Gli autori ringraziano il Dr. Wolf-Dieter Stalz, il Dr. Arnaud Remy, il Dr. Anton Posch, la Dott.ssa Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi e Jeff Durban per la loro recensione critica e la modifica di questo manoscritto. Gli autori ringraziano anche Allison Schwartz per il supporto tecnico.

1. Preparazione del campione proteico
(Viene descritta una procedura tipica per estrarre proteine dalla coltura cellulare)
<ol><li>Mettere il piatto di coltura cellulare HeLa nel ghiaccio e lavare le cellule con saline tris-buffered ghiacciate (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Aspirare il TBS, quindi aggiungere 1 ml per tampone RIPA ghiacciato piatto da 100 mm (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% di deossicholato di sodio, 0,1% SDS) integrato con inibitori della fosfatasi e della proteasi.</li>
	<li>Raschiare le cellule aderenti dal piatto usando un raschietto a celle di plastica fredda; trasferire delicatamente la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo preraffreddato.</li>
	<li>Mantenere l'agitazione costante per 30 min a 4 °C su un rotatore.</li>
	<li>Girare a 16.000 x g per 20 min in una centrifuga preraffreddata a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il tubo dalla centrifuga e posizionare sul ghiaccio. Trasferire il supernatante in un tubo fresco tenuto sul ghiaccio e scartare il pellet.</li>
	<li>Rimuovere un piccolo volume (10-20 μl) di lysate per eseguire un test proteico. Determinare la concentrazione proteica per ciascun campione utilizzando il kit di saggi RC DC.</li>
	<li>Se necessario, aliquotere i campioni proteici per la conservazione a lungo termine a -20 °C. I cicli di congelamento e disgelo ripetuti causano la degradazione delle proteine e devono essere evitati.</li>
	<li>Prendere circa 20 μg di ogni campione, aggiungere un volume uguale di 2x Laemmli Sample Buffer (4% SDS, 10% 2-mercaptoetanolo, 20% glicerolo, 0,004% blu bromofenolo, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Riscaldare ogni cella lysate in tampone campione a 95 °C per 5 min.</li>
	<li>Centrifuga a 16.000 x g in un microcentrifugo per 1 min.</li>
</ol>2. Elettroforesi gel con gel senza macchie (~ 30 min)
<ol><li>Prendi un criterio TGX Qualsiasi gel prefabbricato privo di macchie KD (un gel in formato midi), rimuovi il pettine e il nastro dal fondo della cassetta.</li>
	<li>Posizionare la cassetta nella cella Criterion e riempire la camera tampone superiore integrata con tampone di corsa da 60 ml (25 mM Tris, 190 mM di glicina, 0,1% SDS, pH 8,3). Risciacquare i pozzi con tampone in esecuzione.</li>
	<li>Riempire ogni metà del serbatoio tampone inferiore con un buffer di corsa di 400 ml alla linea di riempimento contrassegnata.</li>
	<li>Caricare i campioni proteici e i marcatori proteici appropriati.</li>
	<li>Posizionare il coperchio sul serbatoio, allineando i tappi di banana codificati a colori con i corrispondenti martinetti sul coperchio.</li>
	<li>Eseguire il gel per ~ 30 min a 200 V o 20 min a 300 V.</li>
</ol>3. Imaging gel senza macchie utilizzando il sistema CHEMIDOC MP per controllare la qualità della separazione delle proteine (~ 5 min)
<ol><li>Rimuovere la cassetta di gel dalla cella. Utilizzare lo strumento di apertura della cassetta in gel nel coperchio Criterion Cell per aprire la cassetta e rilasciare il gel.</li>
	<li>Applicare un paio di millilitri di acqua al centro del vassoio campione UV dell'imager ChemiDoc MP. Sollevare con cura il gel dalla cassetta e posizionarlo sul vassoio.</li>
	<li>Avviare il software Image Lab e acquisire l'immagine gel senza macchie (Figura 1A) con le impostazioni seguenti: Applicazione: gel senza macchie Tempo di attivazione del gel: 1 min Area di imaging: gel criterio Tempo di esposizione dell'immagine: ottimizzato automaticamente per le bande più intense</li>
	<li>Rimuovere il gel dal vassoio del campione e procedere immediatamente alla fase di trasferimento.</li>
</ol>4. Trasferimento proteico con il sistema Trans-Blot Turbo (~ 10 min)
