Gli autori sono riconoscenti ai loro colleghi e il personale dei laboratori presenti e passati che hanno sostenuto lo sviluppo di questa tecnica. Il laboratorio di SP è sostenuta dal Canadian Institute for Health Research Grant operativo MOP-84473 e Alberta innova-Health Solutions (finanziati dalla Fondazione Alberta Heritage per la ricerca medica Endowment Fund). PS è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede MD001091-01 e GM068855-02.

1. Preparazione di colture batteriche, strumenti e reagenti (DAY 1, Pomeriggio) <ol><li> Nel tardo pomeriggio, inoculare 1-5 ml di brodo LB in autoclave sterile (ad esempio, 100 x 13 mm) provette di vetro borosilicato con una piccola aliquota di batteri (E. coli o V. cholerae). </li><li> Impostare le provette inoculate in un tamburo rullo alloggiata a 37 ° C di temperatura (ambiente caldo o incubatore), accendere il tamburo rullo ad alta velocità, e incubare O / N. </li><li> Preparare un divaricatore cella nella forma di un &quot;bastone da hockey&quot; di una bacchetta di vetro riscaldando il centro della sbarra nella fiamma di un becco Bunsen fino ammorbidisce il vetro e quindi indirizzare la curva delicatamente con pinzette o pinze in un angolo di 135 ° . Riscaldare l&#39;asta di nuovo nel punto medio tra la fine e la prima curva e piegare a 45 ° verso l&#39;interno (in senso opposto della prima curva). </li><li> Preparare LB-agar senza antibiotici e versare in piastre di Petri in preparazione dellaprotocollo electrocompetence, e LB-agar piastre contenenti l&#39;antibiotico appropriato (secondo il marcatore di resistenza sul vettore da elettroporate), e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare un filtro sterilizzato 2 mM CaCl 2 soluzione per V. cholerae, o autoclave DDH 2 O per E. coli, e conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. Crescita di batteri elettrocompetenti (DAY 2, Mattino) <ol><li> Fornire 100 ml di coltura batterica O / N su ogni piatto agar LB, scorte glicerolo congelati possono anche essere utilizzati e direttamente consegnati sul piatto. </li><li> Immergere l&#39;hockey a forma di bastone spreader cella in 100% EtOH, brevemente drenare e bruciare il restante EtOH per sterilizzarlo prima dell&#39;uso e diffusione. Diffondere la coltura batterica 100 microlitri O / N uniformemente con la sterile spreader cella di vetro facendo attenzione a non disturbare (break) la superficie agar. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 4-6 ore, o fino ad un sottile prato di crescita batterica siaviene distinguibili. Le cellule sono più competenti quando si attiva crescita. </li></ol> 3. Preparazione di cellule batteriche elettrocompetenti (DAY 2, Pomeriggio) <ol><li> Raccogliere i batteri con un&#39;ansa da inoculo sterile facendo attenzione a non forare o rompere la superficie dell&#39;agar. Una massa batterica 2 mm di diametro è sufficiente per una trasformazione. Tipicamente, ciò