Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Istituto USDA Nazionale di alimentazione e l&#39;agricoltura, agricoltura e alimentazione Research Initiative concessione 2010-65.108 - 20582 a KMJ Ringraziamo Brian K. Washburn per la revisione critica del manoscritto.

Eseguito le fasi 1, 2, 4, e 6 in una cappa a flusso laminare sterile è raccomandato. 1. Preparazione di M. truncatula A17 Piantine Nota: M. truncatula A17 semi utilizzati in questi studi sono prodotti in condizioni di serra raffreddate a ~ 22 ° C, o in una stanza crescita delle piante mantenuta a 22-26 ° C con ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 luce. <ol><li> Versare in piastre germinazione dei semi: Usa 100 millimetri piatti quadrati (15 mm di profondità) e versare autoclavato 1,1-1,2% w / v di agar purificato 10 ad una profondità di 3-5 mm. Ogni piatto sarà utilizzato per germinare ~ 0,25-0,5 g di seme (equivalente a 63-125 semi / piastra). Nota: E &#39;fondamentale utilizzare impianti coltura cellulare testato, agar purificato per tutti i piatti descritti in questo protocollo. Il venditore e le informazioni il numero di catalogo per l&#39;agar è elencato nella tabella dei reagenti e attrezzature specifiche. </li><li> Scarify / sterilizzare l&#39;M. truncatula A17 semes: Pesare semi sufficienti per il numero desiderato di piantine. (M. truncatula A17 semi sono ~ 4 mg ciascuna) Luogo semi sterili 125 ml flaconi con le coperture foglio sterili (0,25-0,5 g di semi / boccetta, questo è ~ 63-125 semi) e pipetta 20 ml di concentrato (96%) H 2 SO 4 lungo le pareti del pallone. Nota: scarificazione Acid sterilizzare i semi. Inoltre, l&#39;acido pipettando lungo le pareti del pallone, esso ri-sterilizzare l&#39;interno del pallone che è venuto a contatto con i semi sterilizzati. </li><li> Break up ciuffi di sementi con una pipetta di vetro sterile. Agitare ogni boccetta di frequente per 10-12 min. Piccolo, pozzi marroni saranno visibili sui semi. Questi sono piccoli fori nel cappotto di seme 11. Nota: quando si lavora con H 2 SO 4 concentrato Indossare occhiali di protezione e guanti. </li><li> Rimuovere H 2 SO 4 e sciacquare i semi: quando almeno il 10% dei semi hanno piccoli pozzi marrone, o 12 min sono passati, a seconda di qualeviene in primo luogo, rimuovere tutti l&#39;acido dai palloni con una pipetta di vetro sterile. (Acido rifiuti posto in un beaker 1-2 L contenente almeno 300 ml di acqua di rubinetto. Ciò diluire l&#39;acido ed evitarne il surriscaldamento.) Inclinare il pallone per raccogliere l&#39;acido residuo in curva del pallone e utilizzare una piccola pipetta di vetro a eliminare tutto l&#39;acido residuo. Se l&#39;acido residua, che reagisce con l&#39;acqua di risciacquo, scaldare i semi e li uccidono. <ol><li> Risciacquare semi versando rapidamente 100 ml di acqua ultrapura sterile in ogni pallone. Il volume in eccesso di acqua diluire l&#39;acido e prevenire il surriscaldamento e sementi danni durante la reazione dell&#39;acido con l&#39;acqua. Versare l&#39;acqua e fiamma sterilizzare il labbro del pallone. </li><li> Sciacquare i semi 8-10x con 50 ml di acqua ultrapura sterile. Agitare il pallone durante ogni lavaggio. Il pallone deve essere considerato sterile a questo punto e il labbro del pallone deve essere fiammato prima di ogni risciacquo. </li></ol></li><li> Lasciate che i semi assorbono durante la notte: dopo laultimo risciacquo, versare 50 ml di acqua ultrapura sterile in ogni pallone, sostituire la pellicola di copertura sterile su ogni pallone e posto a 4 ° C al buio durante la notte. </li><li> Luogo semi su piastra germinazione: Dopo semi di locazione assorbono durante la notte, versare l&#39;acqua, sciacquare con 2x ~ 25 ml di acqua ultrapura, quindi aggiungere 20 ml di acqua ultrapura