Questo lavoro è stato finanziato da una Wellcome Trust progetto di sovvenzione assegnato al PD e GL (089236/Z/09/Z). SG stato supportato da una Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council PhD borsa di studio. Ringraziamo Matthieu Vermeren per il gentile dono del vettore shRNA e Jennifer Shieh per preziosi consigli su neuroblasti nucleofection.

Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali. 1. Dissezione e dissociazione di Rat RMS neuroblasti <ol><li> Preparare le soluzioni necessarie per RMS dissezione e la dissociazione: </li></ol> Medio Dissection (100 ml) Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) - 98.5 ml 5 M HEPES pH 7,4-0,5 ml Penicillina-streptomicina (10.000 unità / ml e 10.000 mg / ml) - 1 ml Medio dissociazione (2 ml) HBSS - 1.760 ml 10x tripsina (2,5%) - 200 ml DNAse1 (1 mg / ml) - 40 microlitri Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% Fetal Calf Serum (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS - 4 ml Terreno completo (12 ml) Medie Neurobasal - 11,46 ml Supplemento B27 - 250 microlitri L-glutammina (200 mm) - 125 microlitri Glucosio (45%) - 165 microlitri 2. Filtro-sterilizzare l&#39;% FCS DMEM + 10 e il mezzo completo e preequilibrate in un C / 5% CO 2 incubatore 37 °. <ol><li> Dissezione <ol><li> Sacrifica un ratto cucciolata P6-P7 (circa 12 cuccioli) per dislocazione cervicale e decapitare con le forbici. </li><li> Fare un&#39;incisione antero-posteriore in pelle lungo la sutura sagittale dal naso al cervelletto con una lama da bisturi. Sbucciare la pelle fuori e ripetere la stessa incisione lungo il cranio. </li><li> Rimuovere delicatamente i lembi cranici con una pinza e rimuovere con attenzione il cervello con una spatola, avendo cura di includere i bulbi olfattivi. </li><li> Tagliare il terzo più caudale del cervello e scartarla. </li><li> Tritare the tessuto cerebrale in 1,4 millimetri di spessore fette coronali con un chopper tessuto. </li><li> Mettere le fette in piatti contenenti medio dissezione a freddo e separare con cura utilizzando un ago. </li><li> Il RMS appare come triangolare, zona traslucida nel centro di sezioni OB e come una piccola area circolare in più sezioni cerebrali caudale. Tagliare i RMS su ogni fetta con un coltello microchirurgico, avendo cura di evitare compreso il tessuto circostante. In P7 cuccioli di ratto, di solito i ~ 8 fette più rostrale (compresi OB) contengono RMS. </li><li> Raccogliere i frammenti RMS con una pipetta Pasteur di plastica e metterli in un piccolo piatto contenente il mezzo di dissezione a freddo sul ghiaccio. </li><li> Quando la dissezione è completa, trasferire i frammenti RMS in una provetta da 15 ml con una pipetta di plastica. Lasciare frammenti di stabilirsi sul fondo della provetta. </li></ol></li><li> Dissociazione <ol><li> Sostituire il mezzo dissezione con 2 ml di terreno dissociazione. </li><li> Triturare i frammenti RMS delicatamente pipetting la sospensione frammento su e giù circa 10x con una pipetta P1000. </li><li> Lasciare il tubo con i frammenti di tessuto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 2 min. </li><li> Pipettare la soluzione nuovamente 10x e garantire che i frammenti si sono dissociati (la sospensione dovrebbe diventare torbida). </li><li> Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 433 xg per 5 min. </li><li> Nel un&#39;aliquota frattempo la quantità necessaria di siRNA / DNA in provette Eppendorf (di solito 3-5 mg DNA / shRNA o 5-9 mg oligo siRNA per nucleofection, tuttavia la quantità di DNA / siRNA può richiedere ottimizzazione). </li><li> Rimuovere eccesso di terreno e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente in 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS. </li><li> Eseguire un conteggio delle cellule. Aspettatevi ~ 1 x 10 6 cellule per piccoli dei ratti cervello. Un minimo di 2,5 x 10 6 cellule sono necessari per ogni nucleofection, mentrerisultati ottimali si ottengono con 3-4 x 10 6 cellule per nucleofection. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 433 xg per 5 min. Assicurarsi di rimuovere quanto più mezzo possibile. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol><li> Subito risospendere il pellet cellulare in ratto (o il mouse se usando cellule di topo) soluzione nucleofection neurone precedentemente incubate a temperatura ambiente. Utilizzare 100 ml per nucleofection. Nota: in genere una cucciolata di 12 cuccioli di ratto è sufficiente per eseguire 4 nucleofections e una cucciolata mouse (12 cuccioli) è sufficiente per eseguire 2 nucleofections. </li><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare a ciascuna provetta Eppendorf contenente siRNA / DNA e mescolare delicatamente 2-3x pipettando con una pipetta P200. </li><li> Aggiungere il campione (sospensione cell-DNA/siRNA) al fondo della nucleofectioncuvette, avendo cura di evitare bolle. </li><li> Nucleofect utilizzando il programma G-013 (per le cellule di ratto) o O-005 (percellule di topo). Un nucleofection richiede circa 5 sec. </li><li> Aggiungere rapidamente 1 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS al campione nucleofected. </li><li> Ripetere i punti 2.4 e 2.5 per tutti gli altri campioni. Nota: per ottenere risultati ottimali, l&#39;intera procedura nucleofection non dovrebbe durare più di 5 minuti. </li><li> Trasferire ciascun campione in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS con la pipetta di plastica fornita dal kit nucleofection. Evitare il trasferimento delle eventuali detriti cellulari al tubo. </li><li> Centrifugare i campioni a 433 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere con cautela tutta eccesso di terreno e risospendere il pellet in 25-30 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS con una pipetta P20. Non usare più di 30 ml di mezzo. </li><li> Pipettare sospensione come una goccia sul lato interno di un coperchio piatto p35. </li><li> Invertire il coperchio sopra il piatto p35 contenente 2 ml di mezzo completo (vedi anche figura 1). </li><li> Lasciare in incubatrice (37 ° C / 5% di CO 2) peralmeno 5 ore e fino a 7 ore. Tempo di incubazione più lungo consente una migliore riaggregazione di gruppi di cellule. </li><li> Trasferire le gocce che pendono dal coperchio in terreno completo nel piatto con una pipetta P1000 con una punta tagliata. </li><li> Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 24 ore per nucleofections DNA e 48 ore per nucleofections siRNA / shRNA. </li></ol> 3. Incorporare <ol><li> Preparare mezzo completo (25 ml) e preequilibrate è a 37 ° C / 5% di CO 2 per alcune ore. </li><li> Estrarre le aliquote congelate di matrice membrana basale da -80 ° C freezer e scongelare sul ghiaccio in camera fredda. </li><li> Per ogni Nucleofection preparare un piatto di 6 centimetri che contiene fino a otto 13 millimetri coverlips sterili. </li><li> Porre le capsule in una scatola di ghiaccio coperto con pellicola trasparente. E &#39;importante mantenere i coprioggetti fresco per prevenire solidificazione matrice durante la procedura di incorporamento. </li><li> Per mantenere l&#39;umidità, mettere una striscia di tessuto umido in un piatto di 15 centimetri che will essere utilizzato per contenere fino a tre piatti 6 centimetri contenenti i neuroblasti incorporati. </li><li> Aggiungere mezzo completo alla matrice scongelato in un rapporto 1:3. Ad esempio, miscelare 40 ml di terreno completo con 120 ml di matrice pipettando. Questa quantità di matrice è sufficiente per l&#39;incorporamento aggregati su otto coprioggetto 12 mm. </li><li> Trasferire i gruppi di cellule reaggregated una provetta da 15 ml e centrifugare a 433 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere eccesso di terreno e risospendere il pellet in 10 ml di terreno completo. </li><li> Mettere 2 ml di cellule di sospensione aggregato su ogni vetrino sterile e aggiungere 18 ml di matrice / medio impasto completo. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere la matrice su tutta vetrino. </li><li> Porre immediatamente la capsula di 6 cm contenente i coprioggetti nel piatto 15 centimetri e lasciare in incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) per 15-20 minuti. Quando la matrice è solidificato, aggiungere delicatamente 5 ml di terreno completo per ogni sei centimetri assunzione piatto cura di spingeregiù qualsiasi vetrino galleggiante con una punta della pipetta. </li><li> Incubare per 24 ore a 37 ° C / 5% di CO 2 per far neuroblasti migrano degli aggregati cellulari. </li></ol> 4. 