This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund&#8211;Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).

1. Manutenzione del ragnetto Popolazione NOTA: Acari sono allevati in California fagioli rossi (Phaseolus vulgaris). <ol><li> Coltivare piante di fagioli da semi per 2-3 settimane prima infestazione. </li><li> Intermix queste piante con piante infestate; acari adulti saranno ben presto colonizzare materiale vegetale fresco. </li><li> Rimuovere le vecchie piante di fagiolo infestate ogni 7-10 giorni, la loro sostituzione con piante fresche. </li></ol> 2. Raccolta Adult Female acari <ol><li> Acari Collection utilizzando il metodo di lavaggio <ol><li> Per raccogliere gli acari, posizionare un impianto di fagioli freschi in contatto con le piante infestate 1-2 giorni prima dell&#39;esperimento. </li><li> Utilizzare 20-30 piante di fagioli freschi di raccogliere 1.000 a 2.000 acari femmina adulta. </li><li> Preparare una soluzione di Tween 20 a 0,001% con acqua di rubinetto a temperatura ambiente. </li><li> Lavare piante di fagiolo infestate nella soluzione di Tween 20, utilizzando 2 a 3 piante alla volta. </li><li&gt; Ogni impianto viene lavato 2-3x per raccogliere tutti gli acari da foglie. </li><li> Passaggio Complete 2.1.4 entro 10 minuti per evitare la mortalità acaro. </li></ol></li><li> Isolamento di femmina adulta acari dalla filtrazione della sospensione Mite attraverso vagli di definito Mesh Size <ol><li> Preparare setacci delle seguenti dimensioni delle maglie: 500 micron (per rimuovere i detriti) e 300 micron (per raccogliere acari adulti di sesso femminile) (Figura 1A). </li><li> Filtrare la sospensione attraverso il setaccio micron 500. </li><li> ReFilter la sospensione attraverso il setaccio 300 micron. Saranno conservati per adulti acari femminili. </li><li> Immergere un setaccio di 300 micron con adulti acari femminili in acqua di rubinetto pulita per rimuovere il Tween 20. </li><li> Diffondere acari in un unico strato sul fondo dello staccio. </li><li> Utilizzare carta assorbente per togliere l&#39;acqua in eccesso dalla rete e sui lati del setaccio. NOTA: Ciò avviene perché gli acari hanno bisogno di asciugarsi rapidamente per recuperare. </li><li> Preparare un assieme come mostrato in Figura 1B; questo permetterà acari di muoversi liberamente, ma impedirà loro di fuggire. </li><li> Posizionare il setaccio da acari in cima al setaccio che viene utilizzato come supporto. </li><li> Surround setaccio fondo con acqua per evitare gli acari di disperdersi. NOTA: Gli acari si avvierà il recupero dopo circa 5 min. Dopo circa 30 minuti, il numero di acari movimento è sufficiente per avviare la raccolta (Figura 1D). Gli acari devono essere raccolti entro 1 ora, in quanto producono la seta che interferirà con la collezione. </li></ol></li></ol> 3. Infestazione Pianta con acari NOTA: Una volta che gli acari femmina adulti hanno recuperato, possono essere utilizzati per gli impianti infestazione. Ci sono due metodi utilizzati per infestare impianti sperimentali con gli acari femmina adulta: a) utilizzando un pennello sottile (sezione protocollo 3.1) e b) utilizzando una pompa o linea di vuoto (sezione protocollo 3.2). <ol><li> Mite infestazione utilizzando un pennello NOTA: Spider acaricon un pennello viene usato per l&#39;applicazione di un massimo di 30 acari per pianta. <ol><li> Utilizzare un capello morbido pennello arte round di dimensioni 00 o più fine. </li><li> Il pennello bagnato con acqua di rubinetto RT. </li><li> Prendere delicatamente acari dal setaccio con la punta del pennello e trasferirli alla pianta. </li></ol></li><li> Infestazione di acari utilizzando una pompa NOTA: infestazione delle piante da acari raccolti da una linea / pompa del vuoto viene utilizzato quando vengono applicati più di 30 acari. Per questo metodo, una pompa a vuoto per componenti microelettronici pickup o una linea di vuoto può essere utilizzato. È importante mantenere costante il flusso dell&#39;aria e sufficientemente resistente (2-4 psi). <ol><li> Attaccare una punta di pipetta 1 ml al tubo che si collega alla linea o pompa del vuoto utilizzando un taglio 1,5 ml provetta da centrifuga a fondo come un adattatore tra il tubo della pompa / del vuoto e la punta. </li><li> Posizionare un pezzo di carta assorbente tra la punta della pipetta e l&#39;adattatore (1,5 ml provetta). NOTA: lo scopo di questo è di acari intrappolare all&#39;interno tegli punta di pipetta durante il processo di aspirazione ed anche per ridurre il flusso d&#39;aria (Figura 1C). </li><li> Raccogliere acari direttamente dal setaccio usando la punta della