<ol><li>Aprire un pacchetto di trasferimento PVDF Trans-Blot Turbo Midi; posizionare la pila inferiore (che include la membrana) sulla base della cassetta di trasferimento.</li>
	<li>Posizionare il gel sopra la membrana, posizionare la pila superiore sul gel e stendere le bolle.</li>
	<li>Posizionare il coperchio sulla base della cassetta e ruotare il quadrante per bloccarlo.</li>
	<li>Inserire la cassetta nell'alloggiamento del blotter.</li>
	<li>Avviare il trasferimento selezionando un programma Turbo preimpostato e scegliendo la dimensione del gel Criterion (midi), quindi premere RUN. Una corsa tipica richiede solo 7 minuti.</li>
	<li>Al fine del trasferimento, smontare il sandwich gonfio e posizionare sia la macchia che il gel in un contenitore con acqua deionizzata.</li>
</ol>5. Gel privo di macchie e imaging Blot utilizzando il sistema CHEMIDOC MP per controllare l'efficienza e la qualità del trasferimento proteico (~ 5 min)
<ol><li>Posizionare il gel post-trasferimento sul vassoio campione dell'imager ChemiDoc MP.</li>
	<li>Avviare il software Image Lab e acquisire l'immagine senza macchie del gel post-trasferimento (Figura 1B) con le seguenti impostazioni: Applicazione: gel senza macchie Tempo di attivazione del gel: nessuno Area di imaging: gel criterio Tempo di esposizione dell'immagine: uguale al tempo di esposizione per l'immagine del gel pretrasferente</li>
	<li>Rimuovere il gel dal vassoio del campione, quindi immaginere la macchia (Figura 1C) con le seguenti impostazioni. Mantenere la macchia bagnata con alcune gocce d'acqua o TBST durante l'imaging. Applicazione: macchia senza macchie Area di imaging: gel criterio Tempo di esposizione dell'immagine: ottimizzato automaticamente per le bande più intense</li>
	<li>Rimuovere la membrana assorbimento dal vassoio del campione e posizionarla in un contenitore con TBST (0,1% Tween 20 in TBS).</li>
</ol>6. Incubazione anticorpale
<ol><li>Bloccare posizionando la macchia in una soluzione di albumina siere bovina al 3% (BSA) in TBST a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
	<li>Incubare la macchia durante la notte a 4 °C nella soluzione contenente anticorpi primari del topo sollevati contro la prima proteina bersaglio e l'anticorpo primario del coniglio sollevato contro la seconda proteina bersaglio.</li>
	<li>Versare la soluzione contenente l'anticorpo primario. Quindi, lavare la macchia agitando in 20 ml di TBST per 5 minuti. Ripetere 4 volte per un totale di 5 lavaggi.</li>
	<li>Incubare per 1 ora a temperatura ambiente nella soluzione anticorpale secondaria contenente un anticorpo goat-anti-mouse coniugato Dylight 650 e un anticorpo Goat-anti-rabbit coniugato Dylight 549.</li>
	<li>Versare la soluzione contenente l'anticorpo primario. Quindi, lavare la macchia agitando in 20 ml di TBST per 5 minuti. Ripetere 4 volte per un totale di 5 lavaggi.</li>
</ol>7. Imaging e analisi dei dati da parte del software Image Lab - Normalizzazione totale delle proteine (~ 5 min)
<ol><li>Acquisire un'immagine fluorescente multiplexing della macchia (Figura 1E) aprendo un nuovo protocollo multicanale, configurare tre canali fluorescenti ed eseguire il protocollo. Canale 1: Applicazione: blot Dylight 650 Area di imaging: gel criterio Tempo di esposizione dell'immagine: ottimizzato automaticamente per le bande più intense Canale 2: Applicazione: blot Dylight 549 Area di imaging: gel criterio Tempo di esposizione dell'immagine: ottimizzato automaticamente per le bande più intense Canale 3: Applicazione: macchia senza macchie Area di imaging: criterio gel Tempo di esposizione dell'immagine: ottimizzato automaticamente per le bande più intense</li>
	<li>Fate clic sull'icona Normalizzazione (Normalization) nella casella Strumenti analisi (Analysis Tool Box) e fate clic su Sì (Yes) per rilevare corsie e bande.</li>
	<li>Selezionare e utilizzare "Strumenti corsie e bande" per apportare modifiche alle corsie e alle bande, se necessario.</li>
	<li>Selezionare l'immagine senza macchie come canale di normalizzazione.</li>
