MS e YZ sono supportati da KCL e KCL-Cina borse di dottorato. MO è stato finanziato da una Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council PhD borsa di studio. Ringraziamo Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki per il plasmide PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti per preziosi consigli su elettroporazione.

Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali. 1. Postnatale elettroporazione 1.1. Preparazione di vetro Capillari, Soluzione DNA e Elettroporatore <ol><li> Preparare capillari tirato vetro (OD: 1,5 millimetri, ID: 0,86 millimetri) per l&#39;iniezione di DNA. (Impostazioni indicativi per una capillare estrattore Sutter P-97 sono: Heat 283; Tirare 50; Velocity 90; ora 50). Fare un segno sul capillare corrispondente ad un volume di circa 2 ml. </li><li> Impostare la tensione del elettroporatore a 5 impulsi quadrati, 50 msec / impulso a 100 V, con intervalli di 850 msec (100 V, impulso ON 50 msec, impulso OFF 850 ​​msec, impulsi 5). </li><li> Diluire elevata purezza (OD 260/280&gt; 1,80) privo di endotossine DNA plasmidico ad una concentrazione finale di 1-2 mg / mLcon endotossine liberare tampone Tris-EDTA o PBS. Si consiglia di aggiungere 0,1% Verde veloce per la soluzione di DNA (il colorante si diffonda nel ventricolo quando iniettato con successo). </li><li> Preparare gli elettrodi 5-7 mm, il gel dell&#39;elettrodo e riscaldare il rilievo di riscaldamento. </li></ol> 1.2. Elettroporazione <ol><li> Rimuovere un postnatale giorno 2 del mouse cuccioli da gabbia e anestetizzare che per inalazione isoflurano (in un flusso di ~ 0,6 L / min). </li><li> Dopo circa 1 min, determinare lo stato di anestesia utilizzata la risposta piede pinch. Se si verifica nessun movimento, procedere con l&#39;iniezione intraventricolare. </li><li> Caricare ago capillare con 1-2 ml di DNA utilizzando un tubo aspiratore collegato al capillare. </li><li> Sotto una sorgente di luce fredda, tenere la testa del cucciolo tra il pollice e l&#39;indice della mano meno dominante. Leggermente tirare indietro la pelle sulla testa per aiutare l&#39;identificazione del punto di iniezione di destra. </li><li> Si consideri una linea virtuale tra l&#39;occhio e tegli craniometrico punto di riferimento lambda (Figura 1A). Inserire l&#39;ago capillare a circa un terzo della lunghezza di questa linea dalla lambda (circa 1 mm dal punto centrale linea 15). Inserire il capillare circa 2 mm di profondità, avendo cura di evitare la penetrazione in profondità nel cervello. </li><li> Iniettare plasmide soffiando lentamente attraverso la bocca (una siringa collegata al capillare può anche essere utilizzato). Durante questa procedura, assicurarsi che le dita non stanno applicando troppa pressione sul cervello, in quanto questo può impedire iniezione plasmide successo. </li><li> Arrestare iniezione quando una quantità minima di soluzione di DNA viene lasciato nel capillare. E &#39;opportuno iniettare meno di 1 ml per evitare deleterio aumento della pressione intracranica. </li><li> Coat entrambi gli elettrodi con gel e posizionarle con il lato positivo sul lato laterale dell&#39;emisfero in cui il DNA è stato iniettato (Figura 1A). Per l&#39;incorporazione nel DNA rostrale SVZ, posto gli elettrodi leggermente rostrale alpunto di iniezione. Variando la posizione degli elettrodi può raggiungere specificità regionale di elettroporazione in diverse aree del SVZ 22,25. </li><li> Avviare il trasferimento corrente premendo il pedale del pedale a impulsi. Quando l&#39;elettroporazione è completa, controllare la tensione sul display elettroporatore (valori di tensione non deve essere inferiore a 90 V, in quanto i valori di tensione più bassa correlazione con scarsa efficienza elettroporazione). </li><li> Rianimare il cucciolo sotto ossigeno a rilievo di riscaldamento per un paio di minuti e tornare alla gabbia, mettendo lontano dalla madre. Assicurarsi che la madre recupera il cucciolo e si riunisce con il resto della cucciolata. Dopo l&#39;elettroporazione, lasciare i cuccioli con la madre per 4-7 giorni prima di passo successivo. </li></ol> 2. Preparazione delle Culture acuta del cervello Slice 2.1. Preparazione di soluzioni e strumenti <ol><li> Le seguenti soluzioni sono richiesti (è anche possibile utilizzare DMEM ad alto glucosio per dissezione e l&#39;imaging17): Dissection Medium (500 ml) Supporti Balanced Gey - 500ml 45% di glucosio - 5ml Movie Medio (10 ml) 45% di glucosio - 0,110 ml HEPES 1 M - 0.100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutammina - 0.200 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (fenolo libero-rosso) - 8,89 ml </li><li> Warm up medio di film a 37 ° C. </li><li> Posizionare Millicell inserisce in un piatto di coltura inferiore 35 millimetri di vetro contenente 1 ml di terreno di film e posto in un incubatore umidificato a 37 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Preparare vibratome accessori (cacciavite, camera, lame di rasoio, colla). </li><li> Preparare strumenti di dissezione: forbici, spatola, pinze diritte. </li><li> Preparare gli strumenti per la gestione fette: piccolo pennello morbido o un&#39;ansa da inoculo (dimensioni: 10 ml), pipette Pasteur di plastica, un contenitore di ghiaccio e vari piatti di plastica 6 centimetri. </li><li> Preraffreddare il mezzo dissezionea 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Preparazione del cervello fette <ol><li> Riempire un piatto di 6 centimetri con mezzo dissezione preraffreddata e posizionarlo sul ghiaccio (per mantenere fette appena tagliate). </li><li> A seguito di dislocazione cervicale, usare le forbici per decapitare il cucciolo mouse. Rimuovere il cuoio capelluto con un bisturi, tagliare il cranio, lungo la sutura sagittale dalla OB al cervelletto e rimuovere delicatamente i lembi cranici con pinze. Assicurarsi che l&#39;intero cervello è esposto e con attenzione sezionare fuori con una spatola, facendo particolare attenzione a non danneggiare il tessuto. La dissezione deve essere fatto con attenzione, ma allo stesso tempo molto velocemente (meno di un minuto, se possibile). Dislocazione cervicale è il nostro metodo preferito perché anestesia terminali con anestetici farmaci / gas possono influenzare le proprietà migratorie dei neuroblasti e lo stato di salute del cervello fetta culture, che devono essere ripreso in tempi relativamente brevi seguente sacrificio di animali. </li><li> Hemisect il cervello con un razo lama (Figura 2). Eliminare emisfero non iniettato o utilizzare per altri esperimenti. </li><li> Posizionare un pezzo di nastro sul supporto vibratome e utilizzare la quantità minima necessaria di colla per attaccare l&#39;emisfero cerebrale su di esso (Figura 2). Questo impedisce danneggiamento della superficie titolare causa di colla applicazioni ripetute. </li><li> Lasciate asciugare la colla per alcuni secondi. </li><li> Collocare supporto nel vassoio vibratome riempito con una soluzione di dissezione preraffreddata. Puntare il bulbo olfattivo verso la lama (Figura 2). </li><li> Iniziare a tagliare l&#39;emisfero cerebrale utilizzando le impostazioni appropriate. I seguenti parametri sono raccomandati: spessore di strato di 300 micron; velocità ~ 3-5; frequenza ~ 9. Alta frequenza e bassa velocità sono raccomandati per prevenire danni alla fetta. </li><li> Raccogliere le fette con un piccolo pennello o un un&#39;ansa da inoculo morbido. Tenere le fette solo con OB visibile (solitamente 2-3 fette / cervello). In genere, la fetta che contiene la maggior parte delle RMS can disponibile sul ~ 300 micron dalla superficie inferiore. </li><li> Controllare le fette sotto un microscopio a fluorescenza standard per il segnale GFP (avendo cura di capovolgere su di loro per controllare la fluorescenza su entrambi i lati), e scegliere quelle che mostrano fluorescenza lungo la maggior parte delle RMS. </li></ol> 2.3. Coltura Fette cervello <ol><li> In una cappa di coltura cellulare, tagliare via il terzo più caudale della fetta cervello e rimuovere eventuali tracce di colla con una pinzetta diritte sottili o un bisturi microdissezione. </li><li> Delicatamente aspirare la fetta con una pipetta Pasteur di plastica (tagliata la punta della pipetta per creare un&#39;apertura più grande, questo eviterà di danneggiare la fetta) e collocarlo al centro di un Millicell preriscaldata inserto. </li><li> Assicurarsi che il lato con il segnale fluorescente luminosa viene posta in contatto con il Millicell inserto (per l&#39;imaging con un microscopio invertito). </li><li> Rimuovere la soluzione dissezione eccesso sulla sommità dell&#39;inserto con una pipetta. </li><li> Lasciare culture fetta distabilirsi in un C 5% CO 2 incubatore 37 ° / per almeno per 1 ora prima di imaging. </li></ol> 3. Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti <ol><li> Almeno 2 ore prima di imaging, accendere il sistema Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocale filatura, invertito microscopio Nikon Ti-E, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) raffreddato CCD digitale, e il sistema di riscaldamento (Solent Scientific) impostato in costante temperatura di 37 ° C. </li><li> Aprire il modulo di acquisizione software Volocity e fare clic sul pulsante &quot;Viz&quot; e selezionare il laser (s) per l&#39;imaging. </li><li> Entro 2 ore di cervello preparazione fetta, mettere il piatto fondo di vetro contenente la fetta cervello nella camera di imaging sul palco microscopio. </li><li> Utilizzare un obiettivo Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 sotto la luce fluorescente appropriato per selezionare e mettere a fuoco l&#39;area della sezione che verrà ripreso (ad esempio, la prima parte discendente della RMS subito dopo il sito di iniezione, o l&#39;Elbow regione RMS, o subito dopo il gomito prima di neuroblasti entrare nel OB). </li><li> Impostare il time-lapse imaging con le seguenti azioni: <ol><li> Al microscopio, fare clic sul pulsante L100 per consentire la scansione laser del campione. </li><li> In Volocity, aprire la ULTRAVIEW Laser Changer selezionando il laser appropriato (ad esempio 488 nm laser per GFP). </li><li> Impostare il tempo di esposizione (di solito tra 100-500 msec) e l&#39;intensità del laser (di solito 20-30%) a seconda dell&#39;intensità del segnale fluorescente. </li><li> Regolare l&#39;immagine guadagno digitale per migliorare la visualizzazione delle cellule. </li><li> Selezionare l&#39;intervallo di z-stack per l&#39;immagine all&#39;interno della fetta cervello (di solito nel corso di un intervallo di 100-120 micron). Scegliere un intervallo con un adeguato numero di cellule isolate per evitare possibili sovrapposizioni il più possibile (questo faciliterà la successiva analisi di inseguimento). </li><li> Selezionare la spaziatura tra ogni immagine z-stack (di solito 2-4 micron). </li><li> Scegliere il tempo di interval tra ogni cattura z-stack (ad esempio 3 min) e la durata totale di imaging (ad esempio 3 ore). </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Salva&quot; per salvare le modifiche ai parametri di imaging. </li><li> Premere il pulsante di registrazione per iniziare imaging. </li></ol></li><li> Immagini alternate di campioni di controllo e sperimentali (per esempio veicolo / trattamento farmacologico o diversi plasmidi elettroporate) durante lo stesso giorno. </li></ol> 4. Analizzando neuroblasti migrazione <ol><li> Nel modulo Volocity Quantitation, aprire la libreria desiderata creato dopo aver completato un esperimento di time-lapse. Selezionare &quot;Focus avanzata&quot; dalla casella in alto a sinistra (Figura 4A, punto 1). </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;di misure&quot; per visualizzare la finestra di misura (Figura 4A, punto 2). </li><li> Un elenco di attività è visibile in basso a sinistra dello schermo. Trascinare &quot;Track&quot; (presente nella sezione &quot;Varie&quot; voce in fondol&#39;elenco) nello spazio sopra. Questo richiederà l&#39;apertura di una nuova finestra chiamata &quot;Track&quot; nella parte superiore sinistra della schermata (Figura 4A, punto 3). </li><li> Selezionare &quot;Punti&quot; dal tab &quot;Input&quot; nella finestra Track (Figura 4A, punto 4). </li><li> Fai clic sullo strumento Point (4A, punto 5). </li><li> Iniziare a monitorare la migrazione di neuroblasti cliccando con il mouse sulla zona centrale del corpo cellulare e tenere traccia il movimento delle cellule fino all&#39;ultimo punto ora del time-lapse viene raggiunta (ad esempio il punto numero 61 per un film di 3 ore lungo) . </li><li> Per ottenere dati scegliete &quot;Make Voce di misura&quot; dal menu