Ringraziamo M. Channey, E. Chau, e K. Tomas per la loro assistenza nel progetto. forniture di progetto sono stati in parte finanziati dalla California Polytechnic State University.

1. Media e coltura di ceppi microbici NOTA: Utilizzare tecniche asettiche in tutti gli esperimenti. Utilizzare materiali sterili. Sterilizzare tutti i contenitori, strumenti e reagenti prima dell&#39;uso. Autoclavare tutti i materiali di scarto prima dello smaltimento perché sono considerati a rischio biologico. la temperatura e il tempo Autoclave combinazione è ≥121 ° C x ≥15 min per tutte le seguenti procedure. <ol><li> Per rendere ~ 1-L Tryptic Soy Agar (TSA), prima aggiungere 1 L di acqua deionizzata in una beuta 2-L contenente una ancoretta magnetica. Utilizzare un pallone che è almeno due volte più grande del volume finale. Aggiungere 30 g di polvere di triptico brodo di soia e 20 g di agar granuli nel matraccio. NOTA: Utilizzare 2% agar invece del 1,5% per limitare brulicare di qualche Vibrio spp. <ol><li> Mescolare accuratamente accendendo l&#39;agitatore. Mentre si agita, accendere il fuoco a bollire la miscela. Rimuovere la beuta dal riscaldatore non appena il composto inizia a bollire. Liberamente coprire °e pallone con una carta stagnola. Nastro il foglio per fissarlo al pallone prima autoclave. </li><li> Per fare il brodo di soia trittico (TSB), omettere l&#39;agar dalla ricetta al punto 1.1. NOTA: Può usare bottiglie invece di beuta. </li><li> Per rendere triptico agar di soia integrato con cloruro di sodio 2% o NaCl (TSAS), aggiungere 20 g di NaCl nella miscela prima agitazione e riscaldamento. Per fare il brodo di soia trittico addizionato con 2% NaCl (TSBS), omettere l&#39;agar, aggiungere 20 g di NaCl nella miscela prima agitazione e riscaldamento. </li></ol></li><li> Per rendere infuso cuore cervello (BHI) agar, sospendere 37 g di polvere di BHI e 15 g granulato di agar in 1 L di acqua purificata. Il calore sotto agitazione per sciogliere la polvere. Autoclave. Omettere l&#39;agar per fare BHI brodo. </li><li> Per rendere TCBS agar, sospendere 89 g della polvere TCBS in 1 L di acqua purificata. Di calore con agitazione e far bollire per 1 minuto per sciogliere completamente la polvere. Non sterilizzare in autoclave. </li><li> Per tutti i supporti di agar, raffreddare l&#39;agar caldo per 45-50 ° C in un bagno d&#39;acqua. Disporre le piastre di Petri vuote in pile di cinque o sei piatti. Partendo dal fondo della pila, versare l&#39;agar fuso in ciascuna piastra di Petri per raggiungere circa metà pieno. Chiudere il coperchio piatto Petri dopo avere versato. Lasciare che l&#39;agar solidificare lasciando le piastre siedono a temperatura ambiente. <ol><li> Utilizzare le piastre di agar il giorno dopo o dopo 12 ore. Conservare le piastre inutilizzati in frigorifero per un massimo di due settimane. Prima dell&#39;uso, rimuovere le piastre dal frigorifero e equilibrare a temperatura ambiente per almeno 15 min. NOTA: agar Un litri rende ~ 45 piastre di agar. Lasciare le piastre di agar per asciugare sufficientemente il giorno di preparazione, e portare a temperatura ambiente dopo conservazione frigorifera per ridurre efficacemente la diffusione delle colonie. </li></ol></li><li> Ottenere piastre cioccolato e cromogenico agar e equilibrare a temperatura ambiente prima di ogni esperimento. </li><li> Sottocultura tutti i 54 ceppi microbici indicati nella tabella 1 ogni pochi days. <ol><li> Utilizzare un ciclo inoculo sterile per trasferire le culture da uno stock congelati o un lotto precedente di terreni non selettivi, come BHI, TSB / TSA o agar cioccolato. Grow halophilic Vibrio spp. su TSBS / TSAS. </li><li> Per controllare la purezza della cultura, consecutive tutti i ceppi in un modello che consenta di osservazione di colonie isolate. Ad esempio, utilizzare un modello striature trifase per diluire una grande quantità di batteri per piccole quantità, per ottenere alla fine