogni chip. </li><li> Preriscaldare il tampone di lisi neutro a 43 ° C. </li><li> Immergere chip caldo tampone di lisi neutro di lavoro e permettono di eseguire lisi O / N a 43 ° C incubatore. </li></ol></li></ol> 5. elettroforesi <ol style="margin-left: 40px;"><li> Per eseguire alcalino test della cometa: <ol><li> Rimuovere tampone di lisi e rapidamente risciacquare chip con 1x PBS. </li><li> Chip di sicuro in una camera di elettroforesi con gel lato pellicola rivolto verso il basso con nastro biadesivo. </li><li> Portare la camera a 4 ° C in camera fredda. </li><li> Riempire la camera con tampone alcalino freddo elettroforesi (0,3 M NaOH, 1 mM Na 2 EDTA) ad un livello che copre solo il gel. </li><li> Lasciare per rilassarsi alcalina per 40 min. </li><li> Eseguire elettroforesi a 1 V / cm e 300 mA per 30 minuti nella stanza fredda. Regolare il volume di tampone per elettroforesi in chamber per ottenere corrente in esecuzione desiderato. </li></ol></li><li> Per eseguire Comet assay neutrale: <ol><li> Rimuovere tampone di lisi e risciacquare chip con buffer per elettroforesi neutro (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM acido borico, pH 8,5) per 2 x 15 min a 4 ° C. </li><li> Chip di sicuro in una camera di elettroforesi con gel lato pellicola rivolto verso il basso con nastro biadesivo. </li><li> Portare la camera a 4 ° C in camera fredda. </li><li> Riempire la camera con tampone di elettroforesi neutro freddo (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM di acido borico, pH 8,5) ad un livello che copre solo il gel. </li><li> Lasciare che il gel di sedersi in camera fredda per 60 min. </li><li> Eseguire elettroforesi a 0.6 V / cm e 6 mA per 60 minuti nella stanza fredda. Regolare il volume di tampone di elettroforesi nella camera di ottenere corrente di funzionamento desiderato. </li></ol></li></ol> 6. Imaging fluorescente <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere chip dalla camera di elettroforesi da colsala d. </li><li> Neutralizzare il gel in tampone di neutralizzazione (0,4 M Tris, pH 7.5) per 2 x 15 min a 4 ° C frigorifero. </li><li> Colorare il chip con il DNA macchia fluorescente di scelta (cioè, SYBR oro, il bromuro di etidio) sotto la fabbrica procedure raccomandato. Immagine usando la microscopia a fluorescenza. </li></ol> Analisi dei dati 7. Analizzare cometa Immagini da software test della cometa di serie come il Komet 5.5.

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The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

Genotossine ubiquitario nell&#39;ambiente e anche all&#39;interno delle cellule umane esercitano inevitabile stress e danni al DNA cellulare. In realtà, è stato stimato che ci sono 1.000 s di lesioni presenti nelle cellule umane allo stato stazionario 18 DNA. Capire danni suscettibilità e cinetica di riparazione negli esseri umani non solo porta intuizione di ricerca di base, ma beneficia anche lo sviluppo di farmaci. Ironia della sorte, nonostante la possibilità di danni al DNA per promuovere il cancro, DNA agenti dannosi sono utilizzati a livelli molto alti per curare il cancro, facendo conoscenza di danni al DNA e riparare pertinenti alla medicina personalizzata. Il CometChip è un dispositivo di ricerca romanzo che utilizza pratiche di microfabbricazione di rivoluzionare un lungo-esisteva test danno al DNA. Sulla base degli stessi principi del tradizionale test della cometa, il chip fornisce un throughput significativamente più alto e migliore riproducibilità. Descriviamo qui i metodi per l&#39;utilizzo di questo chip. Per chiarire la sua utilità e la robustezza, mostriamo risultati from diversi esperimenti in cui il chip è stato utilizzato per valutare il danno indotto da diversi agenti che danneggiano il DNA differente, e dove è stato utilizzato per valutare la riparazione del DNA. Insieme, i risultati qui presentati forniscono informazioni utili per utilizzare il chip e dimostrano la sua ampia applicabilità per la ricerca sul danno e riparazione del DNA. Uno dei passi più importanti di questo protocollo è quello di realizzare efficaci carico delle cellule. Molte linee cellulari sono stati testati su tale sistema, che comprende sia la sospensione e cellule aderenti. Caricamento efficienza dipende da molte variabili quali il tipo di cellule, le dimensioni delle cellule, la concentrazione di carico e di tempo. Linee cellulari di sospensione