richiede raschiare la superficie del sottile prato con l&#39;ansa due o tre volte. Diversi campioni (in genere tra 4-6) possono essere raccolti dallo stesso piatto. </li><li> Risospendere la massa batterica in 1 ml di ghiacciata 2 mM CaCl 2 (per V. cholerae) o sterili DDH 2 O (per E. coli) e mescolare bene fino a quando non sono visibili grumi, tenere su ghiaccio. </li><li> Centrifugare ogni sospensione batterica per 5 minuti a 5000 xg in una microcentrifuga refrigerata impostato a 4 ° C, o in una microcentrifuga memorizzato in una camera fredda impostato su 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante, resuspterminare il pellet batterico nello stesso volume di 2 mM CaCl ghiacciata 2 o sterile DDH 2 O, e ripetere la fase di centrifugazione come fatto in precedenza altre due volte per un totale di tre lavaggi. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere, e quindi allentare completamente il pellet batterico in 40 microlitri freddo ghiaccio 2 mM CaCl 2 o sterili DDH 2 O e tenere in ghiaccio. </li></ol> 4. Trasformazione di batteri elettrocompetenti (DAY 2, Pomeriggio) <ol><li> Aggiungere fino a 1 mg di DNA plasmidico (fino a 1 microlitri di acqua o tampone Tris-EDTA) alla sospensione batterica 40 microlitri e trasferire il composto in un pre-raffreddata, sterile 0,2 centimetri gap cuvetta. La concentrazione di sale nel campione di DNA deve essere bassa a, poiché contribuirà a scariche di impulsi nel passaggio successivo. </li><li> Inserire la cuvetta nella camera di elettroporazione del modulo di controllo degli impulsi, e l&#39;elettroporazione a 1,8 kV, 25 uF. La costante di tempo deve essere ~ 5,0 msec, e nessun arco dovrebbe verificarsi. </li><li> Recuperare rapidamente la sospensione cellulare risospendendo in 1 ml di brodo LB e trasferire in precedenza autoclavato provetta di vetro borosilicato. </li><li> Permettono alle cellule di recuperare incubando condizioni colturali gassose (in un tamburo rullo) a 37 ° C per 30 min senza selezione antibiotica. </li><li> Piastra batteri sulle piastre di LB agar precedentemente preparati in presenza di agente selettivo appropriato (antibiotico), e incubare a 37 ° CO / N. Se i batteri vengono trasformati con un&#39;alta concentrazione di vettore purificato (0,1-1 mg plasmide superavvolto), consegnare 10 ml di coltura batterica sul bordo della piastra di LB agar e realizzato con un&#39;ansa sterile per colonie isolate utilizzando il metodo realizzato quadrante. Se una miscela di ligazione è stata trasformata, consegnare 100 ml di coltura batterica su ogni piastra di agar e in modo uniforme stenderlo con la spatola cella di vetro sterilizzati. </li></ol> a Se la costante di tempo è breve (saràbasso 3.5 msec), o pulsazione porta a arco, poi ri-precipitare il campione di DNA, lavare con il 70% EtOH due volte per rimuovere i sali prima dell&#39;essiccazione e risospendere in tampone TE.

