L&#39;autore ringrazia Roberto Kolter (Harvard Medical School) per la sua preziosa consulenza e assistenza durante lo sviluppo di questa schermata co-coltura. Ha anche grazie Matthew Powers per leggere il manoscritto per chiarezza, e Chia-yi Cheng per l&#39;assistenza con l&#39;ottenimento di Figura 6.

<ol>
	<li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+microbial+metabolites.">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis.">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus.">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li><li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis.">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li><li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis.">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li><li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis.">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li><li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis.">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li><li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+(CGG)+genes+in+different+bacterial+genera.">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li><li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li><li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1.">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+culture+of+'unculturable'+bacteria.">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li><li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Saccharomyces+interactions:+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival.">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Uno dei limiti intrinseci di questo protocollo è che si basa sulla coltivabilità degli organismi microbici. Come è stato ben documentato 24, più la vita microbica del pianeta non può (ancora) essere coltivata nelle condizioni di coltura esplorati fino ad oggi. Così, un enorme numero di interazioni tra le specie microbiche che si stanno verificando in ambienti naturali passeranno inosservati utilizzando questo approccio. Tuttavia, poiché il nostro desiderio è quello di individuare non solo l&#39;esiste...

Siamo interessati a capire come i metaboliti che i batteri secernono influenzano la fisiologia e lo sviluppo di microbi vicini. Molti metaboliti sono stati caratterizzati per i loro effetti bioattivi su altri microbi. Due esempi ben descritti comprendono antibiotici, che inibiscono la crescita di altri microbi, e molecole quorum sensing, che alterano l&#39;espressione genica globale di altri microbi. Tuttavia, i batteri producono molti altri piccoli prodotti naturali molecola che non hanno conosciuto bioattività 1. Noi ipotizziamo che i batteri si sono evoluti e conservato la capacità di produrre alcuni di questi metaboliti perché consentono loro di modulare la fisiologia cellulare dei loro vicini microbica nelle comunità microbiche complesse all&#39;interno delle quali esistono maggior parte dei batteri. Tipi cellulari Bacillus subtilis Abbiamo concentrato i nostri studi sulle interazioni microbiche mediate chimicamente che coinvolgono Bacilsubtilis LU. Questo non solo a causa del suo status di modello batterio Gram-positivi e gli strumenti genetici risultanti disponibili per la sua manipolazione, ma anche per la sua capacità di differenziarsi in tipi cellulari caratterizzati. Esempi includono cellule che sono: nuoto, producono la matrice extracellulare che è necessario per la formazione di biofilm robusta; competenti ad assumere DNA dall&#39;ambiente e sporulanti, tra gli altri 2. Ognuno di questi tipi di cellule esprime una caratteristica regulon trascrizionale che li rende fisiologicamente e / o fisicamente distinti dai loro fratelli geneticamente identici. Sotto molte condizioni di crescita, più tipi di cellule coesistono varie sottopopolazioni all&#39;interno di una singola colonia di B. cellule subtilis 3. Sebbene molte specie di batteri possono presentare analogo tipo cellulare eterogeneità, questo fenomeno è stato particolarmente studiato in B. subtilis. In particolare, i geni che sono UPRegulated all&#39;interno di ciascuno di questi specifici B. Sono stati identificati tipi cellulari subtilis. Identificare tali geni upregulated è essenziale per il lavoro qui descritto perché molti di questi fenotipi microbici di interesse sono difficili o impossibili da osservare direttamente. Per esempio, non siamo in grado di rilevare visivamente un tratto come il nuoto su solide (1,5%) piastre di agar, anche se una sottopopolazione di B. cellule subtilis producono flagelli in queste condizioni 3. Un altro esempio è biofilm matrice-produzione. Produzione Matrix può essere visualizzato da morfologia delle colonie (come risulta nelle colonie macroscopicamente rugose), ma solo su determinati mezzo di crescita, e solo dopo diversi giorni di crescita 4. Tuttavia, conoscendo quali geni sono upregulated durante la differenziazione, possiamo costruire reporter trascrizionali che agiscono come marcatori di differenziazione cellulare in questi tipi cellulari. Costrutti reporter Queste t fluorescentereporter ranscriptional costituiti dai promotori per i geni specifici di tipo a cella guidare la produzione di un gene reporter, per esempio una proteina fluorescente. Gli esempi includono P HAG-YFP (per il nuoto celle), P Tapa-YFP (per le celle della matrice che producono biofilm), e P SSPB-YFP (per sporulanti celle), dove P x indica la regione del promotore per il gene x. Questi