come le cellule linfoblastoidi sono le più facili da lavorare. Concentrazione di sospensione cellulare può variare dal 10 aprile - 10 giugno cellule per 96 pozzetti e caricamento di solito completa in 15-30 min. Maggiore densità cellulare facilita il carico e riduce la quantità di tempo necessario per le cellule per risolvere nei pozzetti. Parametri di carico per cellule aderenti possono differire da cellule in sospensione. Le linee cellulari quali ovarica di criceto cinese (CHO) cellule, sono stati trovati ad avere simile efficienza di carico come cellule in sospensione (dopo tripsinizzazione) e utilizzare condizioni di carico analoghe così. Altri tipi di cellule, come le cellule tumorali che formano facilmente aggregati di cellule in sospensione, richiedono ulteriori manipolazioni. Passando sospensioni cellulari attraverso un filtro a singola cella e l&#39;aggiunta di tripsina ai media sospensione può sopprimere la formazione di gruppi di cellule durante il caricamento. Infine, in termini di tempo di caricamento, il tempo richiesto per l&#39;acquisizione linee cellulari aderenti nei pozzetti può variare da 20 minuti a 1 ora. Di conseguenza, si raccomanda che gli utenti eseguono esperimenti pilota per determinare le condizioni di carico ottimali, prima di procedere ad ulteriori indagini. Caricamento efficacia può essere visualizzato al microscopio in campo chiaro o più precisamente rivelato da colorazione delle cellule incapsulate con DAPI o di altro DNAmacchie prima della valutazione al microscopio a fluorescenza. Uno dei principali vantaggi di questo metodo e chip è la versatilità. In primo luogo, i ricercatori non sono limitati ad una concentrazione cellulare di lavoro specifico perché le cellule in eccesso vengono lavate via, e il microarray assicura uniforme cometa densità. In secondo luogo, i pozzetti possono essere realizzati con dimensioni variabili per accomodare tipi cellulari di diverse dimensioni. In circostanze che più celle vengono catturati in una singola micropozzetti, comete multi-cellulari sono risultati di auto-calibrato e resa coerente rispetto alle comete monocellulari 6,7. Un altro vantaggio di patterning cellule in un microarray è che tutte le comete sono quindi allo stesso piano focale con posizioni fisse, ridurre il rumore a causa di comete sfocate e facilitare l&#39;imaging e di analisi automatizzata. I miglioramenti significativi nella velocità e sensibilità fornite dal CometChip consentono l&#39;applicazione del test per studi su larga scala. Nel loro insieme, il chip forniscesa strumento prezioso per la valutazione dei danni del DNA per ricercatori, tossicologi, medici ed epidemiologi. Mentre il test della cometa è nota per la sua eccellente sensibilità nel rilevare una vasta gamma di danni al DNA, questo saggio soffre anche di bassa specificità. Usando questo protocollo migliora notevolmente la riproducibilità e la velocità del test, ma non dimostra l&#39;avanzamento in specificità. Tuttavia, il multiplexing il test con altre metodologie è stato segnalato per essere efficace nel raggiungere una maggiore specificità. Un esempio è l&#39;inclusione di enzimi specifici per lesione purificati. Questi enzimi possono convertire le lesioni di base altrimenti non rilevabili in rotture dei filamenti rilevabili e siti abasic 1,19-21. Un esempio ampiamente utilizzato è la riparazione endonucleasi glicosilasi formamidopyrimidine-DNA (FPG), che rivela le modifiche del DNA ossidativo 19,22. Poiché la fase di digestione enzimatica viene applicato dopo lisi cellulare, il sistema può essere trattato allo stesso modo unsa tradizionale slitta di agarosio, senza modifiche al protocollo. Anche se il protocollo dettagliato non è descritto qui, questo approccio è stato adattato da molti utenti tradizionali Comet test in passato e protocolli possono essere trovati facilmente. In una pubblicazione precedente, abbiamo usato questo metodo per identificare luce fluorescente indotto danni 22. Il principale vantaggio di questo metodo è la velocità che fornisce, che apre le porte a studi che prima erano praticamente impossibile. La capacità di elaborare 96 campioni sulla stessa piattaforma non solo riduce il lavoro e il tempo, ma riduce anche i rumori sperimentali e migliora notevolmente la riproducibilità. Variazione Inter campione è significativamente inferiore rispetto al tradizionale variazione slide-to-scivolo, che può essere