3D migrazione Assay <ol><li> Preparare le soluzioni necessarie per immunoistochimica. <ol><li> Preparare la soluzione del blocco: Soluzione blocco Capra (50 ml) Soluzione tampone fosfato (PBS) - 5 ml Siero di capra - 7,5 ml 10% Triton X-100 - 1,5 ml BSA - 50 mg H 2 O - 36 ml </li><li> Filtrare e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di fissaggio: Soluzione di fissaggio (100 ml) Paraformaldeide (PFA) - 4 g ATTENZIONE: maneggiare sempre PFA sotto una cappa Saccarosio - 20 g (opzionale) PBS fino a 100 ml </li><li> Su una piastra calda e sotto costante agitazione sciogliere il PFA in 80 ml di PBS mantenuta a 65 ° C. </li><li> Una volta che il PFA è sciolta, aggiungere 20 g di saccarosio. </li><li> Regolare il pH a7.4 (di solito con l&#39;aggiunta di 60 microlitri ~ 1 M NaOH per 100 ml di soluzione). </li><li> Portare a un volume totale di 100 ml con PBS. </li></ol></li><li> Immunostaining <ol><li> Mettere coprioggetto in una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Risciacquare coprioggetto con PBS 2x. </li><li> Fissare gli aggregati neuroblasti RMS con soluzione di fissaggio per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare coprioggetto con PBS 3x (5 min / lavaggio - su una piattaforma oscillante). </li><li> Bloccare per 30-60 min con la soluzione del blocco di capra. </li><li> Diluire gli anticorpi primari in soluzione blocco di capra e incubare una notte a 4 ° C. (Se lo si desidera, falloidina fluorescente (1:400) e colorante Hoechst (1:10.000) possono anche essere aggiunti alla soluzione di anticorpo primario per visualizzare actina filamentosa e nuclei). </li><li> Risciacquare coprioggetto con PBS 3x (5 min / lavaggio). </li><li> Diluire anticorpi secondari in soluzione blocco capra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare coverslips con PBS 3x (5 min / lavaggio) </li><li> Mount coprioggetto con mezzo di montaggio fluorescenti e lasciare asciugare per una notte a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Analisi di migrazione <ol><li> Cattura immagini di aggregati fissi neuroblasti RMS con un microscopio a fluorescenza con obiettivo 10X. Include una barra di scala un&#39;immagine campione in. </li><li> Per impostare la scala per quantificare, misurare la barra della scala nell&#39;immagine selezionando lo strumento &#39;Retta&#39; nella barra degli strumenti ImageJ. </li><li> Scegliere l&#39;opzione &#39;Analizza&#39; e cliccare su &#39;impostare la scala&#39;. </li><li> Nella finestra scala di impostare la &#39;distanza nota&#39; e spuntare la casella &#39;globale&#39; per mantenere le stesse impostazioni per tutte le misurazioni. </li><li> Utilizzare lo strumento &#39;linea segmentata&#39; sulla barra degli strumenti ImageJ per misurare la distanza dal bordo dell&#39;aggregato al lontano neuroblast migrato in 6 diversi settori in tutto l&#39;intero aggregato (Figura 3B). Considerare solo isolato aggregates per l&#39;analisi. </li><li> Calcolare una distanza media migrazione dai valori 6 ottenuti per ciascun aggregato. </li><li> Misura 10-20 aggregati per ciascuna condizione in ogni esperimento e piscina indipendenti risultati da un minimo di tre esperimenti indipendenti. Sempre includere un controllo nucleofection (ad es. GFP o un sh controllo / siRNA). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Mammalian+Brain:+Significant+Answers+and+Significant+Questions.">Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adult-born+neurons+facilitates+learning+and+and+memory.">Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory.</a> Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction?.">Is adult neurogenesis essential for olfaction?.</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li><li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke.">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li><li>Jin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain.">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).</li><li>Kim, Y., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+subventricular+zone+stem+cells+after+neuronal+injury.">Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury.</a> Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).</li><li>Massouh, M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-routing+neuronal+precursors+in+the+adult+brain+to+sites+of+injury:+Role+of+the+vasculature.">De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature.</a> Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).</li><li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis.">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li><li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Neuronal+Migration+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li><li>Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+migration+of+neuronal+precursors.">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li><li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Neuronal+Migration+Changes+the+Fate+of+Developing+Neurons+in+the+Postnatal+Olfactory+Bulb.">Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li><li>Battista, D., Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polysialic+Acid+Triggers+Dispersion+of+Subventricularly+Derived+Neuroblasts+into+Surrounding+CNS+Tissues.">Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues.</a> J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).</li><li>Conover, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Eph/ephrin+signaling+affects+migration+and+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone.">Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone.</a> Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).</li><li>Mobley, A. K., McCarty, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta+8+Integrin+is+Essential+for+Neuroblast+Migration+in+the+Rostral+Migratory+Stream.">beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream.</a> Glia. 59, 1579-1587 (2011).</li><li>Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+slits+in+the+control+of+cell+migration+in+the+rostral+migratory+stream.">Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).</li><li>Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor+regulates+migration+of+olfactory+interneuron+precursors+in+the+rostral+migratory+stream+through+Met-Grb2+coupling.">Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling.</a> J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).</li><li>Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+signaling+in+postnatal+neurogenesis:+The+first+leg.">Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg.</a> Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).</li><li>Dityateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+electroporation-based+gene+transfer+into+primary+dissociated+neurons.">Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons.</a> J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).</li><li>Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Regulates+Cell+Soma+Translocation+and+the+Distribution+of+Adhesion+Proteins+in+Migrating+Neurons.">Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons.</a> PloS One. 6, (2011).</li><li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons.">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e2373 (2011).</li><li>Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+primary+neurons.">Nucleofection of primary neurons.</a> Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).</li><li>Causeret, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p21-Activated+Kinase+Is+Required+for+Neuronal+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).</li><li>Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+knockdown+of+neuropilin-1+in+the+developing+chick+nervous+system+by+siRNA+hairpins+phenocopies+genetic+ablation+in+the+mouse.">Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse.</a> Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li><li>Ward, M., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+of+neuronal+migration+in+the+central+nervous+system.">Investigations of neuronal migration in the central nervous system.</a> Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Selection+for+High-Expression+Transfectants+with+a+Novel+Eukaryotic+Vector.">Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Acute+Slices+of+the+Adult+Mouse+Forebrain.">Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Vis. Exp. , e4061 (2012).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling.">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Vessels+Form+a+Migratory+Scaffold+in+the+Rostral+Migratory+Stream.">Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li><li>Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Postnatal+Electroporation+and+Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Mouse+Acute+Brain.">In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain.</a> J. Vis. Exp. , (2013).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation.">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La migrazione dei neuroblasti lungo le RMS per la posizione finale in OB è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano questo processo complesso sono ben lungi dall&#39;essere pienamente compreso. La procedura sperimentale qui descritto consente lo studio della migrazione neuroblasti in vitro. Abbiamo adattato un protocollo precedentemente pubblicato per isolare RMS neuroblasti dai primi di topo postnatale o ratto 25. Per ottenere risultati ottimali, è importante avere il passo dissezione, dal momento che è fondamentale per mantenere l&#39;intervallo di tempo tra la dissezione e nucleofection al minimo. Dopo nucleofection, neuroblasti possono essere reaggregated, incorporati