colonie isolate. </li></ol></li><li> Incubare le piastre a testa in giù a 35-37 ° C per un massimo di 48 ore. Per campylobacter spp., Incubare i tubi o piastre in un vaso chiuso coperchio contenente una sacca di gas per produrre un ambiente microaerofili. Osservare morfologia delle colonie dopo l&#39;incubazione. colture pure dovrebbero produrre colonie che presentano simili morfologia delle colonie. NOTA: Incubare tutte le piastre capovolta per evitare goccioline d&#39;acqua condensate formate sul lato inferiore del coperchio di cadere sul colleOnies. </li></ol> 2. Specie Determinazione mediante PCR <ol><li> Condurre tlh -PCR per confermare l&#39;identità di V. ceppi parahaemolyticus. Utilizzare primer tlh -F (5 &#39;AAA GCG GAT TAT GCA GCA GAA CTG 3&#39;) e tlh -R (5 &#39;GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3&#39;) per amplificare un frammento di 450 bp del gene termolabile hemolysin 20 . <ol><li> Utilizzare un ciclo inoculo sterile per trasferire alcune colonie isolate di ciascun V. parahaemolyticus ceppo da TSAS a 5 ml di TSBS. Incubare a 35-37 ° C per 16-24 ore. </li><li> culture centrifugare a 14000 g per 1 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte con tampone fosfato (PBS). Far bollire la sospensione per 3 minuti a cedere lisato cellulare. NOTA: V. parahaemolyticus è facile essere lisate. Pertanto reagente di lisi non è necessaria. È anche possibile usare un po &#39;di colonia direttamente come modello. </li><li> Eseguire la PCR in una reazione di 25 microlitri volume. Preparare una miscela di reazione contenente una concentrazione finale di 1x tampone PCR, 1,5 mM MgCl 2, 100 mM di ciascun dNTP, 1 mM di ciascun primer, 1 U Taq polimerasi e 1 ml di lisato cellulare. Dopo preincubazione a 94 ° C per 5 min, eseguire 35 cicli di amplificazione di 94 ° C per 30 sec, 58 ° C per 30 sec e 72 ° C per 60 sec 21. </li><li> aliquote di carico di amplicone 5 ml a 1,5% gel di agarosio. Attivare alimentazione per iniziare l&#39;elettroforesi. Visualizzare la presenza o l&#39;assenza di ampliconi sotto illuminazione UV dopo colorazione con etidio bromuro. </li></ol></li></ol> 3. La crescita su selettivo e differenziale media <ol><li> Da due a quattro giorni prima dell&#39;esperimento, striscia tutti i ceppi microbici indicati nella tabella 1 su terreno non selettivo (TSAS, BHI o agar cioccolato) per l&#39;isolamento delle colonie. Incubare le piastre a 35-37 ° C per 48 ore. Controllare la purezza delle culture osservando la morfologia delle colonie dopo incubazione. colture pure dovrebbero produrre colonie che presentano simili morfologia delle colonie. </li><li> Trasferire alcune colonie isolate dal punto 3.1 in 5 ml di brodo. Incubare le provette a 35-37 ° C per 16-24 ore. Nota: utilizzare giovani colonie, che sono meno di quattro giorni, per preparare le culture durante la notte in tutti gli esperimenti. </li><li> Streak un&#39;ansata di culture durante la notte su terreni selettivi e differenziali (TCBS e cromogenico agar) per l&#39;isolamento delle colonie. Incubare le piastre a 35-37 ° C per un massimo di 96 ore. </li><li> Registrare la crescita complessiva di tutti i ceppi esaminando sia la densità coltura su piastra e la dimensione delle colonie isolate. Registrare il colore delle colonie sotto luce ambientale e / o UV. Nota altre caratteristiche della colonia isolata, come l&#39;elevazione, il margine e la forma. </li></ol> Assay 4. Recupero <ol><li> Selezionare un sottoinsieme rappresentativo di V. ceppi parahaemolyticus (n = 14) che comprendono diversi sierotipi e le origini di isolamento <sup&gt; 22. Seminare giovani culture dalle piastre in 5 ml di TSBS. Incubare le provette a 35-37 ° C per 16-24 ore. </li><li> Effettuare un metodo Plate Count standard delle culture overnight come descritto di seguito. <ol><li> Vortex per mescolare bene le culture durante la notte. Fare un 10 volte o 10 -1 diluizione con il trasferimento di 100 