sterile, turbinio per risospendere semi e versare su una piastra di agar germinazione 1,1-1,2% da punto 1.1. Se semi rimangono nel pallone, aggiungere più acqua e versare di nuovo. Distribuire i semi da ogni pallone a una piastra (63-125 semi / piastra). <ol><li> Agitare la piastra per distribuire i semi. I semi devono essere distribuiti in modo uniforme in una banda di 4-5 cm ad una estremità della piastra. Questo sarà il &quot;top&quot; della piastra. Il &quot;fondo&quot; 5-6 cm dovrebbe essere mantenuto privo di semi (Figura 2A). </li><li> Aspirare l&#39;acqua con una pipetta sterile. La piastra a 45 ° per far colare l&#39;acqua rimasta al fondo della piastra. Riposizionare il coperchio sul tilPiastra ted e proteggere dalla luce. Piatti dovrebbe essere consentito di drenare 10-20 min. (Figura 2B). </li></ol></li><li> Montato germinazione: Rimuovere tutta l&#39;acqua che si è raccolto nella parte inferiore della piastra inclinata con una pipetta sterile. <ol><li> Riposizionare il coperchio e sigillare il piatto con parafilm. Indossare guanti e mantenere sterile (Figura 2C). </li><li> Stack le piastre di germinazione e poi girare tutti loro fino ad un angolo di 90 °. I semi vengono stesi sulla superficie verticale della agar. Semi completamente imbibiti dovrebbe facilmente aderire al agar. Le radici cresceranno verso il basso (Figura 2D). </li><li> Avvolgere la pila di lastre di germinazione in fogli di bloccare la luce e mantenerlo a 25 ° C per 3 giorni. </li></ol></li></ol> Nota: Se il provento di germinazione per meno di 3 giorni, le radici possono essere troppo breve per raggiungere l&#39;agar-agar in microcosmi. Se la germinazione procede più di 4 giorni prima del trasferimento a piastre microcosmo, la sopravvivenza delle piantine sarannoessere poveri. Se M. ecotipi truncatula o mutanti con tassi di germinazione più lenti devono essere confrontati, l&#39;ecotipo lentamente germinazione dovrebbe essere consentito di germinare più di 3 giorni. 2. Preparazione dei singoli Microcosmi Piatto <ol><li> Preparare medio 12 (cfr. tabella 1 per la composizione), consentendo ~ 70 ml di mezzo di Jensen per ogni microcosmo. Preparare in brocche o bottiglie che sono convenienti per un rapido versamento (non più di 1-2 litri per ogni lanciatore) e lasciare un ancoretta magnetica nella brocca durante la sterilizzazione in autoclave. <ol><li> Dopo medio è raffreddato a ~ 55-65 ° C, sono stati aggiunti integratori, e il pH è stato controllato (cfr. tabella 1), versare nella rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piatti fondi. Le lastre devono essere versati ~ 0,9-1 cm di profondità (~ 70 ml / piastra). </li><li> Componenti di mezzo di Jensen possono formare un precipitato nuvoloso, quindi è importante per restituire il lanciatore alla piastra magnetica mescolare periodicamente per evitare che i componenti di stabilirsi fuori. Precipitati possono essere vispatibile nel piatto dopo che solidificano, e non influisce sulle prestazioni, purché siano equamente distribuiti tra i piatti. </li><li> Impilare piastre durante il getto per evitare la formazione di condensa sui coperchi piastra. </li></ol></li><li> Dopo piastre di Jensen solidifica, tacca entrambe le piastre e coperchi con una spatola di pesatura che è stato piegato a U 5 (Figura 3A). Riscaldare la curva della spatola con un bruciatore fino al rosso caldo, tacca 5-6 piatti e poi riscaldare di nuovo. Quando il coperchio dentellato è collocata sulla piastra dentata, questo creerà un portale ovale attraverso il quale la ripresa della piantina crescerà (Figura 3B). Se le piastre dentellate devono essere conservati, avvolgere singolarmente con film paraffina .. </li></ol> 3. Preparazione di Sinorhizobium meliloti Culture Due giorni prima inoculazioni