Mi chiamo Dr.Shankari Nair e sono un Postdoctoral Fellow presso la Radiation Biophysics Division nel Dipartimento di Medicina Nucleare della NRF, iThemba LABS. In questo video, dimostreremo l'uso di un test automatizzato gamma H2AX sui linfociti del sangue periferico umano per il suo utilizzo in applicazioni di simmetria batch. I rischi di radiazioni per il personale sono rigorosamente controllati.
Le radiazioni ionizzanti influenzano direttamente la struttura del DNA inducendo rotture del DNA. In particolare le rotture a doppio filamento. Uno dei primi passi nel processo di riconoscimento della rottura del doppio filamento del DNA è la fosfotoriilizzazione della variante istonica, H2AX, e il reclutamento di proteine di riparazione.
Questo video illustrerà l'uso della microscopia per segnare il numero di focolai Gamma-H2AX ren-nucleus utilizzando un sistema di scansione a vetri automatizzato e una piattaforma di analisi, integrando il microscopio fluorescente. I linfociti sono isolati dal sangue intero. Diluire il sangue intero con PBS in un rapporto uno a uno, quindi posare delicatamente il sangue diluito su un volume di mezzo gradiente di densità.
Stratifica gradualmente il sangue tenendo il tubo inclinato di 45 gradi. Trasferire la sospensione in una centrifuga e ruotare a temperatura ambiente per 20 minuti a 900 G.Dopo la centrificazione si formeranno quattro strati. Trasferire con attenzione lo strato torbido contenente i linfociti in un nuovo tubo conico sterile.
Lavare i linfociti con PBS e contare usando un emocitometro. Una volta determinato il numero totale di linfociti, diluire il linfocita e la sospensione ad una concentrazione di circa 800.000 linfociti in un millilitro di RPMI completo. I campioni e sono pronti per le nostre radiazioni.
I linfociti vengono irradiati con raggi gamma da una sorgente di cobalto 60 e successivamente incubati per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica umidificato al 5%. Per ogni condizione di irradiazione o tubo, vengono preparati tre vetrini. Posizionare la diapositiva nel supporto della clip, seguita dalla scheda filtro e infine dall'imbuto.
Fissare le clip di scorrimento e inserirle nella citocentrghiera. Aggiungere 250 microlitri della sospensione cellulare su ciascun imbuto e ruotare per 30 G per cinque minuti. L'utilizzo della citocentrghifuga è fondamentale per ottenere condizioni standardizzate sull'automazione dei vetrini.
Una volta filato, rimuovere le diapositive dalla clip e quindi utilizzando la penna idrofoba, disegnare un cerchio attorno al punto in cui si trovano le celle. Ora che i vetrini sono stati realizzati, le cellule devono essere fissate al vetrino in modo che possa verificarsi la colorazione immunofluorescente. Le cellule vengono fissate utilizzando una paraformaldeide al 3%, o PFA, e una soluzione PBS per 20 minuti.
Dopo la fissazione lavare le diapositive in un barattolo Coplin con PBS per cinque minuti. Quindi, coprire le cellule con Triton X per consentire la permeabilizzazione. La fase di permeabilizzazione rimuove più lipidi di membrana cellulare per consentire agli anticorpi di entrare nel nucleo cellulare.
Da qui in poi, utilizziamo una soluzione di bloccaggio in 1%BSA in PBS, per lavare i vetrini al fine di ridurre il potenziale legame non specifico. Dopo tre fasi di lavaggio di 10 minuti con 1% BSA e PBS, i vetrini vengono incubati a temperatura ambiente con uno a 500 anticorpi primari anti-gamma H2AX per un'ora nella camera di umidificazione, facilmente realizzabile aggiungendo carta velina bagnata alla base della scatola rettangolare di stoccaggio del vetrino. Dopo l'incubazione con un anticorpo primario, togliere il liquido e lavare nuovamente i vetrini in una soluzione BSA all'1%.
Incubare i vetrini con un anticorpo TRITC anti-topo secondario da uno a mille asini secondari diluiti per un'ora nella camera di umidificazione. Rimuovere l'anticorpo prima di eseguire tre lavaggi di 10 minuti in PBS. Coprire il barattolo Coplin in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce per tutta la durata delle fasi di lavaggio.
Rimuovere i vetrini e pulire il PBS in eccesso al di fuori del cerchio idrofobo con carta velina priva di polvere. Infine, aggiungere una o due gocce di DAPI ha portato ad acquiesce mezzo di montaggio e coprire delicatamente le diapositive con lo slittamento del coperchio. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate e quindi conservare i campioni in un luogo buio a quattro gradi centigradi durante la notte.
Pulire delicatamente i vetrini con un etanolo al 70% e posizionare i vetrini sulla piattaforma di scansione automatizzata, o stadio del vetrino, collegato al microscopio ZED-2 delle immagini assiali zite. Selezionare la configurazione del classificazione nella scheda MetaCyte per modificare il classificatore. Il classificatore selezionato verrà utilizzato dal sistema per scansionare e valutare le diapositive e si basa su una serie di parametri predefiniti, che determineranno il modo in cui il sistema seleziona le celle e classifica i focolai.
Il classificatore può essere ottimizzato e addestrato in base a una serie di campi immagine preclassificati. A seconda dell'ingrandimento del microscopio, del tipo e degli anticorpi utilizzati per la colorazione, è possibile ottimizzare un classificatore diverso. Pertanto, i classificatori variano generalmente da laboratorio a laboratorio, ma forniremo una panoramica dei passaggi più basilari da prendere in considerazione quando è necessario regolare una configurazione del classificatore.