microlitri della cultura durante la notte in una provetta contenente 900 ml di PBS. Vortex per mescolare bene. </li><li> Utilizzare un nuovo puntale per trasferire 100 ul dal tubo 10 -1 diluizione ad un altro tubo contenente 900 ml di PBS. Vortex per mescolare bene. Ciò costituisce 10 -2 diluizione. Ripetere il processo sequenziale di ottenere 10 -7 diluizione. </li><li> Utilizzando i tubi di diluizione 10 -4 a 10 -7, piatto 100 ml ciascuno sulle cromogenici, TCBS e CST piastre di agar. NOTA: Il fattore di diluizione (df) sulla piastra diventa 10 -5 a 10 -8, rispettivamente. </li><li> Stendere le aliquote in modo uniforme su tegli AGAR superficie. NOTA: È bene utilizzare lo stesso spreader per ceppo sullo stesso supporto, purché il un&#39;aliquota più diluito viene diffuso prima (cioè, da 10 -8 a 10 -5). Non usare la stessa spreader per diversi media. </li><li> Incubare le piastre a 35-37 ° C per un massimo di 96 ore. Contare colonie sulle piastre. Ignorare lastre portanti colonie che sono troppo numerosi per contare (TNTC) o minore di 25. Calcolare CFU / ml secondo il seguente: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Dove N = numero di cellule nel tubo non diluito, espressa come CFU / ml o CFU / g C = il numero totale di colonie contate su piastre che portano 25-300 colonie n 1 = il numero di targa (s) dove colonie contate sono da df minore n 2 = il numero di targa (s) dove colonie contate sono dalla successiva diluizione di 10 volte dF = fattore di diluizione più basso (vale a dire, la diluizione più concentrata) </li></ol></li><li> Confronto CFU / ml tra i diversi mezzi di comunicazione. Utilizzare CFU / ml su TSAS al 100%, calcolare il recupero% di V. parahaemolyticus cresciuto sul agar cromogenico e TCBS. </li></ol> Assay 5. Concorrenza <ol><li> Scegliere un sottoinsieme di ceppi che mostrano diverse morfologie di colonia sul agar cromogenico e TCBS. NOTA: In questo modo, sarà possibile contare le colonie originati da V. parahaemolyticus solo, nonostante la presenza di altre specie nella inoculo. <ol><li> Scegliere un V. ceppo parahaemolyticus che produce i turchesi e ciano colonie attesi sulle TCBS e l&#39;agar cromogenico, rispettivamente. </li><li> Scegli un non V. parahaemolyticus e una specie non Vibrio che non crescono su uno di questi mezzi, o presentano diversi colori colonia. NOTA: per esempio, V. metschnikovii cresce molto debolmente on TCBS e non crescono sulla agar cromogenico. Shigella sonnei non crescono sugli TCBS ma produce colonie magenta sul agar cromogenico. </li></ol></li><li> Dopo la selezione dei ceppi di cui sopra, preparare brodi di coltura durante la notte utilizzando colonie isolate cresciute su terreni non selettivi. <ol><li> Fare culture durante la notte di V. parahaemolyticus e V. metschnikovii trasferendo alcune colonie isolate da TSAS a 5 ml di TSBS. Incubare a 35-37 ° C per 16-24 ore. </li><li> Fare culture durante la notte di Shigella sonnei con il trasferimento di alcune colonie isolate da BHI agar a 5 ml di brodo BHI. Incubare a 35-37 ° C per 16-24 ore. </li></ol></li><li> Per ogni ceppo, eseguire una serie di diluizioni simile ai punti 4.2.1 e 4.2.2. Piastra diluizioni appropriate sul TSAS o BHI per determinare CFU / ml della cultura durante la notte, utilizzando l&#39;equazione mostrato al passaggio 4.2.5. NOTA: in genere, 100 ml di diluizione 10 -5 a 10 -7tubi funziona per la maggior parte delle culture. Utilizzare i valori CFU / ml per eseguire il calcolo l&#39;esatta quantità di cellule utilizzate nella fase successiva. I valori CFU / ml calcolati si ottengono dopo incubazione, anche se le seguenti operazioni vengono eseguite nella stessa data come punto 5.3. </li><li> Utilizzando le culture durante la notte e tubi di diluizione in passi 5.2 e 5.3, mescolare diverse quantità di un V. ceppo parahaemolyticus e un non V. Specie parahaemolyticus. Ad esempio, miscelare 500 ml di tubo 10 -5 diluizione V. parahaemolyticus