di piante, iniziare culture di tutto S. meliloti ceppi essere inoculate sulle piantine. Culres dovrebbero essere coltivate in LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medio 13 supplementato con 2.5 MgSO mm 4, 2,5 mM CaCl 2, e antibiotici appropriati (TY medio funziona anche bene). Appena 2-3 ml di ogni cultura saranno sufficienti. <ol><li> Coltivare a 30 ° C con agitazione per 2 giorni fino a quando le cellule sono densi. </li><li> Per la maggior parte inoculazioni vegetali, la fase di crescita del S. meliloti non è critica. Di solito, in ritardo log o sono utilizzate cellule in fase stazionaria precoce. </li></ol> 4. Posa su M. truncatula Piantine sui singoli Microcosmi <ol><li> Dopo 3 giorni, aprire un piatto di germinazione (preparato nella fase 1) e inondare immediatamente con acqua ultrapura sterile. Dip pinza in etanolo e brevemente fiamma per sterilizzare. Utilizzare pinze sterili per spingere delicatamente le punte delle radici di tutte le piantine sotto l&#39;acqua per evitare l&#39;essiccazione. Radici spazieranno 2-6 cm di lunghezza. La maggioranza sarà 3-4 cm. Selezionare piantine con radici diritte e non evidentedifetti. </li><li> Controllare i coperchi dei microcosmi medie del Jensen per la formazione di condensa. Flick il coperchio per rimuovere la condensa o sostituirlo con un nuovo coperchio dentellato. Se vi è un eccesso di condensa sul coperchio, la radice piantina può aderire al coperchio e poi muoiono dopo la condensazione asciuga. </li><li> Utilizzando le pinze, prendere delicatamente una piantina dalla piastra germinazione dai cotiledoni e laici la radice su mezzo il microcosmo di un Jensen. Assicurarsi che la punta della radice è in contatto con l&#39;agar. </li><li> Rimuovere delicatamente il cappotto di seme se è ancora presente. I cappotti di seme dovrebbero essere sciolti dopo ammollo in acqua per 5-10 min. Stuzzicare delicatamente il cappotto di seme con la pinza fino a quando non cede, e scartare. I cotiledoni e circa 0,5 cm di ripresa devono sporgere fuori dalla U-tacca nella piastra (Figura 4A). Ricollocare accuratamente il coperchio della piastra con l&#39;U-tacca del coperchio sopra la piantina, creando un portale per la piantina (Figura 4B).Set piastre da parte in pile orizzontali fino a quando tutti piantine sono stati immessi sul microcosmi. </li><li> Utilizzare tutte le piantine da ogni piatto germinazione quello sguardo vitale e hanno una radice diritta. (Se possibile, lasciare un piatto di piantine non aperti da utilizzare in sostituzione di piantine avvizzite poco prima inoculazione.) </li><li> Dopo aver posato tutte piantine, permettere loro di sedersi sul microcosmi orizzontale di Jensen, mentre la S. sospensioni di inoculo meliloti sono in preparazione. </li></ol> 5. Preparazione di S. meliloti inoculo Sospensioni <ol><li> Controllare S. meliloti culture periodicamente dopo l&#39;inoculazione per essere sicuri che stanno crescendo. Dopo 2 giorni di crescita, il diametro esterno 600 deve essere compresa tra 2 e 4. </li><li> Pipettare 0,5 ml di ogni cultura in una sterile provetta da 1,5 ml e centrifugare a pellet. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare le cellule due volte in entrambi 0,85% di acqua sterile di NaCl sterile o ultrapura. Risospendere le cellule in 0,5 ml 0,85% sterile NaCl o acqua ultrapura. </li><li> Misurare il diametro esterno 600 di una diluizione 1/10 di risospeso S. meliloti culture dal punto 5.3. Sulla base di questa lettura, fare una sospensione di ogni cultura in acqua ultrapura sterile a OD 600 = 0,05. Se la densità cellulare è troppo alta, nodulation può essere inibito. Fare abbastanza della sospensione diluita in modo che 100 ml possono essere inoculati su ogni piantina. La nuvolosità della OD 600 = 