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. 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Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. 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Nessuna informativa sono applicabili.

Efficienza di trasformazione è soggetta ad una varietà di fattori indipendentemente dal metodo impiegato per preparare cellule competenti. Variabili analoghe valgono per questo metodo; grande cura deve essere presa che una volta che le cellule vengono raccolte dalla piastra di agar tale che essi siano mantenuti a temperatura costante fredda (non superiore a 4 ° C). Il prato batterica deve essere in fase di crescita al momento della raccolta, le cellule devono essere in fase mid-logaritmica di crescita. Qualità di DNA (cioè sporcizia di sali) influenza l&#39;efficienza della trasformazione. In particolare, quando si impiega questo metodo, l&#39;agar non deve essere rotto come frammenti di agar nella cuvetta causeranno arco dell&#39;impulso. La maggior parte dei problemi incontrati con questa tecnica sono associate a due questioni, raccogliere i batteri durante la corretta finestra di tempo dalla piastra di agar quando sono in attiva crescita. Raccolta troppo presto darà il numero di cellule insufficiente e renderà l&#39;raschiando la piastra di agar LB frustrante, perché il &quot;pellicule&quot; essi costituiscono è difficile da sollevare la superficie della piastra. Batteri Raccolta troppo tardi diminuiranno la loro competenza in modo drammatico. La finestra di tempo sarà naturalmente variare a seconda della densità dell&#39;inoculo piastrate su piastre di LB agar. Il secondo passo fondamentale è quello di mantenere i batteri freddo (4 ° C) dal momento in cui sono sollevati da piastra di agar e risospese in CaCl 2 o DDH 2 O fino a quando sono piastrate su agar LB seguente trasformazione. I tubi microcentrifuga contenenti i batteri, cuvette e tampone devono essere pre-raffreddato e conservato in ghiaccio a tutte le ore fino a quando i batteri sono placcati. Tuttavia, ulteriori problemi possono sorgere quando la sterile DDH 2 O o CaCl 2 contengono precipitato o sono contaminati. Per questo motivo si consiglia di preparare questa nuova reagente. Trasformazione risoluzione dei problemi è facilitato dalla compresi i controlli durante la trasformazione bacteria reso competente con qualsiasi metodo. Un controllo negativo costituito da un gruppo di batteri competenti non trasformate placcato su una piastra di agar LB contenente il marcatore selettivo sarà rapidamente aiutare a determinare se l&#39;antibiotico sulla piastra è efficace. Una trasformazione controllo positivo con una preparazione plasmide noto di buona qualità e quantità ospitare lo stesso marcatore selettivo come il campione sperimentale sarà utile per determinare se i batteri sono competenti, ma anche se il DNA sperimentale trasformata era sufficiente in quantità o qualità. I vantaggi di questa tecnica sono molteplici, il metodo può essere effettuato nello stesso giorno che una