con 500 ml di culture durante la notte di V. metschnikovii. NOTA: Questa miscela simula fondo elevato microflora. Per simulare uno sfondo partire microflora, mescolare 500 ml ciascuna del tubo 10 -5 diluizione da entrambe le specie. </li><li> Distribuire 100 ml di miscela ciascuno sulla cromogenici, TCBS e CST piastre di agar. </li><li> Dopo incubazione a 35-37 ° C per un massimo di 96 ore, contare le colonie di V. parahaemolyticus e la non V. Specie parahaemolyticus in base alla loro differenza di crescita e morfologia delle colonie su agar cromogenico e TCBS. NOTA: Ad esempio, se la non V. specie parahaemolyticus non cresce sulla agar cromogenico e TCBS, tutte le colonie saranno di V. parahaemolyticus. Se la mancata V. Specie parahaemolyticus cresce su entrambi i supporti, solo le colonie turchese su colonie TCBS e ciano su agar cromogenico saranno di V. parahaemolyticus. La mancata V. Specie parahaemolyticus può o non può esibire simili morfologia delle colonie a V. parahaemolyticus su TSAS. <ol><li> Se la mancata V. Specie parahaemolyticus cresce in modo simile a V. parahaemolyticus su questo terreno non selettivo, dividere il conteggio delle colonie per due per ottenere i numeri per V. parahaemolyticus solo. Confrontare il conteggio effettivo colonie con il conteggio atteso derivata dal punto 5.3. </li></ol></li></ol> 6. Effetti di Oyster omogenati <ol><li> Pesare ≥50 g di carne di ostriche da ≥12 molluschi tra cui carne e liquori. <ol><li> Aggiungere la stessa quantità di PBS alla carne di ostriche e liquori. Miscela la miscela ad alta velocità per 90 sec. Ciò costituisce 2 -1 diluito omogeneizzato di ostriche. </li><li> Aggiungere 100 g di 2 -1 diluito omogenato ostriche a 400 g di PBS. Utilizzare una scala per misurare il peso, non in volume. Frullare il composto ad alta velocità per 1 min. Autoclave l&#39;omogeneizzato di ostriche. NOTA: Questo sarà l&#39;omogeneizzato ostrica utilizzato per la chiodare. </li></ol></li><li> Ripetere l&#39;analisi di recupero (fase 4), in presenza di ostriche omogeneizzato. <ol><li> Dopo il 500 g di ostriche omogenato si raffredda, aggiungere 100 ml di V. parahaemolyticus culture durante la notte coltivate in TSBS ad esso. Determinare la quantità effettiva di V. cellule parahaemolyticus nel inoculo di gestione delle procedure di conteggio su piastra standard descritti al punto 4.2. </li></ol></li><li> rappresentantemangiare il saggio di concorrenza (punto 5) in presenza di ostriche omogeneizzato. <ol><li> Dopo il 500 g di ostriche omogenato si raffredda, aggiungere 100 ml ciascuna delle culture durante la notte di V. parahaemolyticus e non V. parahaemolyticus ad esso. Determinare la quantità effettiva di batteri cellule nel inoculo di gestione delle procedure di conteggio su piastra standard descritto al punto 4.2 </li></ol></li><li> Mescolare le cellule batteriche con ostriche omogenato bene usando un omogeneizzatore. NOTA: Dopo la miscelazione, l&#39;omogeneizzato ostriche contenente le cellule aggiunti intenzionalmente è chiamato a spillo ostriche omogeneizzato. </li><li> Fare diluizioni del omogeneizzato ostrica a spillo per ottenere 10 -1 a 10 -3 tubi di diluizione secondo le modalità descritte al punto 4.2.2. Distribuire 100 ml di ogni diluizione sul cromogenico, TCBS e TSAS agar. Incubare le piastre a 35-37 ° C per un massimo di 96 ore. </li><li> Confrontare la conta delle colonie su agar reale cromogenico e TCBS con l&#39;expected conteggio delle colonie dedotta da Piazza 6.2.1 e 6.3.1. NOTA: Ad esempio, se un tubo di V. parahaemolyticus coltura overnight contiene 10 8 UFC / ml, un inoculo di 100 microlitri significa che 10 7 cellule vengono aggiunti 500 g di ostriche omogenato, ottenendo 5 x 10 4 cellule / g. Dopo la diluizione e la placcatura, la piastra avendo df = 10 -2 dovrebbe produrre 500 colonie; mentre che avere df = 10 -3 dovrebbe cedere 50 colonie. Queste sono le conta delle colonie attesi. </li></ol>