di 2 volte superiore alla variazione osservata con questo chip 6,7. Rumorosità ridotta porta anche a una maggiore sensibilità, consentendo la rilevazione di differenze più sottili tra i campioni. Poiché il dispositivo utilizza una standard formato a 96 pozzetti, che sia compatibile con le apparecchiature generale ricerca e HTS tecnologie. Si consideri uno studio che richiede la valutazione di 100 campioni, partendo dal presupposto che un ricercatore medio può elaborare ~ 30 vetrini nel corso di diversi giorni. Dato che ogni campione deve essere eseguita in triplice copia, ci sarebbe voluto circa un mese per completare un tale studio, che sarebbe anche inevitabilmente soffrono da campione a campione variazione. Al contrario, l&#39;elaborazione di 100 condizioni, ciascuna in triplice copia, con questo chip richiede solo pochi piatti e possono essere eseguiti in tre giorni. Questo importante miglioramento del throughput apre la porta a studi che prima erano irraggiungibili. Il protocollo presentato qui descrive entrambe le procedure di base per eseguire il test della cometa di serie e le misure modificate necessari per utilizzare la piattaforma CometChip. Con la capacità di misurare entrambi i livelli di danno al DNA inerenti e la successiva risposta di riparazione, il saggio è molto importante peruna varietà di applicazioni biologiche e cliniche. Le informazioni sull&#39;impatto delle specifiche esposizioni chimiche sul genoma facilita la prevenzione e la cura delle malattie. Inoltre, vi è anche un interesse significativo nel determinare variazioni nel DNA danni sensibilità e capacità di riparazione tra gli individui 23,24. Questa tecnica fornisce il throughput richiesto per tali studi su larga scala. La conoscenza inter-variazioni individuali è fondamentale per identificare le persone sensibili e per la progettazione di terapie individualizzate o strategie prevenzioni. Nel loro insieme, la tecnologia qui presentato fornisce un elevato throughput, piattaforma di analisi del danno al DNA oggettiva e quantitativa che ha il potenziale per diventare una metodologia standard nel prossimo futuro.

L&#39;elettroforesi su gel singola cellula (SCGE) assay (aka il test della cometa) è una tecnica ampiamente utilizzata per la quantificazione di un ampio spettro di lesioni del DNA, tra cui lesioni di base, siti abasic, rotture singolo filamento, rotture del doppio filamento, legami crociati e alcali sensibile siti. Il principio alla base del saggio è che il DNA danneggiato migra più facilmente di DNA intatto a causa della frammentazione e perdita di struttura superelicoidale. L&#39;entità della migrazione è proporzionale alla quantità di danno al DNA, e può essere osservata con un microscopio a fluorescenza. Immagine-cattura e analisi del profilo di intensità individuale DNA a forma di cometa quindi fornire misure di parametri quali la lunghezza della coda, coda momento, e il% di DNA nella coda di rivelare il livello di danno del DNA all&#39;interno di una cellula 1-4. Attualmente ci sono due versioni comunemente usato per il test della cometa: a) test della cometa alcalina e b) Comet assay neutrale. Il test della cometa alcalina è il più ampiamenteversione usata, che utilizza un buffer pH elevato per rilassarsi prima di elettroforesi del DNA e, quindi, rileva tutti i tipi di rotture dei filamenti e dei siti sensibili agli alcali. Il saggio cometa neutro, invece, è meno praticata perché utilizza un tampone neutro per mantenere le doppie eliche e rilevare solo rotture del doppio filamento 2,5. Per gli agenti chimici e fisici che inducono DSB, SSB vengono creati in concerto, e si formano a livelli molto più elevati (ad esempio, SSB γIR-indotte sono un ordine di grandezza più comune di quanto DSB). Per la maggior parte del DNA esposizioni dannose, DSB sono molto meno frequenti rispetto ad altre classi di danno al DNA, e sono quindi più difficili da rilevare. Abbiamo dimostrato in precedenti pubblicazioni finestra di rilevazione di entrambe le versioni. 