costrutti reporter sono integrati in un locus neutro sul cromosoma (Figura 1 e, vedi sotto) in modo che la regolazione nativo del fenotipo è lasciata intatta. Tuttavia, ora quando una cellula esprime questo fenotipo, esprime anche una proteina fluorescente. Ciò fornisce un read-out facilmente visualizzati dell&#39;attivazione del comportamento particolare fenotipica, che ci permette di screening per i microbi che attivano questa risposta fisiologica. Sebbene tali giornalisti sono comunemente utilizzati in microbiologia, non sono stati ampiamente applicati in schermi a identifinterazioni metaboliche y tra i microbi prima di questo metodo è stato descritto 5. Ci sono una serie di considerazioni importanti nella progettazione e costruzione di cellule-tipo-specifici ceppi Reporter. Abbiamo utilizzato reporter fluorescenti esclusivamente trascrizionali, sebbene altri tipi di costrutti sono certamente possibili. Noi scoraggiamo l&#39;uso di fusioni traslazionali come marcatori per tipo di cellula differenziazione nel nostro schermo, però, per due motivi: 1) il desiderio di lasciare la cella-specifico del tipo proteina nativa imperturbabile, e 2) il riconoscimento che una diffusa, cellula- ampia fluorescenza sarà più facile da rilevare rispetto puncta localizzata all&#39;interno delle cellule (comune con fusioni traslazionali). Selezione gene reporter Dopo aver deciso di utilizzare trascrizione come-out leggere, il gene reporter deve essere selezionata (ad esempio LacZ, fluorescenza, o luciferasi). LacZ ha il vantaggio di subire almeno specialezato apparecchiature per rilevare, ma vi è un rischio molto più elevato di falsi positivi tra microbi ambientali. Nelle nostre mani, il livello di Lac + organismi tra i microbi del suolo di sottofondo era proibitivo (&gt;&gt; 10% dei microbi del suolo erano blu (Lac +) su piastre X-gal, i dati non riportati). E &#39;possibile che titolando la concentrazione di X-gal in mezzo, questo potrebbe essere ottimizzata per consentire l&#39;uso di un reporter X-gal, anche se non abbiamo tentato questa. Luciferase fornisce elevata sensibilità di rilevazione ed è il giornalista più ortogonale: non c&#39;è quasi nessuna possibilità di microbi ambientali essendo luminescenti intrinsecamente. Tuttavia, abbiamo trovato difficile individuare la strumentazione presso il nostro istituto che ha permesso la rilevazione di luminescenza in intere lastre di Petri, come la maggior parte sono stati progettati per eseguire la scansione solo le regioni localizzate in piastre multi-pozzetto. Ci potrebbe anche essere complicazioni nella visualizzazione colonie luminescenti in un modo che ha permesso anche la fisica contemporanea èolation degli organismi inducono. Durante l&#39;utilizzo fiduciari può aver reso possibile tutto questo, abbiamo invece deciso di utilizzare giornalisti trascrizionali fluorescenti, che sono stati dimostrato di funzionare in B. subtilis, purché adeguata sensibilità di rilevazione e di bassi tassi di falsi positivi tra gli organismi del suolo, e ha permesso di utilizzare facilmente di strumentazione disponibile sia per la visualizzazione e procedure di isolamento. Selezione fluoroforo Il fluoroforo specifica scelta dipenderà dalla vostra specie batteriche, il mezzo di agar di crescita che si sta utilizzando, e la particolare filtro di fluorescenza imposta che avete a disposizione. Con la nostra strumentazione, abbiamo scoperto che sia la B. subtilis se stessi e l&#39;agar sono state coltivate su esposto sfondo meno fluorescenza quando sono stati usati filtri YFP (proteina fluorescente gialla), rendendo il giornalista superiore a GFP (green fluorescent protein) nelle nostre mani colonie. Il codon usage di proteine ​​fluorescenti sonofrequentemente ottimizzato per eucarioti, che rende importante scegliere un fluoroforo sia noto dalla letteratura per lavorare nei vostri specie batteriche, o per testare esplicitamente utilizzando un promotore costitutivo. Un gran numero di continua evoluzione varianti proteiche fluorescente sono attualmente disponibili 6, che sono stati esaminati in un certo numero di fonti di 7,8, alcune delle quali prevedono esplicitamente una guida su come scegliere una proteina fluorescente appropriato per l&#39;esperimento 9. Selezione Promoter La scelta di un promotore dipenderà in gran parte dal tipo di cellulare o fenotipo di interesse. Per organismi come B. subtilis, alcuni specifici geni reporter cellula-tipo sono state stabilite in letteratura. Per gli altri ceppi batterici, l&#39;esame microarray o dati trascrizionali sarà necessario fornire informazioni su quali geni sono altamente upregulated nelle condizioni in cui il tipo di cellule di interesse is manifesto. Uno studio recente catalogato la trascrizione di B. subtilis inferiore a 104 diverse condizioni di crescita utilizzando microarrays piastrellatura 10. Questo documento fornisce informazioni complete su quali geni sono altamente sovraregolati in condizioni differenti, che è prezioso per fenotipi meno ben caratterizzati. Invece di mappatura regioni promotrici precise per ogni gene di interesse, di solito è sufficiente utilizzare la sequenza di 200-500 bp a monte del gene come il promotore. La lunghezza esatta sequenza dipende dal contesto genomico: regioni corte vengono utilizzate quando necessario per evitare comprese le regioni codificanti monte dalla vicina open reading frame. Loci Neutro e l&#39;integrazione Come mantenere il costrutto giornalista nel vostro