in una matrice tridimensionale e lasciati a migrare su un periodo di 24 ore. In alternativa, per scopi diversi migrazione (ad esempio, immunofluorescenza e western blot), le cellule possono essere immediatamente placcato dopo nucleofection su polyornithine/laminin-coprioggetto rivestiti, dove sopravvivono fino a 4-5 giorni. Neuroblasti topo e nel ratto migrano in Matrigel in misura simile, tuttavia cellule di topo sembrano avere una maggiore tendenza a migrare nelle catene di cellule di ratto. A seconda dello scopo dello studio, neuroblasti possono essere nucleofected con differenti plasmidi codificanti proteine ​​fluorescenti o Tipo / mutante proteine ​​selvatiche di interesse. Per ottimali plasmidi di espressione proteica con un promotore CAG (β-actina promotore di CMV enhancer e-β globina poly-A coda) 26 sono altamente raccomandati. Inoltre, oligo siRNA o plasmidi shRNA possono essere nucleofected per atterramento target di interesse. Proteina efficace deplezione può essere visualizzato mediante immunofluorescenza o Western Blot (di solito lisi aggregati incorporati dal 1 ratto cuccioli con 50 ml di tampone di lisi standard). Nucleofection è un metodo relativamente semplice per transfettare neuroblasts primari, offre un&#39;alternativa più facile e veloce a viral trasfezione mediata da vettori, e può raggiungere alte (~ 70-80%) efficienza di trasfezione. E &#39;fondamentale lavorare velocemente durante la procedura nucleofection, dopo aver lasciato neuroblasti nella soluzione nucleofection per un tempo prolungato riduce drasticamente la vitalità cellulare. La resa media di cellule da RMS dissezione è relativamente basso per i topi P7 (~ 5 x 10 5 cellule / cervello) in confronto ai ratti P7 (~ 1 x 10 6 cellule / cervello) e sono richiesti almeno 3 x 10 6 cellule per nucleofection per raggiungere trasfezione con ~ 50% di efficienza. Inoltre, neuroblasti ratto sembrano resistere meglio Nucleofection rispetto ai neuroblasti del mouse. Pertanto, cuccioli precoce postnatale (P6-P7) ratto potrebbero rappresentare una comoda fonte neuroblast, anche considerando che l&#39;organizzazione di RMS ratti e topi sono molto similar 27 e che la portata di ratto e topo migrazione neuroblasti in vitro è paragonabile. Si consiglia di non tenere i grappoli reaggregated di neuroblasti nucleofected in sospensione per più di 48 ore per evitare effetti anomali sulla morfologia cellulare e la migrazione (le nostre osservazioni non pubblicate). Il test 3D qui descritto può essere usato per quantificare la migrazione neuroblasti in un punto di tempo fisso dopo inclusione in matrice (ad es. 24 hr). Aggregati di dimensioni diverse possono essere utilizzati nell&#39;analisi, poiché non vi è alcuna correlazione significativa tra la dimensione degli aggregati e distanza di migrazione (nostre osservazioni non pubblicate). Per visualizzare e ulteriormente approfondire le dinamiche della migrazione neuroblasti, time-lapse imaging può essere utilizzato. Si raccomanda di effettuare l&#39;analisi di migrazione all&#39;interno di un intervallo di 24 ore dopo l&#39;incorporamento, in quanto la velocità di neuroblasti sembra diminuire drasticamente a tempi più lunghi (nostre osservazioni non pubblicate). &lt;/ P&gt; Ci sono alcune limitazioni a questo protocollo. In primo luogo, nucleofection può finora essere utilizzato per i primi neuroblasts roditori postnatale, mentre l&#39;infezione con vettori virali rimane il metodo più efficiente per trasfezione neuroblasti adulti 28. In secondo luogo, la migrazione in vitro non riproduce completamente la complessa architettura delle RMS osservati in vivo. Infatti, anche se neuroblasti mantengono la capacità di migrare in modo simile alle loro controparti in vivo, nel setup sperimentale qui descritte non hanno interazioni con altri componenti di RMS come astrociti e vasi sanguigni, che contribuiscono anche a regolare la loro motilità 9,29, 30. Questo problema può essere affrontato in futuro ottimizzazione del tridimensionali sistemi modello di co-coltura. In conclusione, combinando nucleofection con un saggio di migrazione 3D rappresenta uno strumento prezioso per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla basemigrazione neuroblasti. Questa procedura sperimentale fornisce un metodo iniziale, veloce e relativamente semplice per valutare il ruolo dei regolatori candidati di migrazione neuroblasti, che possono essere ulteriormente convalidate da altri approcci come in vivo postnatale elettroporazione e time-lapse imaging di culture fetta cerebrali 28,31,32 .