6,7 Anche se il test della cometa è stata solitamente usata per la ricerca di base sui danni e riparazione del DNA e test di genotossicità 1,2,8-15, il dosaggio è stato riferito di avere scarsa riproducibilità a causa di campione-to-campione, da persona a persona e la variabilità lab-a-lab. Inoltre, il dosaggio è basso erogato, in parte perché l&#39;acquisizione delle immagini e l&#39;analisi dei dati sono laborioso. Insieme, queste limitazioni contribuiscono alla sua relativamente bassa accettazione in studi su larga scala. Attraverso l&#39;integrazione di tecnologie e principi di ingegneria, la CometChip porta una soluzione ai problemi di throughput e incoerenze che sono associati con il tradizionale test della cometa 6,7. Brevemente, per creare il chip, uno stampo viene microfabbricati usando fotolitografia per creare microposts di diametro piccolo come quello di una singola cella. Lo stampo viene poi utilizzato per timbrare su agarosio fuso, causando una serie di pozzetti dopo il gel si solidifica. Chips sono state sviluppate per fornire ai ricercatori pozzi di dimensioni variabili a compatibile con diversi tipi di cellule. Per caricare il chip, le cellule in media sono autorizzati a stabilirsi nei pozzetti per gravità; cellule in eccesso vengono lavati via. Cellule intrappolati vengono poi ci incapsulatizione un sottile strato di agarosio a basso punto di fusione, e un fondo 96 pozzetti viene poi bloccato alla superficie del gel per creare 96 macrowells, ciascuna con centinaia di micropozzetti sulla sua superficie inferiore. Questo protocollo descrive le procedure generali per esperimenti con questo chip, che comprendono la preparazione del gel, carico delle cellule, il dosaggio e la riparazione, la lisi cellulare, elettroforesi, e l&#39;imaging fluorescente. Dimostriamo due esempi di esperimenti dose-risposta con le cellule linfoblasti esposte DNA conosciuto agenti dannosi, utilizzando alcalini e neutri versioni del test, rispettivamente. Due esperimenti di riparazione sono indicate anche per descrivere come risposta di riparazione post-esposizione può essere valutata utilizzando il sistema.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

In questo primo esempio, si descrive il metodo per quantificare i livelli iniziali di danno al DNA nelle cellule linfoblastoidi umane dopo l&#39;esposizione al danno ossidativo con H 2 O 2. Al fine di valutare H 2 O 2 -indotta lesioni di base e pause singolo filamento, vengono utilizzate condizioni cometa alcaline. Dopo il caricamento è completo e le cellule sono state incapsulato con la sovrapposizione di agarosio, una piastra a 96 pozzetti fondo viene premuto sulla superficie per creare 96 a scompartimento sul chip. Ciascuno dei 96-pozzetti può essere dosato con un tipo o concentrazione di sostanze chimiche diverse. Qui quattro diverse dosi di H 2 O 2 sono stati usati e 1x PBS è stato utilizzato come controllo negativo. Immagini rappresentative della comete schierati sono mostrati in figura 1A, dove non trattato (in alto), 50 mM (al centro) e 100 mM (in basso) H 2 O 2 -exposed campioni hanno dimostrato diversi livelli di code delle comete. Analisi di immagini della cometa può essere performed utilizzando un software disponibile in commercio, che quantifica generalmente livelli di danno basato sull&#39;intensità di fluorescenza e la migrazione distanza totale di ciascuna coda di cometa. Le misurazioni sono comunemente eseguite su 50 a 100 comete ogni condizione e il valore mediano (sia% DNA coda o lunghezza della coda) è calcolato. Figura 1B mostra la curva di risposta del DNA percentuale coda analizzato dai TK6 comete linfoblastoidi esposte a quattro diverse concentrazioni di H 2 O 2. La coerenza tra esperimenti indipendenti dimostra l&#39;efficacia di questo approccio nella valutazione DNA risposta al danno da vari livelli di trattamenti chimici nelle cellule. Per conoscere le differenze tra i campioni (ad esempio, tra macrowells) e tra ripetizioni dello stesso esperimento, inter-campione e la variabilità inter-sperimentale è stato riportati nella Figura 2A e 2B, rispettivamente. All&#39;interno di ogni esperimento, ogni pozzetto del 96-wChip ell è equivalente a un campione differente e quindi la variazione benestante ben rivela la variabilità inter-campione del dispositivo. Qui, le cellule TK6 caricati in 12 pozzetti del chip a 96 pozzetti sono stati trattati con la stessa dose di H 2 O 2 e lisate subito dopo il trattamento. Tutte le altre fasi sperimentali sono state eseguite in parallelo e le mediane di almeno 50 comete da ogni macrowell sono stati riportati nella Figura 2A. La media delle mediane è 77,53% DNA nella coda, con deviazione standard è 3,99%. Da questi dati, si calcola che il coefficiente di variazione tra campioni è 5,2%, che è diverse volte inferiore