	<li>Selezionate MW Analysis Tools e assegnate le corsie standard MW selezionando le caselle sottostanti.</li>
	<li>Per visualizzare i volumi normalizzati, fare clic sulla tabella analisi sulla barra degli strumenti. Tutti i calcoli verranno eseguiti automaticamente dal software, inclusi il fattore di normalizzazione e i volumi normalizzati. I valori di intensità della banda proteica target sono ora regolati per la variazione del carico proteico. Ciò consentirà confronti accurati delle proteine bersaglio tra i campioni.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. 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Gli autori, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond e Ning Liu sono dipendenti di Bio-Rad Laboratories, Inc.

Il protocollo privo di macchie V3 descritto sopra è per multiplexing fluorescente western blotting. Può anche essere applicato nell'blotting occidentale utilizzando il rilevamento chemiluminescente. Nel protocollo multiplex fluorescente western blot, le immagini macchiate senza macchie vengono acquisite in due punti di tempo: 1) subito dopo il trasferimento di proteine; 2) alla fase di imaging fluorescente multiplex dopo l'incubazione degli anticorpi. La prima immagine senza macchie viene utilizzata per calcolare l'efficienza di trasferimento e la seconda immagine senza macchie viene utilizzata come controllo di caricamento. Quando viene applicato il metodo chemiluminescente, non è possibile scattare un'immagine multiplex per i segnali proteici senza macchie e bersaglio, perché il segnale chemiluminescente verrà mostrato anche nel canale privo di macchie. In questo caso, si consiglia di utilizzare l'immagine senza macchie scattata subito dopo la fase di trasferimento delle proteine per il controllo del carico e l'analisi di normalizzazione.
Il flusso di lavoro occidentale V3 offre i seguenti vantaggi unici rispetto al tradizionale flusso di lavoro western blot che utilizza le proteine delle pulizie come controlli di caricamento:
Innanzitutto, il flusso di lavoro V3 fornisce un controllo del carico pratico, conveniente e più affidabile per convalidare i cambiamenti nel livello della proteina di interesse. Il protocollo V3 utilizza un controllo totale del carico proteico per normalizzare il livello della proteina di interesse misurata in ciascun campione. Evita due insidie nell'uso delle proteine delle pulizie come controlli di carico: immunodetezione satura e livelli di espressione delle proteine delle pulizie incoerenti tra i campioni in determinate condizioni sperimentali. Non sono più necessari passaggi di stripping e riprobing con anticorpi diretti contro le pulizie. Utilizzando la tecnologia senza macchie, non è necessario macchiare e de-macchiare una macchia con macchie come Coomassie o Sypro Ruby per la misurazione totale delle proteine. Bastano pochi secondi per acquisire un'immagine macchiata e circa 5 minuti per eseguire la normalizzazione totale delle proteine utilizzando il software Image Lab.
In secondo luogo, il flusso di lavoro V3 consente agli scienziati di assumere un migliore controllo della procedura occidentale perché rende la procedura più trasparente e introduce diversi checkpoint per il controllo di qualità. Con l'aiuto di una tecnologia senza macchie, i ricercatori possono visualizzare i loro campioni proteici sia sul gel che sulla macchia. Gli scienziati possono valutare l'integrità del campione proteico (degradato o meno), la qualità della separazione (precipitata o meno), l'efficienza di trasferimento e la qualità del trasferimento (anche il trasferimento o meno). Questi checkpoint aiutano le ricerche a terminare l'esperimento quando vedono grandi difetti nel processo ed evitano di perdere tempo su campioni e macchie scadenti. Questa tecnologia aiuta anche gli scienziati a valutare se c'è una quantità significativa di perdita proteica dopo lo stripping della membrana e se la macchia è adatta per riprobing di un obiettivo diverso 4.