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D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+thiosulphate-citrate-bile+salt+sucrose+(TCBS)+agar+and+CHROMagar+Vibrio+for+isolating+Vibrio+parahaemolyticus.">Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus.</a> Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).</li><li>Canizalez-Roman, A., Flores-Villase&#241;or, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Le&#242;n-Sicairos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+a+chromogenic+agar+medium-PCR+protocol+with+a+conventional+method+for+isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+strains+from+environmental+and+clinical+samples.">Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples.</a> Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).</li><li>Kriem, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Vibrio+spp.+in+raw+shrimps+(Parapenaeus+longirostris)+and+performance+of+a+chromogenic+medium+for+the+isolation+of+Vibrio+strains.">Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains.</a> Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).</li><li>Food Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+guidance+on+reporting+results+from+studies+evaluating+diagnostic+tests.">Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests.</a> http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).</li><li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+laboratory-developed+molecular+assays+for+infectious+diseases.">Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases.</a> Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).</li></ol>

Some media were generously provided by Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen conducted this study while a student at California Polytechnic State University. He is currently an employee of Hardy Diagnostics.

Questo studio si concentra sullo sviluppo terreni di coltura e di valutazione. Convenzionalmente, TCBS è selettivo e differenziale mezzo utilizzato per l&#39;isolamento e la rilevazione V. parahaemolyticus, V. cholerae e V. vulnificus 12. Tuttavia, le limitazioni sono stati riportati per questo mezzo, come l&#39;incapacità di differenziare V. cholerae da altre specie Vibrio. Il saccarosio e indicatore di pH sono gli agenti di differenziazione di TCBS. Così, la produzione...