Misure (Figura 4B, punti 6-7). Apparirà una finestra al centro dello schermo. </li><li> In questa finestra, selezionare &quot;Un nuovo elemento di misura denominata:&quot; e digitare un nome (Figura 4C, punto 8). Ricordate di selezionare l&#39;opzione &quot;tutti i momenti&quot; prima pressing OK (Figura 4C, punto 9). Un file oggetto di misurazione apparirà sotto il time-lapse e conterrà i parametri di analisi quantitativa (ad esempio la distanza di migrazione, velocità, spostamento e velocità di spostamento). </li><li> Fare doppio clic sul file elemento di misurazione per aprirlo come una finestra (Figura 4D, punto 10). </li><li> Per visualizzare le singole tracce di cellule analizzate, scegliere &quot;cingolati Point&quot; dalle opzioni del &quot;Display&quot; (Figura 4D, passo 11). </li><li> Fare clic destro sul file Misura Item ed esportarlo come file di testo, che può essere importato in programmi come Excel per analizzare i parametri di migrazione. </li><li> Per misurare movimenti tra fotogrammi consecutivi e pause effettuate da ciascun cellulare durante il periodo di riprese, nel file di misura Item selezionare tra le opzioni &quot;Display&quot;, &quot;Point&quot; o &quot;popolazioni&quot; e clicca su ID (ogni brano ha un ID univoco). Esportare il file risultante da procederezione come spiegato al punto 4.10. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain.">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Migrazione efficiente di progenitori neurali lungo le RMS garantisce la loro successiva maturazione in neuroni funzionali 10. Flussi importanti di progenitori neurali diretti verso l&#39;OB sono visibili nella prima infanzia umana e possono svolgere un ruolo importante nei primi mesi del postnatale sviluppo del cervello umano 27. Inoltre, queste cellule sono in grado di siti del cervello colpite da lesioni e neurodegenerazione 4,28 bersaglio. Essere in grado di monitorare in tempo reale ...

Nel cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica dopo la nascita principalmente in due regioni, la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare nel giro dentato dell&#39;ippocampo 1. Notevole prove raccolte negli ultimi anni sostiene un ruolo fondamentale per la neurogenesi postnatale in funzioni di memoria lampadina ippocampo e olfattive 1-3. È importante sottolineare che la neurogenesi postnatale detiene anche potenziale terapeutico a causa della sua relazione con malattie neurologiche degenerative, e la capacità di neuroblasti di migrare verso siti danneggiati nel cervello 4-6. La zona subventricolare (SVZ) ha recentemente emerso come una nicchia neurogena cruciale. Neuroblasti SVZ-derivati ​​migrano verso il bulbo olfattivo (OB) attraverso il flusso migratorio rostrale (RMS), rendendo questo il processo di migrazione più lunga del 1,7,8 cervello postnatale. Il / RMS / sistema OB mammiferi SVZ è diventato unmodello utile per studiare varie fasi neurogenesi, quali la proliferazione, migrazione e differenziazione 1,8. Molti fattori di crescita e segnali extracellulari regolano la neurogenesi SVZ e la migrazione lungo le RMS, ma i meccanismi molecolari intracellulari sono ben lungi dall&#39;essere pienamente compreso 1,9. La corretta migrazione lungo le RMS è di fondamentale importanza per la successiva maturazione dei neuroni neonati 10. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che neuroblasts SVZ-derivate possono uscire dalle RMS a siti lesioni cerebrali 4-6,11-13. Così, indagando la migrazione neuroblasti meccanismi di segnalazione di regolazione è fondamentale non solo per capire neurogenesi, ma anche per le potenziali applicazioni terapeutiche. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per etichettare progenitori neurali SVZ da elettroporazione in vivo postnatale e monitorare la loro migrazione lungo le RMS culture acuti fetta cervello usando time-lapse confocale disco rotante microscopy. L&#39;elettroporazione è ampiamente usato in studi sullo sviluppo embrionale da a stadi adulti 14-18. Si tratta di un potente strumento per indirizzare e manipolare progenitori neurali SVZ e rappresenta un&#39;alternativa più economica e molto più veloce di iniezione stereotassica di vettori virali o generazione di modelli transgenici 1,15,19,20. Si tratta di una procedura relativamente semplice che non richiede l&#39;intervento chirurgico e ha alti tassi di sopravvivenza. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprimono plasmidi in modelli genetici di topo che impiegano il sistema loxP può essere utilizzato per indirizzare i geni di interesse o per ottenere l&#39;etichettatura permanente dei progenitori SVZ, rappresentando così uno strumento utile per gli studi di neurogenesi adulta 21,22. Imaging RMS migrazione neuroblasti nel cervello intatto è ancora difficile a causa di limitazioni tecniche. Tuttavia, questo processo può essere monitorato tramite disco confocale spinning time-lapse microscopia di fette di cervello acuto, che forniscono un adeguato system molto simili alla condizione in vivo anche suscettibili di manipolazione farmacologica 23,24. Accoppiamento elettroporazione in vivo postnatale con time-lapse imaging faciliterà la comprensione dei meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppo di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

La zona subventricolare (SVZ) è uno dei principali nicchie neurogenici nel cervello postnatale. Qui, progenitori neurali proliferano e danno luogo a neuroblasti in grado di muoversi lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB). È necessaria Questa migrazione a lunga distanza per la successiva maturazione dei nuovi neuroni nel OB, ma i meccanismi molecolari che regolano questo processo sono ancora poco chiare. Indagare le vie di segnalazione che controllano la motilità neuroblast può aiutare non solo a capire un passo fondamentale nella neurogenesi, ma hanno anche terapeutico potenziale rigenerativo, data la capacità di questi neuroblasti per indirizzare siti cerebrali colpite da lesioni, ictus, o la degenerazione. In questo manoscritto si descrive un protocollo dettagliato per l&#39;elettroporazione in vivo postnatale e conseguente time-lapse imaging della migrazione neuroblasti nelle RMS del mouse. Elettroporazione postnatale può efficacemente transfect SVZ progenitorecellule, che a loro volta generano neuroblasti migrano lungo le RMS. Utilizzando la microscopia confocale spinning disk time-lapse sulle culture acuti fetta cervello, la migrazione neuroblasti può essere monitorato in un ambiente molto simili alla condizione in vivo. Inoltre, neuroblast motilità possono essere monitorati e analizzati quantitativamente. Come esempio, si descrive come utilizzare in vivo postnatale elettroporazione di un plasmide GFP che esprimono per etichettare e visualizzare neuroblasti migrano lungo le RMS. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprime plasmidi in topi knockout condizionali che impiegano il sistema loxP può anche essere utilizzato per geni di interesse bersaglio. Manipolazione farmacologica di culture acute fetta cervello può essere eseguita per studiare il ruolo di molecole di segnalazione diverse nella migrazione neuroblasti. Accoppiando in elettroporazione in vivo con time-lapse imaging, speriamo di comprendere i meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppozione di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.

Etichettatura dei neuroblasti migratori SVZ-derivati ​​può essere osservato lungo le RMS, di solito 4-8 giorni dopo il elettroporazione di successo (Figura 1B). Punti di tempo più lunghi possono anche essere scelti, ma meno cellule si trovano nelle RMS poiché la maggior parte di loro sono entrati nel OB. Neuroblasti cominciare ad acquisire tipica morfologia e le caratteristiche di cellule granulari mature nella OB intorno 2-3 settimane dopo l&#39;elettroporazione (non mostrato). Dopo coltura per ...

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In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l&#39;etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l&#39;analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K Views.  King's College London.  Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video. 

Video: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

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Neuroscienze

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...