pipetta. </li><li> In alternativa, raccogliere gli acari uno per uno da foglie infestate con uno stereoscopio. </li><li> Quando il numero di acari è stato raccolto, rimuovere la punta della pipetta dal tubo, facendo in modo che il pezzo di carta assorbente sul retro della punta della pipetta è stata toccata. </li><li> Raccogliere acari toccando la punta della pipetta e aggregazione gli acari insieme. Poi, metterli sulla foglia; in pochi secondi, gli acari inizieranno a disperdersi sulla foglia. </li></ol></li></ol> 4. Registrazione e valutazione del danno Flora <ol><li> Danni registrazione Flora NOTA: Per A. thaliana, danni pianta viene valutata dopo 4 giorni di alimentazione acaro. Il danno è registrata come la superficie totale di macchie clorotiche. Per la misurazione danni, l&#39;intero rosetta viene tagliato e scansione.Parametri di scansione descritti sono per uno scanner Epson V30, ma agirà come un buon punto di partenza per qualsiasi scanner piano simile. Mantenere parametri di scansione costanti per tutti gli esperimenti che permette il confronto tra singole corse esperimento. <ol><li> Coprire letto scanner con foglio trasparente per evitare di contaminare la superficie dello scanner con materiale vegetale. </li><li> Tagliare un intero rosone e posto sul piatto dello scanner in modo adaxial (superiore) lato delle foglie si trovano ad affrontare la sorgente luminosa scanner e elemento di cattura. In alternativa, se le rosette sono troppo densi per catturare singole foglie senza sovrapposizione, sezionare la rosetta in fogli singoli o gruppi di foglie non sovrapposte con le forbici sottili prima di mettere sul piatto dello scanner. Più rosette possono essere acquisiti simultaneamente. </li><li> Coprire rosette o foglie con un pezzo di carta bianco per evitare adesione e la contaminazione del coperchio dello scanner. </li><li> Chiudere il coperchio dello scanner ed eseguire una scansione con i seguenti parametri: Risoluzione: 1,200 dpi; Modo colore: Adobe RGB; Luminosità: +25; Tipo di file: JPEG massima qualità. </li><li> Salvare i file di immagine per la successiva analisi dei danni. </li></ol></li><li> Danni pianta Quantificazione NOTA: L&#39;area del danno è calcolato manualmente con Photoshop. A causa di notevoli differenze in forma di foglia e l&#39;intensità del colore dei sintomi a seguito dell&#39;alimentazione acari, metodi automatici erano inaffidabili. Così, un metodo griglia viene usata per valutare i danni pianta: <ol><li> Aprire l&#39;immagine della pianta con Photoshop. </li><li> Create un nuovo livello, poi sovrapporre un&#39;immagine digitalizzata con una griglia di 0,25 mm x 0,25 millimetri divisioni (View o Visualizza - Mostra - Grid, scorciatoia da tastiera Ctrl + &#39;). </li><li> Su uno strato sovrapposto, indicare le zone di foglie danneggiate utilizzando un punto (utilizzare la funzione &quot;Pencil Tool&quot;, scorciatoia da tastiera B). Utilizzare un singolo punto per ogni quadrato della griglia di sotto del quale vi è un danno concernente più metà dell&#39;unità griglia. La dimensione del punto è definito in pixel (cioè, </em&gt; 52 pixel per punto). </li><li> Quando tutte le caselle della griglia che mostrano i danni stabilimento che copre almeno la metà delle unità di rete sono contrassegnati con un punto, utilizzare lo strumento istogramma (Finestra - Istogramma) per determinare il numero totale di pixel del livello. Lo strumento istogramma consente di misurare il numero di pixel. Poiché ogni punto è rappresentato da un numero costante e nota di pixel, lo strumento istogramma misurerà il numero totale di pixel, che rappresenta il numero totale di punti, e, per estensione, il numero totale di caselle marcate. </li><li> Calcolare il numero di &quot;punti&quot; contrassegnate utilizzando la formula: Numero di punti = numero totale di pixel / numero di pixel per punto. </li><li> Calcolare l&#39;area totale dei danni moltiplicando il numero di punti marcati sul immagine dalla superficie di 1 quadrato della griglia, come un punto corrisponde ad un quadrato della griglia. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mites injurious to economic plants. , (1975).</li><li>Migeon, A., Dorkeld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Mites+Web:+a+comprehensive+database+for+the+Tetranychidae.">Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae.</a> http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).</li><li>Croft, B. A., Vandebaan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+and+Genetic-Factors+Influencing+Evolution+of+Pesticide+Resistance+in+Tetranychid+and+Phytoseiid+Mites.">Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites.</a> Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).</li><li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+heteroplasmy+and+the+evolution+of+insecticide+resistance:+Non-Mendelian+inheritance+in+action.">Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).</li><li>Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acaricide+resistance+mechanisms+in+the+two-spotted+spider+mite+Tetranychus+urticae+and+other+important+Acari:+A+review.">Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review.</a> Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).</li><li>Dermauw, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cys-loop+ligand-gated+ion+channel+gene+family+of+Tetranychus+urticae:+Implications+for+acaricide+toxicology+and+a+novel+mutation+associated+with+abamectin+resistance.">The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance.</a> Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).</li><li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+bulk+segregant+mapping+uncovers+resistance+mutations+and+the+mode+of+action+of+a+chitin+synthesis+inhibitor+in+arthropods.">Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).</li><li>Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+pair-rule+gene+homologues+in+a+chelicerate:+early+patterning+of+the+two-spotted+spider+mite+Tetranychus+urticae.">Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae.</a> Development. 129, 5461-5472 (2002).</li><li>Khila, A., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+the+spider+mite+Tetranychus+urticae:+dsRNA+and+siRNA+parental+silencing+of+the+Distal-less+gene.">Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene.</a> Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).</li><li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mity+model:+Tetranychus+urticae,+a+candidate+for+chelicerate+model+organism.">Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).</li><li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Tetranychus+urticae+reveals+herbivorous+pest+adaptations.">The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations.</a> Nature. 479, 487-492 (2011).</li><li>Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+quantitative+trait+loci+controlling+glucosinolates,+myrosinase+and+insect+resistance+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 161, 325-332 (2002).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+jasmonate+in+response+and+tolerance+of+Arabidopsis+to+thrip+feeding.">Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding.</a> Plant &amp; cell physiology. 49, 68-80 (2008).</li><li>Whiteman, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plant-herbivore+interface+with+a+leafmining+Drosophila+of+Arabidopsis.">Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis.</a> Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).</li><li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior.">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).</li><li>Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+indole+glucosinolate+breakdown+products+with+antifeedant+effects+on+Myzus+persicae+(green+peach+aphid).">Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid).</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).</li><li>Adio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+defensive+function+of+Ndelta-acetylornithine,+a+jasmonate-induced+Arabidopsis+metabolite.">Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite.</a> Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+homolog+of+CORONATINE-INSENSITIVE1+is+required+for+the+maternal+control+of+seed+maturation,+jasmonate-signaled+defense+responses,+and+glandular+trichome+development.">The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development.</a> Plant Cell. 16, 126-143 (2004).</li><li>Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+timing+of+spider+mite-induced+direct+and+indirect+defenses+in+tomato+plants.">Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants.</a> Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo video dimostra protocolli utilizzati per isolare e ad infestare le piante con un gran numero di acari adulti di sesso femminile. Anche se abbiamo presentato questo protocollo usando A. thaliana, può essere usato per qualsiasi sistema di interazione acaro pianta-ragno e viene attualmente applicato con successo anche su piante di pomodoro e vite (Vitis vinifera). I rendimenti protocollo risultati riproducibili, indicando che gli acari raccolti sono stato fisiologico paragonabile (Figura 3...