ceppo batterico diventa la domanda finale nella progettazione di una fluorescente ceppo trascrizionale giornalista. Nei batteri, i geni di interesse sono spesso mantenutesu plasmidi che utilizzano la selezione antibiotica. Tuttavia, potrebbe non essere possibile usare antibiotici durante coculture senza uccidere i microbi ambientali. Se plasmidi sono stabilmente mantenuti nelle specie batteriche, potrebbe essere possibile crescere i vostri batteri che contiene un plasmide reporter-borne in presenza di antibiotici per preparare il giornalista per lo screening, e quindi eliminare gli antibiotici durante la co-coltura stessa, nella speranza che il plasmide sarà essere mantenuto sufficientemente per consentire fluorescenza. Tuttavia, se i plasmidi possono essere facilmente perse nel batterio, o si perdono in condizioni di stress, questo non sarà una valida opzione. In molti casi, la soluzione migliore sarà l&#39;integrazione del costrutto giornalista sul cromosoma batterico, che permette il mantenimento stabile del reporter anche in assenza di selezione. Affinché l&#39;integrazione per non disturbare la normale espressione o il regolamento del gene di interesse, si consiglia di integrare in un sito ectopica sul cromosoma che can agire come un &quot;locus neutrale&quot;. In B. subtilis questi siti integrazione sono geni che - se mutati - trasmettere un fenotipo in alcuni media minima (permettendo integrants di identificare senza selezione antibiotico), ma non modificare i tassi di crescita o sporulazione in rich media, e includere tali geni come amyE, Laca, THRC, pyrD, gltA, e SACA (trasmettere la capacità di utilizzare l&#39;amido, β-galattosidi, treonina, uracile, glutammato, e saccarosio, rispettivamente) 11-13. Mentre l&#39;integrazione in questi geni sono stati utilizzati in modo affidabile per molti anni a B. subtilis (in particolare a amyE e Laca), la conoscenza simile potrebbe non essere disponibile per i geni in molte altre specie batteriche. L&#39;uso di siti di attaccamento fagi sono ottime alternative per siti di integrazione cromosomiche neutri: molte specie-specifico 14-16, così come i siti generali di integrazione, come il sito di attacco TN7 (att TN7) hannostate identificate e utilizzate per inserimenti gene in molte specie batteriche 17,18. Microbi ambientali Usiamo suolo come fonte diretta di microbi ambientali per il nostro schermo co-coltura. Il terreno contiene una grande diversità di microbi, e molti di questi organismi sono ricca fonte di prodotti naturali. Utilizzando sospensioni liquide di terreno collocati direttamente sulle piastre con il nostro fluorescente ceppo giornalista trascrizionale (senza isolare batteri dal suolo), si semplificare notevolmente l&#39;approccio sperimentale. Il terreno può essere utilizzata immediatamente dopo la raccolta, o essere congelato a -80 ° C per un uso futuro. Uso immediato ha il vantaggio che una maggiore diversità di microbi possono potenzialmente essere coltivate, compresi quelli che non sopravviverà congelamento bene. Esso ha lo svantaggio che la concentrazione degli organismi del terreno coltivabili da questi campioni è sconosciuto, aumentando il numero di piastre di schermo che deve essere utilizzato. Deluso ayed ha il vantaggio che i cfu / ml per ciascuna sorgente suolo possono essere determinati in anticipo, consentendo un numero ottimizzato di colonie di essere coltivate su ciascuna piastra schermo. Tuttavia, esso richiede che gli organismi del suolo siano in grado di sopravvivere congelamento. Si noti che la diversificazione della piscina induttore in fase di esame (cioè le fonti del suolo) sembra essere più efficace a individuare nuove interazioni interspecie dello screening approfondito sullo stesso terreno: maggiore diversità filogenetica è stato osservato nei risultati individuati nel nostro schermo a matrice induzione Fonti del suolo supplementari sono stati esaminati, piuttosto che di screening le stesse fonti suolo più a fondo (EA Tibia e R. Kolter, Harvard Medical School, risultati non pubblicati). Panoramica L&#39;approccio che descriviamo qui è semplice in termini di requisiti tecnici. Si tratta di: 1) costruire una trascrizionale reporter fluorescente in B. subtilis o unaltre specie batteriche di interesse, 2) le condizioni di questo giornalista non è attivato di identificazione, 3) preparazione di aliquote di questo ceppo giornalista e organismi che saranno proiettati (nel nostro caso del suolo, ma altre fonti potrebbero essere utilizzati al posto), 4) mescolando questi due gruppi di microbi su supporti solidi, 5) individuare e isolare putativo inducendo organismi e 6), a conferma che questi organismi effettivamente attivano questo fenotipo in uno schermo secondario. Una volta identificati, questi organismi e dei loro metaboliti ci forniscono gli strumenti chimici per modulare il comportamento dei batteri, per studiare la fisiologia dei batteri e delle interazioni microbiche, e di agire come potenzialmente nuovi ponteggi per i composti terapeutici futuri.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth, Lennox</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80017-484</td>
			<td>Alternative media sources may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 3 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26396-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tips, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59060-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