trasformazione è prevista. Abbiamo scoperto che il glicerolo batteriche congelati magazzino può essere placcato direttamente sul agar LB senza alcuna perdita di electrocompetence, abbiamo fatto in situazioni di &quot;emergenza&quot; (dopo dimenticando per avviare la cultura durante la notte il giorno prima). Anche se non abbiamo potuto testare emolto ceppo noto, qualsiasi E. coli o V. ceppo cholerae che può essere trasformato da elettroporazione è suscettibile di questo protocollo nelle nostre mani. La tecnica è rapida, efficace e produce efficienze di trasformazione paragonabili a quelli ottenuti da preparare batteri elettrocompetenti impiegano metodi tradizionali. Il metodo elimina la necessità di centrifuga ad alta velocità e rotori associati, un agitatore incubatore orbitale e secchi centrifuga sterili (contenitori), e grandi volumi di tampone autoclave. Anche se la tabella di reagenti specifici e attrezzature è abbastanza completo, la maggior parte dei laboratori che effettuano elettroporazione avranno la maggior parte, se non tutti, di questi materiali già disponibili. Forse la cosa più importante, la tecnica può essere facilmente applicata per generare ceppi specifici del laboratorio elettrocompetenti con sfondi mutanti rapidamente. Siamo consapevoli dei limiti di questa tecnica in quanto ha sostituito il tradizionale metodo di preparazione di elettrocompetent batteri nei nostri laboratori. I risultati dei nostri esperimenti qui illustrati sono stati effettuati con cellule elettrocompetenti freschi prodotti con il metodo tradizionale che era stato conservato a -80 ° C per non più di 1 settimana. Tuttavia, scorte congelate cellulari elettrocompetenti perdono la competenza e la redditività o per lunghi periodi di stoccaggio prolungati. Il nostro protocollo abbreviata consente la preparazione di cellule elettrocompetenti freschi stesso giorno la trasformazione è prevista senza preoccupazioni età del magazzino che può provocare resa trasformante diminuito. Non abbiamo tentato di conservare le cellule elettrocompetenti prodotte utilizzando il metodo rapido per l&#39;utilizzo in un altro giorno come questo non è stato necessario. Sebbene non mostrato qui, l&#39;efficienza delle cellule elettrocompetenti preparato utilizzando il nostro metodo rapido è sufficiente per le miscele di ligazione. Le trasformazioni riportati per non-O1 V. cholerae in un recente articolo di Unterweger et al.17 sono state effettuate utilizzando batteri elettrocompetenti preparato con il procedimento descritto qui (tranne quelle effettuate mediante coniugazione). Questa tecnica permette ai ricercatori di trasformare ceppi mutanti con background rapido ed efficace, senza dover preparare grandi lotti di cellule. Questa rapida preparazione del metodo di batteri elettrocompetenti potrebbe essere adattato ad altri procarioti che hanno dimostrato di essere suscettibili di elettroporazione come il principio di preparazione e le impostazioni di elettroporazione stanno per essere le stesse di quelle dei protocolli tradizionali.