Interazione pianta-parassita è un argomento di grande importanza scientifica ed economica. È stato storicamente studiata utilizzando entrambe le piante coltivate (come pomodoro) e pianta modello, A. thaliana. In entrambi i casi, la suscettibilità della pianta erbivoro potrebbe essere misurata sia direttamente attraverso la valutazione degli impianti fenotipo dopo l&#39;attacco di erbivori o indirettamente attraverso la valutazione delle prestazioni dei parassiti. Misure dirette di pianta suscettibilità sono stati utilizzati precedentemente per un certo numero di specie di parassiti utilizzando una serie di metodi. Ad esempio, herbivory di larve di lepidotteri è misurato come una stima della porzione di tessuto vegetale consumata da uno Plutella xylostella (diamondback falena) o Trichoplusia ni (cavolo looper) ad occhio nudo con l&#39;aiuto di una griglia 12. Inoltre, ci sono metodi che utilizzano l&#39;imaging digitale di danni foglia con successiva analisi quantitativa delle immagini. Tali metodi sono stati usati instudi di A. interazione thaliana con Frankliniella occidentalis (tripidi fiore occidentali) 13, Scaptomyza flava (foglia-mining drosophila) 14, e T. ni 15. Misure indirette di piante suscettibilità sono ampiamente utilizzati negli studi di interazione pianta-parassita. Ad esempio, suscettibilità di A. thaliana Peach afide Myzus persicae erbivori in genere viene valutata attraverso l&#39;analisi dei parassiti fecondità e la descrizione della morfologia lorda di un impianto dopo l&#39;interazione 16,17. Un altro tipico indicatore indiretto di A. thaliana suscettibilità a un parassita è una valutazione del peso secco o umido del erbivoro. Questo parametro è comunemente utilizzato per caratterizzare erbivori di lepidoterans, come Pieris rapae (piccolo bianco), P. xylostella, o T. ni al loro larve o pupe stadi 15,17. Acari sono cellule-content feeders. Mite danno indotto è riconosciuto come un insieme di macchie clorotiche che variano di colore dal bianco al verde pallido. La suscettibilità di una pianta ospite per ragnetto erbivori è stato precedentemente valutato sia indirettamente attraverso l&#39;analisi dei giorni di spettacolo ragnetto post-infestazione 18,19, o direttamente con morfologia lordo delle piante settimane post-infestazione 18 o utilizzando un imaging digitale di foglie esposte agli acari per giorni con successiva analisi delle immagini automatizzata 19. Questi metodi sono stati sviluppati e utilizzati per lo studio di interazioni tra piante di pomodoro e T. urticae, e in genere utilizzato un piccolo numero di acari (5-15 al trattamento) che sono stati raccolti dalla popolazione di acari mista e sono stati collocati sulla superficie del foglio con una spazzola a setole morbide. Tuttavia, questi metodi non sono adatti per studi in cui devono essere applicate maggior numero di acari. Inoltre, durante l&#39;elaborazione diretta delle immagini foglia in software di analisi dell&#39;immaginecome Adobe Photoshop (San Jose, CA) o ImageJ 20 possono essere utilizzate per l&#39;analisi di danni pomodoro, questi protocolli devono essere modificate in modo da applicare a foglie che hanno una maggiore riflettività della superficie o sono leggermente colorate e hanno tricomi altamente visibili ( ad esempio, A. thaliana) che interferiscono con la selezione automatica delle macchie clorotiche che segnano danni pianta. Inoltre, lo stadio di sviluppo di acari che possono essere facilmente utilizzati con i metodi precedenti si limita alle femmine adulte più diffusi e facilmente identificabili ed esclude l&#39;utilizzo di altri stadi di sviluppo. Il primo passo fondamentale verso l&#39;analisi high-throughput di interazione acari pianta ragno è di stabilire, protocolli semplici e robuste riproducibili a sfidare le piante con acari e affidabile valutare i risultati di interazione. In questo video, un metodo efficiente per la raccolta rapida e semplice di un grande numeroro di acari adulti di sesso femminile, la loro applicazione su un host impianto sperimentale, e la valutazione dei danni dell&#39;impianto a causa di alimentazione ragnetto sono descritti. Il protocollo presentato consente la raccolta veloce ed efficiente di centinaia di persone, in qualsiasi stadio di sviluppo (uova, larve, ninfe, maschi adulti e femmine) che può essere utilizzata per la successiva applicazione sperimentale. Inoltre, questi protocolli possono essere applicati a qualsiasi pianta ospite acari, ma sono specificamente dimostrato nel caso di A. thaliana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1157">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:231px;">Plant material:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">California red kidney bean</td>
			<td style="width:275px;">Stokes, Thorold, ON, Canada</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:231px;">Chemicals:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">P9416</td>
			<td style="width:527px;">1% stock solution is prepared to simplify aliquoting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tap water</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:231px;">Other materials and equipment:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Plastic tray</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Set of scissors</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">2 L beakers</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Paper towels</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sets of sieves</td>
			<td style="width:275px;">Manufactured in house</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">Detailed instructions are available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Thin brush</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Pipettes</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Pipette tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">0.2 and 1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Air pump</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Stereoscope</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td style="width:125px;">V30</td>
			<td style="width:527px;">Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Computer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Adobe Photoshop software</td>
			<td style="width:275px;">Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA</td>
			<td style="width:125px;">various</td>
			<td style="width:527px;">Any version with Histogram tool included.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of two-spotted spider mite tetranychus urticae for plant-pest interaction studies