Ecco alcuni suggerimenti per garantire una buona esperienza e dati di qualità utilizzando il flusso di lavoro occidentale V3.
<ol><li>Immagine del gel immediatamente dopo l'esecuzione del gel. Non immergere il gel in alcun tampone prima della prima immagine nella procedura in quanto può lavare via il composto di macchie.</li>
	<li>Utilizzare la stessa area di imaging per acquisire tutte le immagini nel protocollo. Ciò consentirà al software di sovrapporre le immagini per l'analisi dei dati come la normalizzazione totale delle proteine.</li>
	<li>Mantenere costante il tempo di esposizione durante l'imaging dei gel di pretrasfero e post-trasferimento. Ciò consentirà al software di misurare quantitativamente l'efficienza del trasferimento.</li>
	<li>Mantenere la membrana bagnata con alcune gocce d'acqua o TBST quando si acquisisce l'immagine della macchia. Ciò eviterà possibili problemi di fondo sporchi per il rilevamento delle proteine bersaglio.</li>
	<li>Utilizzare la membrana PVDF a bassa fluorescente per multiplexare l'blotting occidentale fluorescente.</li>
</ol>È importante notare che la molecola priva di macchie dopo l'attivazione UV è irreversibilmente legata ai residui di triptofano. Questa modifica irreversibile può potenzialmente influenzare il riconoscimento dell'antigene quando si utilizzano anticorpi monoclonali se l'epitopo contiene triptofano. È improbabile che gli anticorpi policlonali siano colpiti perché riconoscono più epitopi sull'antigene. Le molecole non legate senza macchie sono facilmente lavate via dal gel e dalla membrana e quindi non interferiranno con le interazioni anticorpo-antigene.
In conclusione, il flusso di lavoro occidentale V3 rende il processo western blot più veloce, trasparente, quantitativo e più affidabile. I ricercatori ora possono facilmente applicare il controllo totale del carico proteico in un esperimento western blot per rendere i loro dati più affidabili. Il flusso di lavoro privo di macchie V3 è stato adottato da un certo numero di laboratori e le loro pubblicazioni hanno dimostrato che le riviste accettano dati senza macchie come controllo del carico nella macchia occidentale22,17,7,8,5,23,18,15.

Western blot è una tecnica molto utile9, tuttavia, ci sono due sfide principali con l'gonfiore occidentale: processo lungo e laborioso e qualità dei dati. Un protocollo tradizionale richiede circa 2 giorni. Coinvolge molti passaggi tra cui la preparazione del campione, la fusione del gel, l'elettroforesi e il trasferimento delle proteine, il blocco della membrana seguito dall'incubazione degli anticorpi, l'imaging e molto spesso lo stripping, il riprobing e infine l'analisi dei dati. Durante questo processo, non ci sono strumenti affidabili e flessibili per il controllo dei processi. Pertanto, gli errori possono essere introdotti in ogni fase e questi errori hanno il potenziale per generare artefatti di dati; pertanto, i controlli di caricamento sono essenziali nell'blotting occidentale per identificare e correggere gli errori. Il controllo del carico viene solitamente effettuato controllando il livello proteico di una proteina di riferimento in ogni campione per vedere se è ugualmente presentato. Le persone usano spesso proteine delle pulizie, come β-actina, β-tubulina, GAPDH, come controllo del carico.