Fin dalla sua &#39;nascita nei primi anni del 1980 1, elettroporazione è diventata una tecnica di biologia molecolare integrale, probabilmente il singolo metodo più utilizzato per trasformare / trasfezione cellule vive con acidi nucleici circolari o lineari. Originariamente sviluppato per la trasfezione di cellule eucariotiche 1, elettroporazione è stato successivamente adattato per la trasformazione di E. coli 2, 3. In batteriologia, elettroporazione è diventato lo standard di laboratorio ed è stato modificato per trasformare una vasta gamma di batteri Gram-negativi, tra cui Pseudomonas 4, 5 salmonelle, vibrioni 6, Serratiae e Shigella 7; Clostridia Gram-positivi 8, Bacilli 9, lattobacilli 10 ed enterococchi 11. Anche alcuni Archaebacteria hanno dimostrato suscettibile di trasformazione mediante elettroporazione, tra cui Methanococci </em&gt; 12 e Sulfolobus specie 13. Per una rassegna completa si rimanda al Aune e Aachmann 14. L&#39;efficienza di trasformazione mediante elettroporazione è riferito 10-20 volte superiore a quello di competenza chimico o shock termico 2. Tuttavia, come per la preparazione di batteri per la competenza chimica ottimizzata da Douglas Hanahan nel 1980 15, le cellule devono anche essere pronti a essere elettrocompetenti. L&#39;elettroporazione è un mezzo rapido ed efficace di trasformazione batterica, che richiedono batteri elettrocompetenti, DNA purificato, un modulo di controllo degli impulsi che fornisce l&#39;impulso elettrico, e una camera che può ospitare piccole celle monouso che funzionano come un elettrodo. Brevemente, freddo, batteri competenti sono mescolati con DNA plasmidico, sottoposto ad un impulso ad alta tensione in una cuvetta, risospese in terreno di crescita, incubate a 30-37 ° C per 30-45 min, e quindi piastrate su terreno semisolido (agar nutriente piastre) con la caopriate antibiotico selettivo. In contrasto con il passo pulsare, la preparazione di elettrocompetenti E. coli rimane una procedura più parti che è tradizionalmente effettuata in grandi volumi. In breve, una cultura overnight di batteri viene inoculato in una beuta con 100 ml a 1 L Luria Broth (LB), cresciuto fino a metà fase logaritmica di crescita (OD 600 &lt;1.0), e sottoposti a lavaggi seriali con una non sterile ionico tampone o acqua bidistillata (DDH 2 O) discendente volumi a 4 ° C. Grande cura deve essere presa per mantenere le cellule freddo durante tutta la procedura ed evitare la contaminazione. Ciò richiede l&#39;impiego di secchi centrifugazione autoclave e tamponi non ionici o DDH 2 O, un agitatore incubatore orbitale, un grande volume ad alta velocità centrifuga refrigerata e un set di rotori. I batteri sono infine risospese in un piccolo volume di tampone supplementato con 10% glicerolo e frazionato in ~ 40 volumi microlitri, which vengono conservati a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. Stoccaggio a bassa temperatura spesso si traduce in efficienza di trasformazione è diminuito a causa della perdita di redditività nel tempo. Cellule batteriche elettrocompetenti sono disponibili da una varietà di fonti commerciali ma solo per un numero limitato di (spesso ricombinazione-deficient) E. coli comunemente impiegati come host di propagare una vasta gamma di plasmidi. Come risultato i ricercatori si basano su metodi di in-house per preparare i propri ceppi / mutanti per la trasformazione. Un alternate, protocollo rapido ed efficiente per la preparazione di elettrocompetenti E. coli è stato in uso da alcuni laboratori di microbiologia molecolare per qualche tempo ed è stato esteso a ulteriori batteri Gram-negativi, nel nostro caso V. cholerae. Il mittente del protocollo non può essere identificato come è stato ottimizzato da altri ricercatori nel tempo. Il metodo qui presentato è stato usato nella nostra laboratories per quasi due decenni, ed è il nostro obiettivo di condividere questo protocollo utile con i nostri coetanei.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Elettroporazione è diventato un metodo ampiamente utilizzato per rapidamente ed efficacemente introdurre DNA esogeno in una vasta gamma di celle. Electrotransformation è diventato il metodo di scelta per introdurre DNA in procarioti che non sono naturalmente competente. L&#39;elettroporazione è un metodo di trasformazione rapida, efficiente e semplificato che, oltre al DNA purificato e batteri competenti, richiede commercialmente disponibile regolatore di impulsi gene e cuvette. In contrasto con il passo pulsare, preparazione di cellule elettrocompetenti richiede molto tempo e manodopera coinvolgendo ripetuti cicli di centrifugazione e lavaggi in diminuzione volumi di acqua fredda e sterile, o buffer non-ionici di grandi volumi di colture cresciute a metà fase logaritmica di crescita. Il tempo e lo sforzo possono essere salvati con l&#39;acquisto di cellule elettrocompetenti da fonti commerciali, ma la scelta è limitata a comunemente impiegati E. ceppi di laboratorio coli. Stiamo presente diffusione di una rapida emetodo efficiente per la preparazione elettrocompetenti E. coli, che è stato in uso nei laboratori di microbiologia per qualche tempo, può essere adattato a V. cholerae e altri procarioti. Anche se non possiamo accertare chi al credito per lo sviluppo della tecnica originale, stiamo dichiara renderlo disponibile alla comunità scientifica.