Il ragnetto due maculato, Tetranychus urticae, è un onnipresente erbivoro artropode polifago che si nutre di una notevole vasta gamma di specie, con più di 150 di valore economico. Si tratta di un parassita importante di colture in serra, specialmente in Solanacee e Cucurbitacee (ad esempio, pomodori, melanzane, peperoni, cetrioli, zucchine) e ornamentali serra (ad esempio, rose, crisantemi, garofani), colture annuali di campo (come il mais, cotone, soia e barbabietola da zucchero), e in colture perenni (erba medica, fragole, uva, agrumi, e susine) 1,2. Oltre al polyphagy estremo che rende un importante parassiti agricoli, T. urticae ha una tendenza a sviluppare resistenza ad una vasta gamma di insetticidi e acaricidi che sono usati per il suo controllo 3-7. T. urticae è un ottimo organismo sperimentale, in quanto ha un ciclo vitale rapido (7 giorni a 27 ° C)e può essere facilmente mantenuta ad alta densità in laboratorio. Metodi per saggiare l&#39;espressione genica (compresi ibridazione in situ e colorazione degli anticorpi) e per inattivare l&#39;espressione del ragnetto geni endogeni utilizzando RNA interference sono stati sviluppati 8-10. Recentemente, l&#39;intera sequenza del genoma di T. urticae è stata riportata, creando l&#39;opportunità di sviluppare questo parassita erbivoro come organismo modello con risorse genomiche equivalenti che già esistono in alcune delle sue piante ospiti (Arabidopsis thaliana e il pomodoro Solanum lycopersicum) 11. Insieme, questi organismi modello potrebbero fornire approfondimenti basi molecolari delle interazioni pianta-parassiti. Qui, un metodo efficiente per la raccolta rapida e semplice di un gran numero di acari femmina adulta, la loro applicazione su un host impianto sperimentale, e la valutazione del danno pianta causa alimentazione ragnetto sono descritti. Il protocollo presentato enAbles raccolta veloce ed efficiente di centinaia di persone, in qualsiasi stadio di sviluppo (uova, larve, ninfe, maschi adulti e femmine) che può essere utilizzata per la successiva applicazione sperimentale.