0.05 sospensione deve essere appena percettibile ad occhio. </li></ol> 6. Inoculazione e tenuta di Microcosmi <ol><li> Immediatamente prima di vaccinazioni iniziano, verificare la presenza di piantine avvizzite che non sono sopravvissuti al trasferimento di microcosmi medie del Jensen. Sostituire quelle piantine con piantine fresche da lastre di germinazione. </li><li> Aprire ogni microcosmo e inoculare 100 ml di adeguata S. meliloti sospensione sulla radice piantina. Riposizionare il coperchio e mettere da parte in stac orizzontaleks di 6-10 microcosmi. Per ogni S. ceppo meliloti da confrontare, inoculare almeno 15 piante. Per i ceppi che presentano sottili differenze di produttività simbiotico, inoculare 30-35 piante. Lasciare almeno 10 piante non inoculate come controllo negativo. Inoculare 30-35 piante con S. meliloti 1021 o altra appropriata ceppo selvatico per servire come controllo positivo. </li><li> Dopo la S. sospensione meliloti ha avuto il tempo di assorbire sulla superficie della radice e il liquido di sospensione ha inzuppato nel agar (almeno 20 min.), avvolgere ogni piatto singolarmente con film paraffina. Piastre devono essere avvolti fino al confine della tacca, ma il film paraffina non devono bloccare la crescita della piantina (Figura 4C). </li><li> Al momento del confezionamento, eseguire un controllo finale per radici attaccate alla parte interna del coperchio piastra. Per rimuovere le radici attaccate dal coperchio, porre la lastra piana in panchina e toccare o sfogliare il coperchio a bussare alla radice indietro sulla agar surface. </li><li> Allineare i portali piantine di ciascuna pila di 6-10 piatti. Posare lo stack ad un angolo di 90 ° con le piantine punta verso l&#39;alto (Figura 4D). La vischiosità del film paraffina terrà le piastre in luogo abbastanza a lungo per avvolgere l&#39;intero stack in un foglio, lasciando una striscia di 1-2 cm scartato dove le piantine emergono (Figura 4E). La pellicola protegge le radici dalla luce. </li><li> Inserire la pellicola avvolta stack in una camera di crescita illuminata o camera di crescita a 21-25 ° C, 60-70% di umidità relativa e 100-175 mmol / m -2 s -1 luce su un ciclo di buio 16 ore di luce / 8 ore ( Figura 1A). In queste condizioni di crescita, incubazione prolungato a livelli di luce maggiore di 200 pmol / m -2 s -1 può avere un effetto negativo sulla crescita delle piante. </li></ol> 7. Esame di Root Sistemi e quantitativa di simbiotiche fenotipi Le piante possono essere mantenuti inmicrocosmi fino a 9 settimane. <ol><li> Numero nodulo può essere quantificata in una serie di punti di sempre da scartare il foglio di ogni risma e contando noduli. Lo sviluppo di noduli sulle piante inoculate con S. meliloti 1021 tipo selvatico sono evidenti da 10-14 giorni dopo l&#39;inoculazione. </li><li> Produttività simbiotico può anche essere misurata ad ogni tempo misurando la lunghezza delle riprese emergente. </li><li> Quantificazione finale della produttività simbiotico viene di solito eseguita a 7 settimane dopo l&#39;inoculazione staccando il tiro e la misurazione del peso fresco del germoglio. Questa operazione può essere eseguita più tardi nove settimane se la crescita è più desiderato. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi passaggi del protocollo che sono fondamentali per il successo: 1) La necessità di usare purificato, pianta coltura cellulare testato agar non può essere sottovalutata. Questo non è critica per piantine di erba medica, ma è fondamentale per la crescita di M. truncatula A17. 2) E &#39;importante germinare piantine su piastre di agar verticali come descritto nella Fase 1. La tecnica ampiamente usata di germinazione piantine su una superficie orizzontale rovesciato in un piatto fondo 15 millimet...