In qualità di membro del genere Vibrio, V. parahaemolyticus è una curva, batterio a forma di bastoncello Gram-negativi, non sporigeni. Presenta elevata motilità sia in ambienti liquidi e semisolidi. La maggior parte V. ceppi parahaemolyticus non sono patogeni per l&#39;uomo, ma i sottotipi patogeni hanno causato epidemie e pandemie, quindi questa specie è considerata un importante agente patogeno di origine alimentare in molti paesi 1,2. L&#39;incidenza di infezione da Vibrio negli Stati Uniti ha mostrato una tendenza al rialzo dal 2000 3. Tra Vibrio spp., V. parahaemolyticus è la specie più frequentemente riportati causano malattie negli Stati Uniti 4,5. Altre specie clinicamente rilevanti includono V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, ecc Una piccola percentuale delle malattie è causata da specie multiple simultaneamente. V. parahaemolyticus è un ghiaccinhabitant di acqua marina e quindi ampiamente distribuita nelle acque marine in tutto il mondo, tra cui gli estuari. La specie è stata scoperta nel 1950 a seguito di un focolaio di intossicazione alimentare in Giappone. Negli Stati Uniti, la specie è stato isolato in acqua di mare, sedimenti, e frutti di mare nella regione di Puget Sound 6,7. Filtratori in habitat marini, come molluschi bivalvi, possono porto V. parahaemolyticus come parte della loro flora naturali 8. Come tale, V. infezioni parahaemolyticus in umano sono spesso legati al consumo di frutti di mare contaminati, in particolare frutti di mare crudi o poco cotti. Un percorso meno comune di entrata si verifica quando ferita aperta è esposto ad acqua di mare, che porta a infezioni della pelle. La maggior parte V. ceppi parahaemolyticus non causano malattie umane, ma alcuni sottotipi ospitano fattori di virulenza, come emolisina termostabile diretta (TDH) sono patogeni. I sintomi più frequenti di origine alimentare V. infezione parahaemolyticus sonodiarrea e dolori addominali, seguito da nausea, vomito e febbre. Mal di testa e brividi sono anche riportati. Il periodo di incubazione medio è di 15 ore, ma può essere fino a 96 ore dopo il consumo di una quantità sufficiente di ceppi patogeni 9. La malattia dura da due a tre giorni. I sintomi gastroenterite causata da V. parahaemolyticus sono largamente auto-limitante e quindi il trattamento speciale non è necessaria. I casi lievi di gastroenterite possono essere efficacemente trattati con reidratazione orale. Più gravi malattie possono essere trattati con antibiotici come la tetraciclina o ciprofloxacina 10. tasso di mortalità è circa il 2% per i casi di gastroenterite, ma può essere alto come il 29% per coloro che sviluppano infezione sangue o setticemia. Qualsiasi persona che consuma frutti di mare o ha ferita aperta esposta all&#39;acqua di mare è a rischio di V. infezione parahaemolyticus. La forma più grave di malattie, la setticemia pericolosa per la vita, è più comune in una sottopopolazione con sottostante co medicalli operativi 11, che includono l&#39;alcolismo, malattie del fegato, diabete, malattie renali, tumori maligni, e le altre condizioni che portano ad una risposta immunitario indebolito. In particolare, questo gruppo di individui è anche ad un elevato rischio di contrarre gravi malattie causate da V. vulnificus, che si trova in habitat naturali simili a V. parahaemolyticus. V. parahaemolyticus è abitualmente isolato usando tiosolfato-citrato-biliari sali-saccarosio (TCBS) agar come un terreno selettivo e differenziale. Arricchimento in acqua peptonata alcalina può precedere isolamento su TCBS agar. presunte colonie su TCBS sono poi ulteriormente testati in una serie di test biochimici e / o saggi molecolari mirati la presenza di geni specie-specifici. Metodi basati sulla PCR sono spesso usati per confermare l&#39;identità di V. parahaemolyticus amplificando il gene emolisina termolabile, tlh 12. Indipendentemente dal choice dei metodi di conferma, è importante disporre di un mezzo efficace per isolare e differenziare V. parahaemolyticus da altri vibrioni marini, in primo luogo. TCBS è stato solitamente usata per differenziare le specie all&#39;interno del genere Vibrio secondo le loro capacità di fermentare il saccarosio 12. Reazione di fermentazione positiva è accompagnato da un cambiamento di colore dell&#39;indicatore pH bromotimolo blu. V. colonie parahaemolyticus sono abbastanza distintivo TCBS, esibendo blu al colore verde. Tuttavia, questo mezzo non può facilmente distinguere V. alginolyticus e V. cholerae. Proteus saccarosio-fermentazione possono produrre colonie gialle simili a V. cholerae o V. alginolyticus 13. Su isolamento iniziale TCBS, V. parahaemolyticus può anche essere erroneamente identificato come Aeromonas hydrophila, shigelloides Plesiomonas, e Pseudomonas spp 14. Ceppi con ferm saccarosio in ritardosentazione può essere confusa con altri saccarosio nonfermenting Vibrio 13, che comprendono V. parahaemolyticus. TCBS è risultato essere non sensibili contro Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, tra gli altri. Diverse altre specie cedono verde di colonie grigie, che sono potenzialmente confondibili con V. parahaemolyticus o V. vulnificus 15. Di conseguenza, è desiderabile sviluppare mezzi di cultura alternativa con una migliore sensibilità e