La qualità dei dati western blot dipende da un controllo affidabile del carico. Ma ci sono due preoccupazioni legittime quando si utilizzano proteine di pulizia per i controlli di carico: 1) l'immunodetezione a base di anticorpi delle bande proteiche delle pulizie è spesso satura e quindi non si possono distinguere le differenze di carico tra icampioni 30; 2) il livello di espressione delle proteine di pulizia può variare nei campioni in determinate condizioni sperimentali, ad esempio il trattamento con siRNA, la morte cellulare, la differenziazione cellulare, ecc.11,28,3,6,10,21. A causa di queste preoccupazioni, le riviste scientifiche richiedono ora che "per confronti quantitativi, dovrebbero essere utilizzati reagenti appropriati, controlli e metodi di imaging con intervalli di segnale lineari" (linee guida sulla natura). Allo stesso modo, gli editori del Journal of Clinical Investigation chiedono controlli di carico più affidabili24. Per questi motivi, una proteina delle pulizie deve essere convalidata per essere utilizzata come controllo del carico. In primo luogo, bisogna assicurarsi che sia misurato nell'intervallo dinamico lineare del metodo di immunodetezione14,29. In secondo luogo, bisogna assicurarsi che sia espresso in modo coerente in tutti icampioni 26,31,25,19,20.
Una soluzione alternativa a un controllo di carico affidabile è utilizzare la misurazione totale delle proteine dalla macchia. Alcuni ricercatori hanno macchiato le macchie proteiche totali, come Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S e tecnologia senza macchie, per misurare il segnale proteico totale in ogni corsia come controllo del carico16,20,13,27,1,4,12. Il controllo totale del carico proteico evita le insidie associate alle proteine delle pulizie. In primo luogo, è un vero riflesso della quantità di proteine caricate per ogni campione. In secondo luogo, la macchia proteica totale presenta un'eccellente gamma dinamica lineare nell'intervallo di carico comune per l'analisi western blot (proteina 10-50 μg di un lisato cellulare complesso) e differenzia accuratamente la differenza di carico tra i campioni12.
La tecnologia senza macchie è un nuovo metodo di colorazione proteica totale in cui un composto unico viene mescolato in soluzione di gel di acrilammide e distribuito uniformemente nel gel fusa. Una volta completata l'elettroforesi, il gel viene esposto alla luce UV per un minimo di 1 minuto in modo che il composto di macchia reagisca con i residui di triptofano nella proteina. Le proteine diventano eccitabili sotto la luce UV per dare un forte segnale fluorescente che può essere visualizzato e quantificato in un imager abilitato senza macchie come il sistema ChemiDoc MP. Il composto stesso privo di macchie, tuttavia, non assorbe la luce UV, con conseguente basso sfondo dell'immagine in gel. La modifica dei residui di triptofano è irreversibile e le proteine possono essere visualizzate non solo nel gel ma anche sulla macchia in qualsiasi momento dopo il trasferimento di proteine.
La tecnologia senza macchie viene applicata nel flusso di lavoro occidentale V3 (Figura 1) per affrontare i principali reclami relativi al flusso di lavoro tradizionale, in particolare i problemi relativi all'utilizzo delle proteine delle pulizie come controlli di caricamento. Utilizzando questo flusso di lavoro, si potrebbe: 1) eseguire un gel in circa 20-30 minuti, 2) controllare l'integrità del campione e la qualità della separazione proteica in 5 minuti dopo l'esecuzione del gel; 3) trasferire proteine in 3-10 min; 4) controllare quantitativamente l'efficienza del trasferimento; e 5) soprattutto, convalidare i cambiamenti nel livello della proteina di interesse utilizzando il controllo totale del carico proteico.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>567-8093 </td>
 <td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4157 </td>
 <td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-5061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Criterion Cell </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>165-6100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4155</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChemiDoc MP System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-8280</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

La macchia occidentale è una tecnica di laboratorio molto utile e ampiamente adottata, ma la sua esecuzione è impegnativa. Il flusso di lavoro è spesso caratterizzato come una "scatola nera" perché uno sperimentalista non sa se è stato eseguito correttamente fino all'ultimo di diversi passaggi. Inoltre, la qualità dei dati western blot è talvolta messa in discussione a causa della mancanza di efficaci strumenti di controllo della qualità in atto durante tutto il processo di soffiatura occidentale. Qui descriviamo il flusso di lavoro occidentale V3, che applica la tecnologia senza macchie per affrontare le principali preoccupazioni associate al tradizionale protocollo western blot. Questo flusso di lavoro consente ai ricercatori: 1) di eseguire un gel in circa 20-30 minuti; 2) visualizzare la qualità della separazione del campione entro 5 minuti dalla corsa del gel; 3) trasferire proteine in 3-10 min; 4) verificare quantitativamente l'efficienza dei trasferimenti; e, soprattutto, 5) per convalidare i cambiamenti nel livello della proteina di interesse utilizzando il controllo totale del carico proteico. Questo nuovo approccio elimina la necessità di spogliare e riprobing la macchia per le proteine delle pulizie come β-actina, β-tubulina, GAPDH, ecc. Il flusso di lavoro senza macchie V3 rende il processo western blot più veloce, trasparente, più quantitativo e affidabile.