Utilizzo di 20-30 piante di fagiolo infestate, si può raccogliere circa 2.000 acari femmina adulta con setacci. Il tempo necessario per infestare 10 impianti con 20 acari per pianta è di circa 15 minuti se si utilizza un pennello per trasferire gli acari. Combinazioni di metodi di raccolta e di applicazione sono mostrati nella Figura 2. Questo protocollo genera risultati riproducibili di danni pianta, dimostrando che gli acari raccolti sono stato fisiologico simile e adatt...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies at JoVE.com

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Protocolli per la preparazione efficiente di campioni omogenei di acari, infestazione di piante sperimentali, e la valutazione del danno dell&#39;impianto, come richiesto per gli studi di interazione pianta-parassita sono stati sviluppati.

Applicazione di due-macchiato Spider Mite<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Per gli Studi Plant-parassita di interazione

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

application-two-spotted-spider-mite-tetranychus-urticae-for-plant

Research

JoVE Journal

Environment

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

17.6K Views.  The University of Western Ontario.  Protocolli per la preparazione efficiente di campioni omogenei di acari, infestazione di piante sperimentali, e la valutazione del danno dell'impianto, come richiesto per gli studi di interazione pianta-parassita sono stati sviluppati. 

Video: Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with specific functions (e.g. carbon sequestration, soil quality improvements, or contaminant sorption). In 2013, the International Biochar Initiative (IBI) made publically available their Standardized Product Definition and Product Testing Guidelines (Version 1.1) which set standards for physical and chemical characteristics for biochar. Six biochars made from three different feedstocks and at two temperatures were analyzed for characteristics related to their use as a soil amendment. The protocol describes analyses of the feedstocks and biochars and includes: cation exchange capacity (CEC), specific surface area (SSA), organic carbon (OC) and moisture percentage, pH, particle size distribution, and proximate and ultimate analysis. Also described in the protocol are the analyses of the feedstocks and biochars for contaminants including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), metals and mercury as well as nutrients (phosphorous, nitrite and nitrate and ammonium as nitrogen). The protocol also includes the biological testing procedures, earthworm avoidance and germination assays. Based on the quality assurance / quality control (QA/QC) results of blanks, duplicates, standards and reference materials, all methods were determined adequate for use with biochar and feedstock materials. All biochars and feedstocks were well within the criterion set by the IBI and there were little differences among biochars, except in the case of the biochar produced from construction waste materials. This biochar (referred to as Old biochar) was determined to have elevated levels of arsenic, chromium, copper, and lead, and failed the earthworm avoidance and germination assays. Based on these results, Old biochar would not be appropriate for use as a soil amendment for carbon sequestration, substrate quality improvements or remediation.

Biochar is a carbon-rich material used as a soil amendment with the ability to sustainably sequester carbon, improve substrate quality and sorb contaminants. This protocol describes the 17 analytical methods used for the characterization of biochar, which is required prior to large scale implementation of these amendments in the environment.

Fisica, chimica e caratterizzazione biologica di Six Biochars Prodotti per il risanamento dei siti contaminati

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

Ricerca

Ambiente

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Caratterizzazione e applicazione di passivi Campionatori per il monitoraggio dei pesticidi in acqua

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Remote Sensing Evaluation of Two-spotted Spider Mite Damage on Greenhouse Cotton

The objective of this study was to evaluate a ground-based multispectral optical sensor as a remote sensing tool to assess foliar damage caused by the two-spotted spider mite (TSSM), Tetranychus urticae Koch, on greenhouse grown cotton. TSSM is a polyphagous pest which occurs on a variety of field and horticultural crops. It often becomes an early season pest of cotton in damaging proportions as opposed to being a late season innocuous pest in the mid-southern United States. Evaluation of acaricides is important for maintaining the efficacy of and preventing resistance to the currently available arsenal of chemicals and newly developed control agents. Enumeration of spider mites for efficacy evaluations is laborious and time consuming. Therefore, subjective visual damage rating is commonly used to assess density of spider mites. The NDVI (Normalized Difference Vegetation Index) is the most widely used statistic to describe the spectral reflectance characteristics of vegetation canopy to assess plant stress and health consequent to spider mite infestations. Results demonstrated that a multispectral optical sensor is an effective tool in distinguishing varying levels of infestation caused by T. urticae on early season cotton. This remote sensing technique may be used in lieu of a visual rating to evaluate insecticide treatments.

This manuscript describes a multispectral optical sensor that effectively detected damage to early season cotton artificially infested with varying densities of the two-spotted spider mite populations.

Valutazione Remote Sensing of Two-macchiato Danni ragnetto su Greenhouse Cotton

The objective of this study was to evaluate a ground-based multispectral optical sensor as a remote sensing tool to assess foliar damage caused by the ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropod populations in rice. When used in combination with an enclosure, application of this sampling device provides absolute estimates of the populations of arthropods as numbers per standardized sampling area. The sampling efficiency depends critically on the sampling duration. In a mature rice crop, a two-minute sampling in an enclosure of 0.13 m2 yields more than 90% of the arthropod population. The device also allows sampling of arthropods dwelling on the water surface or the soil in rice paddies, but it is not suitable for sampling fast flying insects, such as predatory Odonata or larger hymenopterous parasitoids. The modified blower-vac is simple to construct, and cheaper and easier to handle than traditional suction sampling devices, such as D-vac. The low cost makes the modified blower-vac also accessible to researchers in developing countries.