specificità verso individuare e isolare V. parahaemolyticus e di altre specie strettamente correlate. Diverse alternative dei media sono stati recentemente sviluppati. Inoltre l&#39;inclusione di agenti selettivi, più incorporano substrati cromogeni per differenziare le specie in base alle loro attività enzimatiche differenziali. Ad esempio, indoxyl-β-glucoside e indoxyl-β-galattoside sono stati utilizzati come substrati cromogeni differenziare V. paràcolonie haemolyticus (che appaiono blu-verde) da quelle di V. cholerae (viola) a causa della loro capacità di produrre differenziali β-glucosidasi e β-galattosidasi 16. Diverse formulazioni di cromogenico agar sviluppate da diversi gruppi sono stati valutati e sono stati segnalati per eseguire paragonabile o superiore a quella TCBS 17,18,19. Un vantaggio di utilizzare un terreno cromogeno è che la colorazione del mezzo circostante è minimo facilitando così l&#39;isolamento di colonie particolari. In questo studio abbiamo valutato la capacità di un terreno cromogeno nuova formulazione per rilevare ed isolare V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus; con un focus particolare sulla sua capacità di differenziare V. parahaemolyticus da altre specie.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0418-17-7</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Blender</td><td>Any</td><td></td><td>to blend oyster meat</td></tr><tr><td>CampyGen gas generator</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>CN035A</td><td>to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands</td></tr><tr><td>Chocolate agar plates</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>E14</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Common PCR reagents (dNTPs, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Polymerase)</td><td>Any</td><td></td><td>or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50712</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S348903</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Gel doc</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HardyChrom Vibrio agar plates</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>G319</td><td>This study evaluates this medium</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>10 microliter-size was used in this study</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Oysters</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>R23701</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>Pipette and tips</td><td>Any</td><td></td><td>Sterilized tips</td></tr><tr><td>Primers for &lt;em&gt;tlh&lt;/em&gt;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreader</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td>Beads may be used instead</td></tr><tr><td>Stomacher blender</td><td>Stomacher</td><td>400</td><td>Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.&amp;nbsp; Other homogenizer can be used.</td></tr><tr><td>Sterile filter bags for blenders</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-5</td><td></td></tr><tr><td>TCBS powder</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>265020</td><td>This study evaluates this medium</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSB powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-07-5</td><td>may use other brands</td></tr><tr><td>UV viewing cabinet</td><td>Any</td><td></td><td>Emit long-wave UV light</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Any</td><td></td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Sources&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial species and strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aeromonas hydrophila&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Campylobacter jejuni&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Proteus mirabilis&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt; Choleraesuis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella boydii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella flexneri&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella sonnei&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Vibrio alginolyticus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. cholerae&lt;/em&gt; (serotypes include &lt;em&gt;O139, O1,&lt;/em&gt; non &lt;em&gt;O1, El Tor&lt;/em&gt; biovars)</td><td>FDA, ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. damsela&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fisheri&lt;/em&gt;</td><td>Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fluvialis&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. furnissii&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. hollisae&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. metschnikovii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. mimicus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. parahaemolyticus&lt;/em&gt; (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td>ATCC, FDA, CDC, Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. proteolyticus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. vulnificus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of a more sensitive and specific chromogenic agar medium for the detection of vibrio parahaemolyticus and other vibrio species