1. Valutazione dell'integrità del campione, della qualità della separazione proteica e dell'efficienza di trasferimento con immagini in gel senza macchie.
L'estratto proteico dalle cellule HeLa è stato separato a 300 V per 20 minuti su un gel privo di macchie Criterion AnyKD TGX da 18 pozzetti. I campioni proteici sono stati caricati 3 volte a quattro quantità diverse (Corsie 1-3, 40 μg; Corsie 4-6, 30 μg; Corsie 7-9, 20 μg; Corsie 10-12, 10 μg). Il gel è stato attivato sotto la luce UV per 1 min. Figura 2A mostra l'immagine del gel acquisita subito dopo la separazione proteica. L'integrità del campioneproteico (ad esempio la degradazione) e la qualità della separazione (ad esempio precipitazioneproteica) possono essere valutate visivamente con questa immagine gel. Le proteine sono state poi trasferite per 7 minuti in una membrana di nitrocellulosa utilizzando Trans-Blot Turbo. La figura 2B mostra l'immagine priva di macchie del gel post-trasferimento. Entrambe le immagini sono state acquisite con lo stesso tempo di esposizione (6,8 sec). La corsia 3 e la 12 sono state selezionate per misurare l'efficienza del trasferimento. Utilizzando lo strumento volume nel software Image Lab, è stata disetrar da una scatola rettangolare (blu) per coprire la corsia 3 e 12 su entrambe le immagini in gel. Il calcolo basato sui valori di volume di queste scatole indicava che l'efficienza di trasferimento di entrambe le corsie era dell'80% (Figura 2C). In questo esperimento, il gel TGX AnyKD è stato selezionato per studiare proteine bersaglio di piccole e medie dimensioni e non è stato ottimizzato per il trasferimento di grandi proteine. L'ottimizzazione dell'efficienza di trasferimento richiederebbe l'uso di gel percentualeinferiore (ad esempio 4-20%) e/o una regolazione del tempo di trasferimento per facilitare il trasferimento di grandi proteine. 2. Il controllo totale del carico proteico senza macchie è un'alternativa affidabile al controllo del carico delle pulizie nell'assorbimento occidentale per quantificare un piccolo cambiamento nel livello di proteine di interesse.
MCM-7 è un fattore di replicazione con licenza di DNA il cui livello diminuisce del 20-50% nelle linee cellulari linfoblastoidi (LCL) dopo il trattamento di irradiazione. In questo esperimento, i lisati (30 μg ciascuno) di quattro colture di linea cellulare linfoblastoide (LCL) trattate con irradiazione sono state separate su un gel privo di macchie Di 12 po' di criterio AnyKD TGX. Il gel è stato attivato per 1 minuto sotto la luce UV e trasferito da Trans-Blot Turbo su una membrana PVDF per l'immunoblotting. La proteina delle pulizie GAPDH (verde) è stata sondata con un anticorpo di coniglio (Cell Signaling Technology, USA, 1:2,500) e un anticorpo Dylight 549 coniugato Capra-anti-coniglio (Rockland, USA, 1:20,000). La proteina di interesse MCM-7 (rosso) è stata sondata usando un anticorpo del topo (Abcam, USA, 1:1,000) e un anticorpo di capra-anti-topo coniugato Dylight 649 (Rockland, 1:10,000).