Nel postnatale cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica per tutta la vita ed è limitato a due nicchie neurogenici: la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare del giro dentato dell&#39;ippocampo 1. Diversi studi recenti hanno dimostrato l&#39;importante ruolo della neurogenesi adulta nel facilitare i compiti di apprendimento e memoria 2,3. Inoltre, la prova di proliferazione e il reclutamento di progenitori neurali seguenti lesioni cerebrali 4-7 solleva la possibilità di attivazione farmacologica della neurogenesi nella riparazione neurale. Neurogenesi postnatale è strettamente regolamentato in tutte le sue fasi, che comprendono la proliferazione neurali progenitrici, la migrazione, la differenziazione, la sopravvivenza e l&#39;integrazione sinaptica finale dei neuroni appena nati 8. Progenitori neurali (neuroblasti) derivate da cellule staminali nel SVZ migrano a grande distanza attraverso la migratorio rostralestream (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB) dove maturano in neuroni funzionali 9. Neuroblasti migratori sono prevalentemente unipolare, con un corpo cellulare allungato estende un unico processo di primo piano. Queste cellule si muovono in catene in modo collettivo, scorrevoli l&#39;uno sull&#39;altro 10. La migrazione è un passo fondamentale per la successiva maturazione dei progenitori SVZ-derivati ​​in neuroni funzionali 11 ed è controllata da molteplici fattori e molecole di orientamento, tra cui: polysialylated neural molecola di adesione cellulare (PSA-NCAM) 12, ephrins 13, integrine 14, Slits 15, fattori di crescita e neurotrasmettitori 16 17, tuttavia i meccanismi molecolari alla base di questo processo non sono pienamente compresi. Indagare le vie di segnalazione intracellulare che regolano la migrazione neuroblasti non solo fornirà una migliore comprensione della neurogenesi adulta, ma contribuirà anche allo sviluppo della nuova terapeuticaapprocci per promuovere la riparazione del cervello. Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti in vitro utilizzando nucleofection e un saggio di migrazione 3D. Nucleofection è una tecnica di trasfezione cellulare basato su un metodo migliorato di elettroporazione. Cell-tipo di corrente elettrica specifica e la soluzione nucleofection consentire il trasferimento di macromolecole polianionici come il DNA e shRNA vettori e oligonucleotidi siRNA direttamente nel nucleo della cellula e licenza di trasfezione lentamente divisione o mitoticamente cellule inattive, come i neuroni embrionali di mammifero e 18. Questo metodo è veloce, relativamente facile da eseguire ei risultati in trasfezione altamente riproducibile di una vasta gamma di tipi di cellule inclusi neuroblasti primarie e neuroni 19-21. Dissociazione del tessuto RMS consente l&#39;isolamento di neuroblasti migratori, che può essere nucleofected successo con DNA / SHRVettori NA o oligo siRNA targeting per geni di interesse. Dopo nucleofection, neuroblasti sono reaggregated in appeso gocce e successivamente incorporate in una matrice tridimensionale Matrigel. Queste condizioni consentono di neuroblasti migrano degli aggregati cellulari riassumono la modalità di migrazione osservato in vivo, fornendo così un ottimo sistema modello per studiare vie di segnalazione coinvolte nella migrazione neuroblasti e di valutare l&#39;influenza dei trattamenti farmacologici sulla motilità di queste cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:255px;">14175129</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">HEPES</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>store 200 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">DNAse I Vial (D2)</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:255px;">LK003170</td>