Infezioni di origine alimentare negli Stati Uniti causata da specie Vibrio hanno mostrato una tendenza al rialzo. Nel genere Vibrio, V. parahaemolyticus è responsabile per la maggior parte delle infezioni -associated Vibrio. Così, la differenziazione precisa tra Vibrio spp. e rilevazione di V. parahaemolyticus è di fondamentale importanza per garantire la sicurezza del nostro approvvigionamento alimentare. Sebbene le tecniche molecolari sono sempre più comuni, i metodi di coltura-base sono ancora regolarmente fatte e sono considerati metodi standard in determinate circostanze. Pertanto, un nuovo mezzo agar cromogeno è stato testato con l&#39;obiettivo di fornire un metodo migliore per l&#39;isolamento e la differenziazione di clinicamente rilevante spp Vibrio. Il protocollo rispetto al limite di sensibilità, specificità e rilevamento per il rilevamento di V. parahaemolyticus tra il nuovo terreno cromogeno e un mezzo convenzionale. Vari V. ceppi parahaemolyticus (n = 22) ripresentando diversi sierotipi e fonte di origine sono stati utilizzati. Essi sono stati precedentemente individuati dalla Food and Drug Administration (FDA) e Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (CDC), e ulteriormente verificati nel nostro laboratorio da tlh -PCR. In almeno quattro prove separate, questi ceppi sono stati inoculati sui cromogenici agar e tiosolfato-citrato-biliari sali-saccarosio (TCBS) agar, che è il mezzo consigliato per la coltura di questa specie, seguita da incubazione a 35-37 ° C per 24 -96 ore. Tre V. ceppi parahaemolyticus (13,6%) non sono cresciuti in modo ottimale su TCBS, comunque esposti colonie verdi se non ci fosse la crescita. Due ceppi (9,1%) non ha dato i colonie ciano attesi sul agar cromogenico. V. non- ceppi parahaemolyticus (n = 32) sono stati testati per determinare la specificità del agar cromogenico. Tra questi ceppi, 31 non sono cresciuti o esposte altre morfologie di colonia. Il recupero medio di V. parahaemolyticus sul chromogenic agar era ~ 96,4% rispetto al agar soia trittico integrato con il 2% di NaCl. In conclusione, il nuovo agar cromogeno è un mezzo efficace per rilevare V. parahaemolyticus e per differenziarlo da altri vibrioni.

In questo studio, 54 ceppi microbici sono stati assemblati, che comprendeva 22 ceppi all&#39;interno V. Specie parahaemolyticus, altre 19 specie Vibrio, e 13 specie Vibrio non (Tabella 1). La maggior parte V. ceppi parahaemolyticus erano o ricevute da parte della FDA, CDC o altri dipartimenti sanitari statali. Essi rappresentano diversi sierotipi e fonti di isolamento. Questi ceppi sono stati precedentemente identific...

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Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; E Altro<em&gt; Vibrio</em&gt; Specie

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

14.4K Views.  California Polytechnic State University. Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium. 

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'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

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Immunologia e infezioni

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Metodo ecotossicologico con i batteri marini<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Per valutare la tossicità acuta dei contaminanti ambientali

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Ambiente

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

La colonizzazione delle Euprymna scolopes Squid da Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Bioingegneria

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Isolati clinici ed ambientali

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Induzione della differenziazione cellulare e dell&#39;immagine delle cellule singole di<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Nuotatore e cellule Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Coincubation Valutazione per quantificare le interazioni competitive tra Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Rapid Protocollo per la preparazione di elettrocompetenti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di

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