Questo progetto è stato parzialmente finanziato da un NSF IOS (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA di Grant Seed (2.011-04.375), e Sir Frederick McMaster Research Fellowship a ABD.

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines.">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).</li><li>Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+microarrays+for+the+high-throughput+identification+of+protein-protein+interactions.">Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions.</a> Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).</li><li>Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cold-shock+response+in+cultured+mammalian+cells:+Harnessing+the+response+for+the+improvement+of+recombinant+protein+production.">The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production.</a> Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Eseguendo l&#39;esperimento in tre pozzi replicate, fago acquisito indipendentemente vincolante all&#39;esca stessa proteina può essere distinto anche se sono lo stesso clone (cioè nessuna differenza nella sequenza nucleotidica della regione CDS che è stata acquisita ma questi sono stati recuperati dai pozzi indipendenti). Altrimenti, l&#39;unico modo per distinguere tra fago codifica vincolante per l&#39;esca stessa proteina è se sono indipendentemente invertire regioni trascritte che differiscono in qualc...

Perché usare phage display e la selezione affinità invece della miriade di altre tecniche disponibili per la scoperta e lo studio delle interazioni proteina con altre molecole? Phage display può vantare alcuni vantaggi unici rispetto ad altri metodi di rilevazione di interazioni proteina-ligando 1-3, tra cui i seguenti: Molto ampio repertorio di molecole esca Il motivo principale è nella diversità delle molecole in grado di agire come esca nella selezione affinità 4. Phage display è un potente mezzo di isolare frammenti di proteine ​​che interagiscono con altre proteine, nucleotidi, carboidrati, ecc 5 In sostanza, se un polimero / molecola può essere attaccato ad un supporto recuperabile, può essere schermato per affinità con le proteine ​​fagiche visualizzati. Inoltre, la molecola esca può accedere per determinare se esso mantiene l&#39;attività biologica quando immobilizzato 6, se le condizioni usati per reduce / eliminare la sua attività sono efficaci o 6, per introdurre modificazioni post-traslazionali per l&#39;esca prima selezione affinità. Fago resistenza a fattori esterni Una seconda ragione per usare phage display, è che è possibile che alcune esche possono richiedere stress ambientale (calore, elevate concentrazioni osmolyte, cofattori specifici, etc.) Per catturare le proteine ​​interagenti, o le proteine ​​indicate nel fago può essere necessario qualche modo alterato prima della selezione di affinità. Il fattore primario di essere studiati rappresenta l&#39;interazione tra esca e proteine, non la condizione che consente l&#39;interazione si verifichi o se non è letale per l&#39;organismo di prova. Il fago T7 è particolarmente adatto per tali studi perché può sopportare condizioni sperimentali difficili sia intatto e vitali (ad esempio il massimo termico pubblicato per vitalità T7 è ~ 60 ° C 7). Come esempio di alterazione fago visualizzata proproteine, nell&#39;esaminare il proteoma seme Arabidopsis thaliana per substrati proteici del enzima di riparazione, Proteina Isoaspartyl metile Transferease (PIMT), il virus utilizzato in questi studi era stato &quot;invecchiato&quot; per una settimana, prima di ogni selezione affinità turno, per favorire l&#39;introduzione di isoaspartate (isoAsp) residui di proteine ​​sensibili 6 che non è possibile negli organismi in grado di riconoscere e riparare / metabolizzare tali anomalie. Metabolicamente inerte Inoltre, il fago sono solitamente resistenti ai veleni metabolici e interferire piccole molecole che, almeno, provocare effetti pleiotropici sugli organismi di prova metabolicamente attive. Seguendo i lavaggi di stringenza, il veleno viene rimosso prima che una grande quantità di batteri vengono introdotti per infezione così il veleno viene diluita ad una gamma innocuo per i batteri o successiva replica fago. Mentre indaga bersagli proteici della riparazione PIMTenzima, S-adenosil metionina (AdoMet) è stato utilizzato per attivare l&#39;enzima micro-titolo-piastra-ben immobilizzato per consentire di cattura della proteina bersaglio mentre si basa su S-adenosil omocisteina (AdoHcy) per inattivare l&#39;enzima e fornire un controllo negativo utile fissare in la consapevolezza che il virus non essere negativamente influenzata da una AdoMet o AdoHcy 6. Inoltre, membri di alcune famiglie embriogenesi Dopo abbondante (LEA) proteine ​​indagate in questo laboratorio, sono noti per alterare la loro forma in presenza di additivi come saccarosio 8, che possono raggiungere concentrazioni fino a 200 mm di semi di soia al punto di maturità fisiologica 9. Il virus non è previsto per essere influenzato da aggiunta di saccarosio di 200 mm in ogni round di selezione per affinità, forse necessario per alcune interazioni proteina LEA-client, che non è il caso per gli organismi di prova autonomamente vitali 10. Questo laboratorio si è concentrata sulla discovering interazioni proteina-proteina in maturi, i semi disidratati o germinazione che sono alla base del meccanismo di protezione proteoma immagazzinata durante la disidratazione 11 o la riparazione dei componenti del proteoma memorizzata che sono sensibili alla formazione isoAsp una volta che il seme ha assorbito 6. Così, la produzione e purificazione di proteine ​​ricombinanti richiesti come esca in uno stato attivo, e garantendo che rimangano così, prima e dopo che sono immobilizzati, anche se spesso difficile, è un elemento fondamentale per il nostro lavoro. Tuttavia, come ogni scenario di produzione di proteine ​​ricombinanti è diversa, le condizioni di ottimizzazione per la produzione di proteine ​​ricombinanti non verranno affrontati qui. Gli utenti sono invitati a tentare, ove possibile, per determinare se la proteina immobilizzata è ancora funzionante (ad esempio se si tratta di un enzima, fare un test enzimatico nei pozzetti di micropiastre). Questo fornirà una certa sicurezza che l&#39;esca è biologicamente attivo e, pertanto, che eventuali interazioni scoperti sonoalquanto più probabilità di avere rilevanza biologica.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryptone</td>
 <td>Becton Dickinson Co.</td>
 <td>211705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast Extract</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>212750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>214010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP358-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Research Products International</td>
 <td>A20090</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blocking Reagent</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td>69064</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP337-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP359-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1145-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Escherichia coli BLT5403</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td>BLT5403</td>
 <td>Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ampicillin, Sodium Salt</td>
 <td>Research Products International</td>
 <td>A40040</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ethidium bromide</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP102-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>A-9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>penta-HIS primary antibody</td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>34660</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>A-5153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>para-nitrophenylphosphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>N-7653</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T7-UP primer</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td></td>
 <td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T7-DOWN primer</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td></td>
 <td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>28104</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick Gel Extraction kit </td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>28706</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
 <td>Invitrogen Life Technologies</td>
 <td>4336917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td>
 <td>18780</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 Well Cell Culture Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>Costar 3590</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isotemp Incubator Oven</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>516D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipets, 5 &frac34;"</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>13-678-20A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChromaView Transilluminator</td>
 <td>UVP Inc.</td>
 <td>TS-15</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Shield</td>
 <td>Oberon</td>
 <td>071AF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gloves, Nitrile</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>19-170-010C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile 1.5 ml tubes</td>
 <td>USA Scientific Inc</td>
 <td>1615-5500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml borosilicate Pipets</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>13-678-25E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate culture tubes</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>14-961-27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uniskan I, ELISA plate reader</td>
 <td>Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland</td>
 <td>Type 362</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits

Utilizzando fago ricombinante come impalcatura per presentare varie porzioni di proteine ​​codificate da una libreria di cDNA clonato direzionalmente a molecole esca immobilizzate è un mezzo efficace per scoprire le interazioni. La tecnica è stata ampiamente utilizzata per individuare le interazioni proteina-proteina, ma la molecola esca per essere messo in discussione non deve essere limitata alle proteine. Il protocollo qui presentato è stato ottimizzato per consentire un modesto numero di esche da sottoporre a screening in replicati per massimizzare l&#39;identificazione di cloni indipendenti che presentano la stessa proteina. Ciò consente una maggiore fiducia che le proteine ​​che interagiscono individuate sono interattori legittimi della molecola esca. Monitoraggio del titolo fago dopo ogni selezione affinità fornisce rotonda informazioni sulla selezione di affinità sta procedendo nonché sull&#39;efficacia dei controlli negativi. Uno dei mezzi per la titolazione del fago, e come e cosa preparare in anticipo per consentire a questo processo di progredire nel modo più efficientepossibile, è presentato. Attributi di ampliconi recuperati previo isolamento della placca indipendente sono evidenziate che può essere utilizzata per determinare quanto bene la selezione di affinità è progredita. Difficoltà tecniche per ridurre al minimo i falsi positivi o per aggirare persistente recuperare fago riprese sono spiegato. Mezzi di ridurre la contaminazione virale divampare sono discussi.

Potendo compromettere la capacità del esca per interagire con le proteine ​​fagiche-visualizzata (metabolicamente avvelenare l&#39;esca) fornisce un controllo negativo potente per questa tecnica. E &#39;inoltre consigliabile determinare se l&#39;esca, quando si lega al micropiastra bene, mantiene la sua funzione. Entrambi questi controlli aumenterà la fiducia che interagiscono, proteine ​​fago-visualizzato recuperati dal esca nonpoisoned sono legittime. Campionamento tre triplicato...

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A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Phage display è una tecnica potente per catturare proteine ​​o porzioni di proteine ​​che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

33.7K Views.  University of Kentucky.  Phage display è una tecnica potente per catturare proteine ​​o porzioni di proteine ​​che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori. 