L&#39;interazione tra la pianta ospite legume Medicago truncatula A17 e il batterio rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 è uno dei sistemi modello più trattabili per lo studio di radice sviluppo nodulo e azotofissatrice simbiosi. I genomi di entrambi i partner simbiotici sono stati sequenziati 1,2 e vegetali e batteri sono suscettibili di manipolazione genetica 3,4. Analisi dei fenotipi di vegetali e mutanti batterici richiede la capacità di osservare le fasi di sviluppo del nodulo e per quantificare la produttività simbiotico nel tempo. Qui si descrive un metodo per l&#39;osservazione dello sviluppo radicale nodulo di M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculati con S. meliloti 1021 all&#39;interno dei singoli microcosmi fatti dallo standard, rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piastre di laboratorio profondi (Figura 1A). La ripresa viene esposto e cresce attraverso un portale dentata sul lato della piastra (Figures 1B, 1C e 1E). Radici sono contenuti all&#39;interno dei microcosmi e mantenuti sterili, mentre permette l&#39;osservazione attraverso il coperchio della piastra (Figura 1D). Poiché il tiro è accessibile, la sua crescita non è vincolato e può essere misurata ad intervalli periodici senza compromettere la sterilità della radice. Il metodo di creazione di microcosmi dentellato-targa è stato originariamente sviluppato da Leigh, et ​​al. 5 per la coltivazione di piante di erba medica, ma non è stato largamente adottato a dispetto dei suoi numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi. Una variante di questo metodo è stato sviluppato anche per l&#39;analisi dell&#39;interazione tra le radici delle piante e micorrize 6. Abbiamo ora adattato e ottimizzato questo metodo per la crescita di M. piante truncatula. I vantaggi di questo protocollo oltre più comunemente utilizzati metodi sono descritti di seguito. Ci sono diversi metodi che sono attualmente in uso largo per gli studi nodulazione di M. truncatula inoculolata con S. meliloti 7. Il metodo più comunemente usato per la preparazione su larga scala di radici nodulated è la crescita in cassoni aeroponic 7. In questo metodo, le piante sono sospese su una grande nave e radici sono aerati con una miscela di S. meliloti e soluzione nutritiva 7. Questo metodo è pratico se solo un genotipo di S. meliloti è da testare. Poiché richiede aerosol di elevate concentrazioni di batteri, c&#39;è un&#39;alta probabilità di contaminazione incrociata tra cassoni inoculati con differenti ceppi batterici. Un altro metodo che viene spesso utilizzato per preparare grandi quantità di piante inoculate è la crescita in tini o in vasi di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata che sono infuso con soluzione nutritiva e inoculato con S. meliloti 7. Questo metodo richiede l&#39;utilizzo di vasche aperte o in vasi, e richiede irrigazione e la ricarica della soluzione nutritiva. Un altro svantaggio di pentole è che le piantedeve essere rimosso da questa matrice di particolato per l&#39;esame delle radici e noduli. Un altro inconveniente di questo metodo è che una vasta area di spazio incubatore è necessaria quando molti differenti S. genotipi meliloti devono essere confrontati, perché una pentola a parte deve essere utilizzato per ogni genotipo batterico. Il &quot;vaso Leonard&quot; è una variante di questo metodo di 8,9. Un vaso Leonard è composto di due vasi sterilizzati impilati uno sopra l&#39;altro e collegati da uno stoppino. Terreno di coltura viene inserito nel recipiente inferiore ed aspirata attraverso lo stoppino per capillarità in una matrice di crescita di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata nel recipiente superiore. La piantina (s) sono posti nella matrice crescita e inoculato con S. meliloti. Questo metodo non richiede irrigazione, ma l&#39;esame delle radici e noduli richiede che la piantina essere rimosso dalla matrice crescita particolato. Ci sono diversi metodi che consentono un facile esame della roots. Uno di questi è il transparent &quot;sacchetto di crescita&quot; plastica 7. Uno svantaggio di questo metodo è che l&#39;irrigazione frequente è necessaria poiché solo ≤ 10 ml di terreno liquido è ottimale per la crescita di M. truncatula in sacchetti 7. Esperimenti Pouch sono di solito limitati a ~ 2 settimane 7, grazie alla ripartizione dello stoppino di carta all&#39;interno del sacchetto. Altri due metodi comunemente utilizzati sono simili al nostro metodo dal fatto che le piante sono coltivate su agar e le radici sono visibili, ma questi metodi hanno anche svantaggi che la nostra procedura evita. In questi metodi, le piante sono completamente contenute all&#39;interno di 24,5 centimetri x 24,5 cm piastre di agar sigillate intorno alla parte superiore con del nastro adesivo chirurgico poroso o coltivate in tubi di agar-slant tappate con tappi di cotone o tappi di plastica 7. Entrambi questi metodi consentono un facile esame delle radici e può essere conservato sterile. Tuttavia, i tubi slant agar sono di solito coltivate con solo 20 ml di agar 7 e richiedono di acqua e nutrienti addition per la crescita a lungo termine delle piante. Le piante coltivate entro i 24,5 centimetri x 24,5 centimetri di agar microcosmi piastre hanno umidità e sostanze nutritive per la crescita a lungo termine sufficiente, ma il germoglio che cresce rapidamente diventa vincolati all&#39;interno del microcosmo piastra chiusa e il gas etilene possono accumularsi inibendo nodulazione 7. Nella procedura qui descritta, la ripresa è esposto e cresce liberamente al di fuori del microcosmo che contiene ~ 70 ml di mezzi di comunicazione, permettendo la crescita a lungo termine. La procedura descritta può essere utile non solo per lo studio di nodulation di piante leguminose, ma anche per lo studio dei fenotipi radici di altre piante di medie dimensioni. La differenza tra questi microcosmi e un tradizionale impianto policarbonato tessuto-cultura vaso è che radici nei microcosmi piastra qui descritti crescono sulla superficie verticale della agar piuttosto che verso il basso in uno strato orizzontale di agar al fondo del vaso. Questo permette la radice da sollevare dalla superficie agar con minima dAmage ai peli radicali e spessore ridotto agar alla superficie della radice, che facilita l&#39;esame dei peli radicali al microscopio.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agar purified, plant cell culture-tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single-plant, sterile microcosms for nodulation and growth of the legume plant medicago truncatula with the rhizobial symbiont sinorhizobium meliloti