al test tradizionale, dimostrando il miglioramento della robustezza di questo test 6,16. Per conoscere la riproducibilità del test, abbiamo esposto le cellule TK6 in un chip con 75 mM H 2 O 2 e analizzare il livello immediato di danni al DNA. Questo esperimento è stato ripetuto sei volte e dati di ogni esperimento sono stati tracciati in FIGURA 2B. In condizioni sperimentali identiche, abbiamo ottenuto risultati che vanno dal 41.76% al 57.87%, indicata come barre grigie in figura. La media di sei ripetizioni è 49.57%, con l&#39;errore standard della media di appena 2,04%. La bassa variazione tra ripetizioni implica che il test della cometa eseguita su questo nuovo dispositivo è altamente riproducibile. Per valutare la cinetica di riparazione, le cellule sono autorizzati a riparare il loro DNA nei media fresco dopo il trattamento. Lisi macrowells in vari momenti rivela il cambiamento di danno al DNA nel corso del tempo. Un esempio è mostrato in Figura 3. In questo esperimento, le cellule TK6 stati incapsulati nel chip, trattate con 50 mM H 2 O 2, e permesso di riparare fino a 60 min post-esposizione. Le cellule sono state lisate a 0, 20, 45 e 60 minuti rispettivamente. Immagini cometa Rappresentante in diversi momenti sono mostrati in figura 3A, e la variazione dei livelli di danno al DNA nel tempo sono riportati nella Figura3B. Questi dati hanno rivelato che quasi tutto il danno viene riparato entro 45 min dopo H 2 O 2 terapia. Molte variabili possono influenzare il tasso di riparazione, compreso il tipo di linea cellulare e agente chimico utilizzato. Quindi i ricercatori possono apportare modifiche al protocollo (ad esempio, estendendo il tempo di riparazione) per soddisfare le esigenze supplementari nel loro indagini. Qui forniamo un altro esempio di esperimento di riparazione utilizzare questo chip, in cui le cellule TK6 sono sfidati con un diverso agente genotossico N -Methyl- N &#39;-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) è un agente alchilante noti per indurre lesioni di base, tra cui 7-metilguanina e 3-metiladenina. Queste lesioni vengono convertiti in abasic siti o di depurination spontanea o di rimozione enzimatica da glicosilasi DNA. Il sito abasic risultante può essere scisso in condizioni alcaline e quindi rilevato sul chip. Esposizione iniziale provoca un aumento significativo danno, evidente dal lungocode, e col tempo queste code sono ridotte come le cellule ripristino DNA intatto durante la riparazione. Sebbene alchilazione e danno ossidativo sono entrambi riparati principalmente dalla riparazione percorso escissione di base, la quantità di lesioni generate e le proteine ​​coinvolte nella riparazione variano. Queste variazioni possono portare a diversi tassi di conversione abasic siti, così come diversi tassi di riparazione dei siti abasic risultanti. Nella Figura 4, riparazione cinetica di cellule TK6 esposte a 0,1, 1 e 3 mg / ml di MNNG sono mostrate. In questo esperimento, abbiamo esteso il tempo di esperimento per 2 ore post-esposizione in quanto il danno MNNG indotto sembra persistere più a lungo e viene eliminato a un ritmo più lento rispetto a H 2 O 2 indotta danni. Analisi delle DSB utilizzando condizioni neutre è molto simile al protocollo per l&#39;analisi delle lesioni single-strand utilizzando le condizioni alcaline. Per visualizzare i livelli di danno iniziale, le cellule TK6 sono stati esposti a livelli variabili di GIR,<html> e le cellule risultanti sono state lisate ed elettroforesi a pH neutro (Figura 5A). È interessante notare che la morfologia delle code di cometa è differente dalle condizioni di saggio alcaline. Per raggiungere osservabile DNA frammentato da questo test, la dose IR utilizzato è significativamente più alta (0-100 Gy) rispetto alla dose necessaria per vedere i danni utilizzando le condizioni alcaline. Inoltre, abbiamo trovato che la lunghezza della coda è il parametro più sensibile nel riflettere l&#39;entità del danno al DNA quando si utilizza il test della cometa neutro 7. La curva di risposta alla dose analizzato è illustrato nella Figura 5B. Riparazione del DNA rotture del doppio filamento nelle cellule può anche essere valutato, ed è stato dimostrato da Weingeist et. al. 7. Nel loro insieme, il CometChip neutro offre un valido strumento per l&#39;analisi ad alto rendimento di DSB DNA. 1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 1. H 2 O 2 dosi