Assessment of arthropod abundance in crops is critical for investigating population dynamics and species interactions. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropods in rice.

Modifica e applicazione di una Leaf Blower-Vac per Campo di campionamento di Artropodi

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes &#8804;4 L or &gt;4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

L&#39;utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Vegetated Treatment Systems for Removing Contaminants Associated with Surface Water Toxicity in Agriculture and Urban Runoff

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may be treated with simple systems designed to promote sorption of contaminants to vegetation and soils and promote infiltration. Two example systems are described: a bioswale treatment system for urban stormwater treatment, and a vegetated drainage ditch for treating agriculture irrigation runoff. Both have similar attributes that reduce contaminant loading in runoff: vegetation that results in sorption of the contaminants to the soil and plant surfaces, and water infiltration. These systems may also include the integration of granulated activated carbon as a polishing step to remove residual contaminants. Implementation of these systems in agriculture and urban watersheds requires system monitoring to verify treatment efficacy. This includes chemical monitoring for specific contaminants responsible for toxicity. The current paper emphasizes monitoring of current use pesticides since these are responsible for surface water toxicity to aquatic invertebrates.

This article summarizes the design attributes and the effectiveness of treatment systems that treat urban stormwater and agriculture irrigation runoff to remove pesticides and other contaminants associated with aquatic toxicity.

Sistemi di trattamento vegetale per la rimozione dei contaminanti associati alla tossicità dell&#39;acqua superficiale nell&#39;agricoltura e nella rottura urbana

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

La prova di infezione di pianta: Spray e ferita-mediata di inoculazione con la pianta patogeno Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are also a useful scientific model to study motion vision and flight dynamics in a controlled laboratory setting. As the larvae develop in organically polluted water, they are useful models for investigating investment in microbial immunity. While large scale commercial breeding for agriculture already occurs, there are no standardized protocols for maintaining captive populations for scientific studies. This is important as commercial captive breeding programs focusing on mass output during peak pollination periods may fail to provide a population that is consistent, stable and robust throughout the year, as is often needed for other research purposes. Therefore, a method to establish, maintain and refresh a captive research population is required. Here, we describe the utilization of an artificial hibernation cycle, in addition to the nutritional and housing requirements, for long term maintenance of Eristalis tenax. Using these methods, we have significantly increased the health and longevity of captive populations of E. tenax compared to previous reports. We furthermore discuss small scale rearing methods and options for optimizing yields and manipulating population demographics.

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

The overall goal of these procedures is to establish, maintain and refresh a captive population of Eristalis tenax in a research setting.

Allevamento e manutenzione a lungo termine di sirfidi Eristalis tenax per studi di ricerca

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is an accumulating evidence showing that the expressions of certain miRNAs are altered when grafting, an agricultural practice commonly used by farmers to improve crop tolerance to biotic and abiotic stresses. Bottle gourd is an inherently climate-resilient crop compared to many other major cucurbits, including watermelon, rendering it one of the most widely used rootstocks for the latter. The recent advancement of high-throughput sequencing technologies has provided great opportunities to investigate cold-responsive miRNAs and their contributions to heterograft advantages; yet, adequate experimental procedures are a prerequisite for this purpose. Here, we present a detailed protocol for efficiently generating homo- and heterografts between the cold-susceptible watermelon and the cold-tolerant bottle gourd, in addition to methods of tissue sampling, data generation, and data analysis. The presented methods are also useful for other plant-grafting systems, to interrogate miRNA regulations under various environmental stresses, such as heat, drought, and salinity.

Here we present a detailed protocol for efficiently making homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd, in addition to methods of tissue sampling, data generation, and data analysis, for the investigation of cold-responsive microRNAs.

Generazione di omo - e Heterografts tra anguria e zucca bottiglia per lo studio dei microRNA freddo-sensible a reagire

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...