In natura, i batteri esistono raramente in isolamento, sono invece circondati da una gamma diversificata di altri microrganismi che alterano l&#39;ambiente locale secernendo metaboliti. Questi metaboliti hanno il potenziale di modulare la fisiologia e la differenziazione dei loro vicini microbiche e sono probabilmente fattori importanti per la creazione e il mantenimento di comunità microbiche complesse. Abbiamo sviluppato uno schermo coculture basato sulla fluorescenza per identificare tali interazioni microbiche mediate chimicamente. La schermata richiede la combinazione di un trascrizionale ceppo reporter fluorescente con i microbi ambientali su supporti solidi e permettendo le colonie di crescere in co-coltura. Il reporter trascrizionale fluorescente è progettato in modo che il ceppo batterico scelta fluorescente quando si esprime un particolare fenotipo di interesse (cioè la formazione di biofilm, sporulazione, la produzione di fattore di virulenza, ecc.) Lo screening viene effettuata in condizioni di crescita where questo fenotipo non è espressa (e quindi il ceppo giornalista è tipicamente non fluorescente). Quando un microbo ambientale secerne un metabolita che attiva questo fenotipo, si diffonde attraverso la agar e attiva il costrutto reporter fluorescente. Questo permette al inducendo--metabolita produzione microbo da rilevare: sono le colonie non fluorescente più prossimali alle colonie fluorescenti. Così, questa schermata permette l&#39;identificazione di microbi ambientali che producono metaboliti diffusibili che attivano una particolare risposta fisiologica in un ceppo giornalista. Questa pubblicazione illustra come: a) selezionare adeguate condizioni di co-coltura di screening, b) preparare il giornalista e microbi ambientali per lo screening, c) eseguire lo schermo co-coltura, d) isolare putativo indurre gli organismi, ed e) confermano la loro attività in uno schermo secondario. Abbiamo sviluppato questo metodo per schermare per gli organismi del suolo che attivano biofilm matrice-produzione in Bacillus subtilis </em&gt;, ma abbiamo anche discutere le considerazioni per l&#39;applicazione di questo approccio ad altri batteri geneticamente trattabili.