risposta delle cellule TK6 utilizzando alcaline test della cometa. (A) le comete di pozzetti duplicati aggiornati da linfoblasti non trattati TK6 (in alto) e le cellule TK6 esposte a 50 micron (al centro) e 100 mM (in basso) H 2 O 2 per 20 minuti a 4 ° C. Barra della scala è di 100 micron. (B) H 2 O 2 dose-risposta delle cellule TK6 esposte a vari livelli di H 2 O 2. Ciascun punto di dati rappresenta la media di tre esperimenti indipendenti, in cui è stata ottenuta la mediana DNA percentuale coda di almeno 50 singoli comete in ogni esperimento. Le barre di errore rappresentano l&#39;errore standard della media di tre esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Inter-Sample e Inter-Sperimentale Variabilità. (A) variazione del campione a campione. Linfoblasti cellule umane TK6 stati caricati in 12 pozzetti del chip a 96 pozzetti. Ogni pozzetto è stato esposto a 100 pl di 50 mM H 2 O 2 per 20 minuti a 4 ° C. Cellulare sono stati immediatamente lisate e analizzati per% Tail DNA. I dati di ciascun pozzetto vengono qui mostrati. Ogni scatola rappresenta la mediana di almeno 50 comete individuali di ogni bene. La media di 12 pozzi è 77,53%, deviazione standard è 3,99%, e il coefficiente di variazione è calcolata per essere 5,2%. (B) Esperimento-to-Experiment variazione. Linfoblasti cellule umane TK6 stati caricati nel chip 96 pozzetti, esposto a 100 pl di 75 mM H 2 O 2 per 20 min a 4 ° C. Cellulare sono stati immediatamente lisate e analizzati per% Tail DNA.Lo stesso esperimento è stato ripetuto 6 volte e dati di ogni ripetizione viene visualizzato come una barra grigia. Ogni scatola rappresenta la mediana DNA% coda di almeno 100 comete individuali da ogni ripetizione. La media di 6 ripetizioni è 49.57%, indicato come la barra di nuovo qui. La deviazione standard di 6 ripetizioni è 4,99%, e l&#39;errore standard della media è calcolata per essere 2,04%, rappresentato come la barra di errore in figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> Riparazione di H 2 O 2 indotta da danni Figura 3. Nei linfoblasti TK6. (A) Schema di studio di riparazione con comete rappresentativi. Cellule TK6 sono trattati con agenti dannosi e permesso di riparare in media al 37 ° C prima di lisi. (B) Riparazione cinetica di cellule TK6 dopo il trattamento con 50 mM H 2 O 2 per 20 min a 4 e #176, C. Ciascun punto di dati rappresenta la media di tre esperimenti indipendenti, in cui è stata ottenuta la mediana DNA percentuale coda di almeno 50 singoli comete in ogni esperimento. Le barre di errore rappresentano l&#39;errore standard della media da esperimenti ripetuti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Riparazione di danni MNNG indotta in linfoblasti TK6. TK6 cellule sono trattate con 0,1, 1 e 3 mg / MNNG ml per 30 minuti a 4 ° C e lasciata a riparare in mezzi a 37 ° C fino a 120 min postale esposizione. La mediana DNA percentuale coda di almeno 50 singoli comete stata ottenuta per ciascuno dei tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano l&#39;errore standarddella media di tre esperimenti indipendenti. <img alt="Figura 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> Figura 5. Dose-risposta IR delle cellule TK6 utilizzando comet assay neutrale. (A) disposte micropozzetti comete da linfoblasti non trattati TK6 (in alto) e le cellule TK6 esposte a 40 Gy (al centro) e 80 Gy (in basso) raggi gamma. Barra della scala è di 100 micron. Dose-risposta (B) IR delle cellule TK6 esposte a vari livelli di raggi gamma. Ogni punto di dati rappresenta la lunghezza della coda mediana (micron) di almeno 300 comete raccolti da sei macrowells sul chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l&#39;elaborazione parallela di 96 campioni. L&#39;approccio facilita l&#39;analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K Views.  Massachusetts Institute of Technology.  Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica. 

Video: CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

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Bioingegneria

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Piattaforma microfluidica per la misurazione dei neutrofili Chemiotassi dal Lordo Sangue intero

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Phenotipizzazione del ceppo di lievito ad alta velocità effettiva con sequenziamento dell'RNA basato su droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...