Sotto la scheda Capture', si può trovare il filtro che verrà utilizzato, qui DAPI e TRITC, con un tempo massimo di integrazione di 1,04 secondi. Quest'ultimo si basa sul classificatore originale fornito dalla società e successivamente regolato per l'intensità dell'anticorpo e il segnale gamma H2AX di fondo, o TRITC, in questo specifico tipo di cellula, vale a dire i linfociti. Nella scheda Esposizione è definito il tempo minimo di integrazione.
Il classificatore rimarrà sempre entro il tempo minimo e massimo di integrazione, il che impedisce la sovra o la sottoesposizione della diapositiva. Nella scheda Selezione cella sono state definite le aree minime e massime dell'oggetto in base alle dimensioni e alla forma delle celle analizzate. Ad esempio, il valore di concavità predeterminato e le proporzioni sono specifici per i linfociti, che generalmente hanno forme rotonde.
Nella scheda Caratteristiche, è possibile modificare la vista della galleria e dell'istogramma, nonché determinare ciò che il microscopio deve segnare. Il sistema può assegnare un punteggio a numerosi elementi, a seconda delle funzionalità selezionate dall'utente. Un esempio è la soglia di come il software assegna un punteggio ai singoli oggetti.
Una volta identificato un classificatore adatto, selezionare la configurazione nella barra laterale e assegnare a ciascuna diapositiva un nome univoco, seguito dalla selezione del classificatore appropriato. Selezionare Numero massimo di celle e aggiungere il numero massimo di celle necessarie per la scansione. La ricerca viene terminata anche se la finestra di ricerca selezionata non è stata ancora scansionata completamente, non appena viene raggiunto il numero massimo di celle.
Per le applicazioni di bio-dissimmetria, è sufficiente il punteggio automatico di 1000 cellule per vetrino, considerando che vengono preparati tre vetrini per campione di sangue. Fare clic su OK per confermare le impostazioni. Per eseguire la scansione delle diapositive, seleziona Cerca nella barra laterale.
Se l'impostazione Finestra di ricerca manuale è stata selezionata nella configurazione della diapositiva, una finestra di dialogo aprirà una riga per la determinazione dell'area di scansione. Utilizzando l'obiettivo 10 volte, l'area di ricerca rettangolare sulla diapositiva viene selezionata in modo interattivo fissando due angoli del campo di ricerca con il clic sinistro del mouse. Questo può essere confermato con il pulsante OK'.
Regolare una posizione iniziale di messa a fuoco. Il software richiederà una messa a fuoco e al centro di un nucleo di riferimento utilizzando l'obiettivo 40 volte per ogni diapositiva e confermerà le impostazioni con OK. Il sistema si sposterà automaticamente su tutti i lati in sequenza. Se necessario, regolare Live Image Setup'and Integration Time' per questo passaggio.
Controllare tutte le impostazioni del microscopio. Assicurarsi che la leva del tubo del microscopio sia in una posizione che devii tutta la luce verso la fotocamera e confermare la richiesta del sistema con OK. Il sistema avvia la messa a fuoco automatica della griglia nella posizione della griglia più vicina al campo di riferimento. Continua a focalizzare il campo sulla griglia regolare, muovendosi in un meandro verso la parte anteriore e posteriore della finestra di ricerca.
La scansione inizia al termine della messa a fuoco automatica della griglia. Lo stage viene spostato in un campo di pattern a meandro dopo campo per acquisire i dati. Quando viene rilevata una cella, viene posizionata e l'immagine della galleria viene memorizzata e visualizzata sullo schermo e il conteggio delle celle viene aggiornato.
La ricerca viene terminata se l'intera ricerca è stata analizzata, se è stato raggiunto il numero massimo di celle o se la ricerca è stata annullata. Al termine della scansione, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla barra in basso e aprire un campione. Esamina la galleria, che consiste in piccole immagini di cellule rilevate.
In questa finestra è possibile specificare le celle memorizzate nella galleria tramite criterio da scegliere dal menu a tendina. Le celle vengono generalmente visualizzate nell'ordine in cui sono state rilevate. Fare clic su Quality Histogram'or Feature Value Diagram' per fornire la distribuzione delle celle rilevate, nonché i mezzi e la deviazione standard dei fuochi valutati.
Qui confrontiamo il grigio zero rispetto a 1,5 campioni grigi. Questo è in genere un vetrino di controllo, con un valore medio di 0,124 fuochi per cella, in cui la cellula non è stata irradiata. In un contesto di bio-dissimmetria, ciò indicherebbe che una persona non è stata esposta a una radiazione ad alte dosi.
Nel grafico, possiamo vedere che la maggior parte delle cellule ha quasi zero fuochi per cella e non c'è un lato della distribuzione normale. Quando confrontiamo questo con una dose di 1,5 grigio, si può chiaramente vedere che si tratta di un campione irradiato. In un contesto di bio-dissimmetria, questa distribuzione normale è un chiaro segno che il campione è stato esposto alle radiazioni.
La scansione automatizzata è abbastanza sensibile da rilevare i fuochi indotti a basse dosi. I risultati mostrano un chiaro aumento lineare del numero di focolai per cellula con dose. Il metodo automatizzato di rilevamento della rottura del doppio filamento di DNA è utile per applicazioni di dissimmetria biologica a throughput rapido e ad alto rendimento.
Grazie per aver guardato.