Abbiamo effettuato una serie di trasformazioni con E. coli e V. cholerae per confrontare l&#39;efficienza della trasformazione della nostra metodologia rapida con un adattamento del metodo (tradizionale) originariamente descritto da Dower et al. 2 per la preparazione di batteri elettrocompetenti. Per effettuare la tradizionale preparazione di cellule competenti, 500 ml LB in un pallone da 2 L-Erlenmeyer state inoculate con 500 microlitri cultura durante la notte di E. coli DH5a o V. cholerae O395, incubata in un agitatore orbitale (215 rpm a 37 ° C) e raccolto a OD 600 compreso tra 0,5-1,0. Il pallone è stato raffreddato su ghiaccio e le culture centrifugato in un rotore pre-raffreddata a 4.000 xg per 10 min a 4 ° C. I pellet cellulari sono stati completamente risospese in 2 ml di CaCl mm 500 ghiacciata 2 per V. cholerae e DDH 2 O per E. coli, e centrifugato di nuovo nelle stesse condizioni. Turni successivi di risospensione und centrifugazione sono state effettuate discendente volumi di 200 e 100 ml di volume assicurandosi che la coltura è rimasta refrigerata a 4 ° C. Infine, una risospensione e centrifugazione in un volume di 10 ml è stata effettuata con il 10% glicerolo. Il pellet finale è stato risospeso in 2 ml di glicerolo al 10% e 40 microlitri aliquote sono state congelate a -80 ° C e non più conservato di una settimana prima di elettroporazione. Condizioni elettroporazione incluse le impostazioni di impulsi e dimensioni cuvetta erano identici per entrambe le specie batteriche in tutti electroporations indipendentemente dal metodo di preparazione di cellule competenti. L&#39;unica differenza è che abbiamo svolto i lavaggi in DDH 2 O fredda per E. coli e fredda 2 mM CaCl 2 per V. cholerae Tabella. 1 mostra i risultati di batteri trasformati mediante elettroporazione in modo identico, ma resi competente sia con il protocollo rapido o con il metodo tradizionale. Abbiamo impiegato ceppo O395 e DH5a come comuneutilizzati ly, ceppi rappresentativi di V. cholerae e E. coli rispettivamente; risultati simili possono essere ottenuti con altri ceppi della stessa specie (anche se non ogni singolo ceppo è stato testato) e probabilmente adattati ad altri batteri Gram-negativi e probabilmente oltre. Per assicurare che un numero uguale di cellule erano presenti in ogni partita pulsata, batteri elettrocompetenti generati utilizzando il metodo rapido sono stati raggruppati sulla raccolta, mescolati, tenuti omogeneo sospesi, e aliquotare 40 volumi microlitri poco prima elettroporazione. Batteri elettrocompetenti generati utilizzando il metodo tradizionale sono stati trattati in modo simile prima del congelamento in 40 microlitri aliquote. Dopo la consegna del polso, ogni lotto di 40 microlitri batteri elettroporate è stato sospeso in 400 microlitri LB e serialmente diluito 1:10. Cento microlitri di ogni diluizione sono state piastrate su LB agar in presenza di 100 pg / ml ampicillina e diffondono mediante spatola cella di vetro sterilee incubate a 37 ° C per una notte. Per quantificare il numero totale di batteri impiegati in ciascuno trasformazione, 40 volumi microlitri di batteri elettrocompetenti di ogni batch preparato sono stati diluiti, e piastrate su LB agar senza antibiotici identicamente in parallelo. Una aliquota di batteri ugualmente trattati da ogni lotto è stato elettroporate con 1 ml Tris-EDTA (TE) accumulo ma senza DNA (finto trasformazione), diluiti serialmente e piastrate su LB agar senza antibiotici per stimare il numero di cellule perse dalla consegna del impulso elettrico. Infine, una variazione addizionale esperimento è stato condotto per determinare se 30 min di incubazione a 37 ° C in 1 ml di LB dopo l&#39;elettroporazione ma prima placcatura su LB-agar inciderebbero il recupero delle cellule trasformate. unità formanti colonie (CFU) venivano registrati il ​​giorno seguente. Per questo esperimento abbiamo impiegato pUC18, un plasmide laboratorio comune, e lotti di batteri competenti costituito da unpproximately 10 8 CFU per le cellule preparate utilizzando il metodo tradizionale e 10 7 CFU per le cellule preparate utilizzando il protocollo rapido. Solo elettroporazione (senza DNA) ha ridotto CFU vitali da 10-100 volte indipendentemente dal metodo utilizzato per preparare le cellule elettrocompetenti. Come mostrato in Tabella 1, resa trasformante era entro le 10 6 -10 7 CFU / pg di DNA gamma in tre esperimenti replicati (deviazioni standard tra parentesi) per E. coli (DH5a) e V. cholerae (O395), rispettivamente con il metodo tradizionale, più lunghe per la preparazione delle cellule elettrocompetenti. Resa trasformante apparso diminuito di 10 volte a 10 5 -10 6 CFU / pg di DNA in tre esperimenti replicare (deviazione standard tra parentesi) per E. coli e V. cholerae rispettivamente con il metodo rapido. Per questo motivo abbiamo determinato la percentuale di batteri trasformati dividendo CFU trasformatiper il numero di CFU recuperato da &quot;trasformazioni finti&quot; (senza plasmide) da