Questo schermo è stato utilizzato per identificare organismi del suolo secernono sostanze che alterano la fisiologia di B. subtilis. I risultati qui descritti concentrano sul tipo di cellula matrice produttrici di B. subtilis, che produce la proteina e esopolisaccaride che sono necessari per la formazione di biofilm robusta in questo batterio. Abbiamo scelto il promotore dell&#39;operone Tapa-sipW-ATAS per il nostro costrutto reporter fluorescente (P tapa-YFP). Questo oper...

Watch this Scientific Journal Video about Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions at JoVE.com

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

I batteri producono composti secreti che hanno il potenziale per influenzare la fisiologia dei loro vicini microbiche. Qui si descrive una schermata co-coltura che permette la rilevazione di tali interspecie interazioni mediate chimicamente mescolando microbi del suolo con fluorescenti ceppi giornalista trascrizionali di Bacillus subtilis su supporti solidi.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill.  I batteri producono composti secreti che hanno il potenziale per influenzare la fisiologia dei loro vicini microbiche. Qui si descrive una schermata co-coltura che permette la rilevazione di tali interspecie interazioni mediate chimicamente mescolando microbi del suolo con fluorescenti ceppi giornalista trascrizionali di Bacillus subtilis su supporti solidi. 

Video: Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidica Co-coltura di cellule epiteliali e batteri per le indagini solubile del segnale mediato da Interazioni

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Ricerca

Biologia

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di GFP-

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using scanning transmission electron microscopy (STEM). Cells of the mammalian breast cancer cell line SKBR3 were grown on silicon microchips with silicon nitride (SiN) windows. Cells were chemically fixed, and HER2 proteins were labeled with quantum dot nanoparticles (QDs), using a two-step biotin-streptavidin binding protocol. The cells were coated with multilayer graphene to maintain a hydrated state, and to protect them from electron beam damage during STEM. To examine the stability of the samples under electron beam irradiation, a dose series experiment was performed. Graphene-coated and non-coated samples were compared. Beam induced damage, in the form of bright artifacts, appeared for some non-coated samples at increased electron dose D, while no artifacts appeared on coated samples.

Presented here is a protocol for labeling membrane proteins in mammalian cells and coating the sample with graphene for liquid-phase scanning transmission electron microscopy. The stability of the samples against the damage caused by radiation can also studied with this protocol.

Involucro di grafene di cellule di mammiferi fissate chimicamente per la microscopia elettronica a fase liquida

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Bioinformatics Resources for the Study of Glycan-Mediated Protein Interactions

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In particular, it aims at highlighting interactions between glycoproteins (such as cell surface receptors) and carbohydrate-binding proteins mediated by glycans. Here, major resources of the collection are introduced through two illustrative examples centered on the N-glycome of the human Prostate Specific Antigen (PSA) and the O-glycome of human serum proteins. Through different database queries and with the help of visualization tools, this article shows how to explore and compare content in a continuum to gather and correlate otherwise scattered pieces of information. Collected data are destined to feed more elaborate scenarios of glycan function. Glycoinformatics introduced here is, therefore, proposed as a means to either strengthen, shape, or refute assumptions on the specificity of a protein glycome in a given context.

This protocol illustrates how to explore, compare, and interpret human protein glycomes with online resources.

Risorse bioinformatiche per lo studio delle interazioni proteiche glicano-mediate

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In ...