Batteri rhizobial formano simbiotici, noduli azoto-fissatori sulle radici delle piante leguminose host compatibili. Uno dei sistemi modello più ben sviluppati per lo studio di queste interazioni è la pianta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 e la rhizobial batterio Sinorhizobium meliloti 1021. L&#39;imaging ripetuta delle radici delle piante e punteggio della fenotipi simbiotici richiede metodi che non sono distruttive per piante o batteri. I fenotipi simbiotici di alcuni impianti e mutanti batterici si manifestano dopo periodi relativamente brevi di crescita, e non necessitano di osservazione a lungo termine delle interazioni ospite / simbionte. Tuttavia, sottili differenze di efficienza e di nodulo senescenza fenotipi simbiotici che non sono evidenti nelle prime fasi del processo di nodulazione richiedono periodi di crescita relativamente lunghi prima di poter essere segnato. Diversi metodi sono stati sviluppati per la crescita a lungo termine e l&#39;osservazione di questa coppia host / simbionte.Tuttavia, molti di questi metodi richiedono annaffiature ripetuto, che aumenta la possibilità di contaminazione da parte di altri microbi. Altri metodi richiedono uno spazio relativamente grande per la crescita di un gran numero di piante. Il metodo qui descritto, la crescita simbiotica di M. truncatula / S. meliloti in sterili, microcosmi singolo impianto, ha diversi vantaggi. Piante in questi microcosmi sono l&#39;umidità e le sostanze nutrienti sufficienti a garantire che l&#39;irrigazione non è richiesto per un massimo di nove settimane, impedendo la contaminazione incrociata durante l&#39;irrigazione. Questo permette di fenotipi da quantificare che potrebbero essere mancati in sistemi di crescita a breve termine, come i ritardi sottili nello sviluppo del nodulo e all&#39;inizio nodulo senescenza. Inoltre, le radici e noduli nel microcosmo vengono visualizzati facilmente attraverso il coperchio piatto, quindi non è necessario fino radicazione delle piante per l&#39;osservazione.