			<td>&#8805;1,000 units per vial; store 50 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:339px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3007902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">D-(+)-Glucose solution (45%)</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free</td>
			<td style="width:339px;">BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>prepare 120 &#181;l aliquots at 4 &#176;C, then store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">PFA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">441242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Sucrose</td>
			<td style="width:339px;">BDH</td>
			<td style="width:255px;">102745C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Goat serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:339px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:255px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">BSA</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:255px;">BPE9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dako fluorescence mounting medium</td>
			<td style="width:339px;">Dako</td>
			<td style="width:255px;">S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Rat neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Mouse neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Microsurgical knife</td>
			<td style="width:339px;">Angiotech</td>
			<td style="width:255px;">7516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:339px;">The Mickle Laboratory Engineering Company</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Nucleofector II</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro

La zona subventricolare (SVZ) situata nella parete laterale dei ventricoli laterali gioca un ruolo fondamentale nella neurogenesi adulta. In questa zona ristretta del cervello, le cellule staminali neurali proliferano e costantemente generano neuroblasti che migrano tangenzialmente in catene lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) per raggiungere il bulbo olfattivo (OB). Una volta in OB, neuroblasti passare alla migrazione radiale e poi differenziarsi in neuroni maturi capaci di integrare nella rete neuronale preesistente. Migrazione corretta neuroblast è un passo fondamentale nella neurogenesi, garantendo la corretta maturazione funzionale dei neuroni neonati. Data la capacità di neuroblasti SVZ derivati ​​per indirizzare le aree lese del cervello, indagando i meccanismi intracellulari alla base della loro motilità non solo migliorare la comprensione della neurogenesi, ma può anche favorire lo sviluppo di strategie neurorigenerativo. Questo manoscritto descrive una dettagliataprotocollo per la trasfezione di roditore primaria RMS neuroblasti postnatale e l&#39;analisi della loro motilità con un 3D in vitro migrazione saggio di ricapitolare le loro modalità di migrazione osservato in vivo. Entrambi i ratti e topi neuroblasti possono essere rapidamente ed efficacemente trasfettate via nucleofection sia con DNA plasmidico, piccolo tornante (sh) RNA interferenti o corto (si) oligo RNA mira geni di interesse. Per analizzare la migrazione, le cellule nucleofected sono reaggregated in &quot;gocce appesi&quot; e successivamente incorporate in una matrice tridimensionale. Nucleofection di per sé non altera in modo significativo la migrazione dei neuroblasti. Il trattamento farmacologico dei neuroblasti nucleofected e reaggregated può essere eseguita anche per studiare il ruolo delle vie di segnalazione coinvolte nella migrazione neuroblasti.