lotti altrimenti identici di cellule competenti. La percentuale di batteri trasformati era entro un log (2,5-9,4%) indipendentemente dal metodo di preparazione e specie trasformati (Tabella 1 numeri tra parentesi). Questi risultati suggeriscono che l&#39;efficacia del metodo rapido è paragonabile a quella della procedura tradizionale lungo di preparazione di cellule competenti e che i ceppi rappresentativi di Vibrio cholerae e Escherichia coli sono ugualmente suscettibili alla procedura rapida. Abbiamo trovato che l&#39;efficienza di trasformazione, per plasmidi come pUC18 ospitano cassette β-lattamasi, non è influenzato dal tempo di recupero 30 min in brodo LB. Lo stesso numero di trasformanti è stato recuperato se le cellule sono state piastrate a LB agar in presenza di ampicillina direttamente dopo l&#39;elettroporazione, o se ne ha permesso un tempo di recupero 30-45 minin brodo LB a 37 ° C prima della placcatura. I nostri risultati che ampicillina-resistenza non richiede conseguenza in condizioni non selettivi suggerisce che l&#39;espressione di β-lattamasi si verifica abbastanza veloce al momento di trasformazione. Tuttavia, va notato che abbiamo condotto diluizioni seriali dei batteri pulsati in brodo LB, che può aver contribuito al recupero dallo shock elettrico e avviare l&#39;espressione genica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione grafica della metodologia per la rapida preparazione di batteri elettrocompetenti. Dopo 4-6 ore (a seconda della densità del inoculi) un numero sufficiente di batteri possono essere raccolti per svolgere 05:56 trasformazioni da una singola piastra di agar LB. Per assicurare la parità di numero di cellule competenti per ciascun volume finale da elettroporate, batteri raccolti dalla piastra di agar LB sono stati inizialmente riuniti e lavati insieme poi aliquoted in 40 volumi microlitri seconda delle dimensioni del pellet (granuli più grandi sono stati diluiti in grandi volumi divisibili da 40 microlitri). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Numero di Ampicillina resistenti DNA trasformanti / mg (trasformanti Ampicillina resistenti recuperati [%]) </td></tr><tr><td> Strain </td><td> Metodo tradizionale </td><td> Metodo rapido </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Efficienza di trasformazione per ogni microgrammo di DNA (pUC18) di elettrocompetenti bacteria preparato con il metodo tradizionale rispetto al metodo rapido. Tutte le trasformazioni sono state effettuate con 500 ng di DNA pUC18 (~ 80% DNA supercoiled come visualizzato da 1% agarosio elettroforesi su gel) e le cellule elettroporate sono stati diluiti 10 volte in brodo LB prima placcatura per CFU su LB-agar con antibiotici. Controlli di batteri non elettroporate e di batteri elettroporate senza plasmide, diluiti serialmente e piastrate su LB agar senza antibiotici sono state effettuate per ogni serie di trasformazioni per determinare il numero totale di batteri vitali prima e dopo pulsare. I controlli elettroporate rappresentavano la linea di base per la percentuale di batteri vitali trasformati con successo.

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Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

L&#39;elettroporazione è un metodo comunemente impiegato per introdurre DNA in batteri in un processo noto come trasformazione. Protocolli tradizionali per la preparazione di cellule elettrocompetenti sono in termini di tempo e manodopera. Questo articolo descrive un modo alternativo, rapido ed efficiente metodo per la preparazione di cellule elettrocompetenti attualmente impiegati da alcuni laboratori.

Rapid Protocollo per la preparazione di elettrocompetenti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Research

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Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

76.2K Views.  University of Texas Brownsville.  L'elettroporazione è un metodo comunemente impiegato per introdurre DNA in batteri in un processo noto come trasformazione. Protocolli tradizionali per la preparazione di cellule elettrocompetenti sono in termini di tempo e manodopera. Questo articolo descrive un modo alternativo, rapido ed efficiente metodo per la preparazione di cellule elettrocompetenti attualmente impiegati da alcuni laboratori. 

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Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: organismo modello per studiare Patogenesi batterica - Intervista

Ricerca

Biologia

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test per misurare l&#39;attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolli per l&#39;implementazione di un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Purificazione non-cromatografico di polipeptidi di elastina ricombinante simili e le loro fusioni con Peptidi e Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

I benefici multiforme Protein Co-espressione in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...