La preparazione e inoculazione di questi microcosmi piatto è relativamente semplice rispetto alla maggior parte degli altri metodi descritti nell&#39;introduzione. L&#39;uso di questi microcosmi consente anche la crescita delle piante prolungata (fino a 9 settimane) senza annaffiature o supplementazione dei nutrienti, la manutenzione di radice di sterilità, sia semplice esame delle radici e la protezione di radici dalla luce, la crescita incontrollata di germogli di piante, di facile accesso per le riprese misura dell...

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Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Crescita delle piante truncatula Medicago in simbiosi con i batteri azoto-fissatori meliloti Sinorhizobium nei singoli, microcosmi sterili fatto da lastre di laboratorio standard consente l&#39;esame frequente dei sistemi di radici e noduli senza compromettere la sterilità. Le piante possono essere mantenuti in queste camere di crescita fino a 9 settimane.

Singola pianta, sterili Microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Con il rhizobial Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

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JoVE Journal

Environment

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

16.9K Views.  Florida State University.  Crescita delle piante truncatula Medicago in simbiosi con i batteri azoto-fissatori meliloti Sinorhizobium nei singoli, microcosmi sterili fatto da lastre di laboratorio standard consente l'esame frequente dei sistemi di radici e noduli senza compromettere la sterilità. Le piante possono essere mantenuti in queste camere di crescita fino a 9 settimane. 

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Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Ricerca

Ambiente

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Trascrizione e metabolita Profiling per la valutazione del Tabacco Albero e pioppo come materia prima per l&#39;industria con sede a Bio

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

L&#39;uso di ad alta risoluzione termografia a infrarossi (HRIT) per lo studio di ghiaccio nucleazione del ghiaccio e propagazione nelle piante

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Una nuova applicazione della penetrazione Elettrica Graph (EPG) per l&#39;acquisizione e la misurazione dei segnali elettrici in Floema Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Una tabella soffietto Thermogradient di controllo della temperatura del suolo per la valutazione di crescita delle piante e monitoraggio processi del suolo

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone as a cheap and readily available CO2 sorbent. While the technology has been widely studied, there are a few available options that could be applied to make it more economically viable. One of these is to increase the oxygen concentration in the calciner to reduce or eliminate the amount of recycled gas (CO2, H2O and impurities); therefore, decreasing or removing the energy necessary to heat the recycled gas stream. Moreover, there is a resulting increase in the energy input due to the change in the combustion intensity; this energy is used to enable the endothermic calcination reaction to occur in the absence of recycled flue gases. This paper presents the operation and first results of a CaL pilot plant with 100% oxygen combustion of natural gas in the calciner. The gas coming into the carbonator was a simulated flue gas from a coal-fired power plant or cement industry. Several limestone particle size distributions are also tested to further explore the effect of this parameter on the overall performance of this operating mode. The configuration of the reactor system, the operating procedures, and the results are described in detail in this paper. The reactor showed good hydrodynamic stability and stable CO2 capture, with capture efficiencies of up to 70% with a gas mixture simulating the flue gas of a coal-fired power plant.

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

This manuscript describes a procedure for operating a calcium looping pilot-plant for post-combustion carbon capture with high oxygen concentrations in the calciner in order to reduce or eliminate the flue gas recycle.

Funzionamento di una 25 KWth calcio loop-impianto pilota con elevate concentrazioni di ossigeno nel calcinatore

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

Procedure di fumigazione di laboratorio per il controllo dei parassiti con Gas di ossido di azoto

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

La prova di infezione di pianta: Spray e ferita-mediata di inoculazione con la pianta patogeno Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Un flessibile a basso costo sistema idroponico per valutare le risposte della pianta a piccole molecole in condizioni sterili

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

Un protocollo di Rhizobox ottimizzato per visualizzare la crescita delle radici e tempi di risposta alle sostanze nutrienti localizzate

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...