Neuroblasti possono essere isolati con successo da Dissected tessuto RMS (Figura 1A) e incorporati in una matrice tridimensionale. Le cellule isolate sia da ratto o RMS postnatali mouse sono immunopositive per i marcatori neuroblasti migratori, come doublecortin (DCX), βIII tubulina o PSA-NCAM (Figure 1B-C). Neuroblasti dissociate possono essere efficacemente nucleofected con il DNA (ad es. Un plasmide GFP-codifica, Figura 2) o plasmidi shRNA (Figura 4) per ottenere la deplezione proteica, che può essere valutata mediante analisi western blot (Figura 4B) o immunofluorescenza (non mostrato) . Le cellule nucleofected con plasmidi-GFP codifica migrano radialmente cluster neuroblasti reaggregated (Figura 3a). Quantificazione di relativa migrato a distanza 24 ore dopo l&#39;incorporamento (Figura 3B) mostra alcuna differenza di migrazione tra GFP-posit<html> ive cellule e cellule, nonnucleofected GFP-negativi (Figura 3C), indicando che nucleofection di per sé non interrompe la migrazione. Non vi è inoltre alcuna differenza significativa nel grado di migrazione tra neuroblasti nucleofected e neuroblasti migrano direttamente su espianti RMS (dati non riportati). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Dissezione dei neuroblasti RMS. (A) Rappresentazione schematica di RMS neuroblasti dissezione. Per una descrizione dettagliata si rimanda al testo. (B) isolate le cellule di RMS ratto sono immunopositive per i produttori di neuroblasti migratori DCX e tubulina βlll. Bar, 20 micron. (C) Le cellule che migrano su topo RMS espianti esprimono la neuroblast migratorio marcatori DCX e PSA-NCAM. Bar, 20 micron.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Neuroblasti nucleofection Mouse. Dissociata del mouse RMS neuroblasti sono stati nucleofected con PMAX-GFP, reaggregated, incorporati in una matrice tridimensionale e permesso di emigrare per 6 ore. Neuroblasti migrano da un cluster di cellule reaggregated (in alto, foto, contrasto di fase) mostrano un&#39;elevata efficienza di trasfezione (basso, le foto del canale GFP). I pannelli della colonna di destra mostrano le immagini di ingrandimento più elevati corrispondenti alle inserti evidenziati nei pannelli della colonna di sinistra. Bar, 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:c<html> ONTENUTO-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 3. 3D test di migrazione. (A) neuroblasts ratto sono stati nucleofected con PMAX-GFP (GFP) o pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, incorporato in una matrice e lasciato a migrare per 24 ore. Le cellule sono state poi fissate e immunoistochimica per GFP (verde) e βIII tubulina (rosso). Bar, 50 pm. (B) Misurare distanza migrazione utilizzando ImageJ. Il cluster di cellule reaggregated è suddiviso in 6 settori uguali. La distanza tra il bordo del cluster (linea tratteggiata) e la più lontana cella migrato viene misurata per ciascun settore. (C) Quantificazione della distanza relativa migrato dalle cellule nucleofected, cellule nonnucleofected (GFP-positive) e di controllo (GFP-negativi) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 4&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 4. Monitoraggio migrazione neuroblasti dopo shRNA nucleofection. (A) neuroblasts ratto sono stati nucleofected con un shRNA vettore di controllo (PCA-b-EGFPm5 Silencer 3, che esprime anche EGFP 23) o lo stesso vettore contenente un shRNA mira fascin, an-actina bundling proteina 24. Le cellule sono state reaggregated oltre 48 ore, incorporati nella matrice e lasciato a migrare per 24 ore. Aggregati sono stati poi fissati e immunoistochimica per GFP (verde) e βIII tubulina (rosso). Bar, 50 pm. (B) fascina Efficace esaurimento può essere rilevato 50 ore dopo shRNA nucleofection da analisi western blot. Actina è mostrato come un controllo di carico (C) Analisi quantitativa di relativa distanza di migrazione mostrando che la deplezione fascina ostacola seriamente la migrazione neuroblasti. (Media ± SEM; ** p &lt;0.01, n = 3 esperimenti indipendenti). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro at JoVE.com

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Migrazione neuroblasti è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti impiegando DNA / piccolo tornante RNA (shRNA) nucleofection e un saggio di migrazione 3D con neuroblasti isolati dal flusso migratorio rostrale roditore postnatale.

Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

11.3K Views.  King's College London.  Migrazione neuroblasti è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti impiegando DNA / piccolo tornante RNA (shRNA) nucleofection e un saggio di migrazione 3D con neuroblasti isolati dal flusso migratorio rostrale roditore postnatale. 

Video: Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Ricerca

Neuroscienze

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogenesi

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Topo romboencefalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per studiare la migrazione Branchiomotor Neuron viso

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...