La figura 3A mostra un'immagine fluorescente multiplex delle proteine totali (blu), MCM-7 (rosso) e GAPDH (verde) rilevate in quattro campioni LCL trattati con controllo e irradiazione. La figura 3B è un'immagine priva di macchie della stessa macchia che mostra i modelli proteici totali in ogni campione (30 μg). Il software di laboratorio di immagini ha selezionato le corsie campione (scatole blu) per misurare MCM-7, GAPDH e il volume totale di proteine in ogni corsia. I livelli di MCM-7 sono stati normalizzati sia rispetto alla misurazione totale delle proteine senza macchie che contro GAPDH. I livelli di proteine MCM-7 normalizzati sono stati analizzati statisticamente e il volume medio della banda proteica MCM-7 e la deviazione standard (n=4) sono presentati nel grafico(Figura 3C). Entrambi i metodi di normalizzazione hanno rivelato una piccola diminuzione (circa il 25%) nei livelli proteici MCM-7 dopo il trattamento di irradiazione. I dati con la normalizzazione totale delle proteine presentavano una deviazione standard inferiore a quella con GAPDH come controllo del carico.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Figura 1. Flusso di lavoro occidentale V3. Il flusso di lavoro V3 è rappresentato nella colonna sinistra in 4 passaggi. I principali strumenti e reagenti utilizzati nel flusso di lavoro sono mostrati in ogni fase. È incluso anche il tempo stimato per ogni passaggio. La colonna destra mostra che è possibile generare almeno 4 immagini nel flusso di lavoro V3. Viene descritto l'uso di ogni dato. Le immagini senza macchie del gel pretrasfero, del gel post-trasferimento e della macchia(A, B, C) non possono essere generate facilmente con le tradizionali tecniche di soffiatura occidentale; Queste immagini e dati forniscono informazioni importanti e checkpoint lungo la procedura per migliorare il controllo e la riproducibilità dello scienziato del flusso di lavoro western blot. I segnali proteici bersaglio possono essere catturati su un'immagine macchia chemiluminescente(D) se è stato applicato un anticorpo secondario coniugato con HRP nel rilevamento o su un'immagine macchiafluorescente( E ) se è stato eseguito il multiplexing fluorescente western blotting per rilevare più di una proteina bersaglio contemporaneamente sulla stessa macchia. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Figura 2. Immagini senza macchie di gel pretrasferibili e post-trasferimento nel flusso di lavoro occidentale V3 per valutare l'integrità del campione, la qualità della separazione e l'efficienza del trasferimento. (A) Immagine senza macchie di gel pretrasfero. (B) Immagine senza macchie di gel post-trasferimento. ( C )Misurazionedell'efficienza del trasferimento proteico.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Figura 3. Confronto tra la misurazione totale delle proteine senza macchie e l'immunodetezione GAPDH come controlli di carico per normalizzare il livello di proteine di interesse. (A) Immagine western fluorescente macchia. (B) Immagine macchiata senza macchie. (C) Livelli di proteine MCM-7 normalizzati. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>

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V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Il flusso di lavoro V3 è una procedura western blot che utilizza gel senza macchie. La tecnologia senza macchie consente ai ricercatori di visualizzare la qualità della separazione proteica, di verificare l'efficienza di trasferimento e, soprattutto, di convalidare il cambiamento nella proteina di interesse utilizzando la quantificazione totale delle proteine come controllo di carico affidabile.

Flusso di lavoro senza macchie V3 per un controllo pratico, conveniente e affidabile del carico totale delle proteine nell'blotting occidentale

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K Views.  Bio-Rad Laboratories. Il flusso di lavoro V3 è una procedura western blot che utilizza gel senza macchie. La tecnologia senza macchie consente ai ricercatori di visualizzare la qualità della separazione proteica, di verificare l'efficienza di trasferimento e, soprattutto, di convalidare il cambiamento nella proteina di interesse utilizzando la quantificazione totale delle proteine come controllo di carico affidabile.

Video: V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western Blotting Utilizzando il Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Ricerca

Biologia

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to elaborate distinct aspects of motor function and to determine even subtle loss of movement capacity. To enhance efficacy and resolution of testing, tests should permit qualitative and quantitative measures of motor function and be sensitive to changes in performance during recovery periods. The present study describes a new task to assess skilled walking in the rat to measure both forelimb and hindlimb function at the same time. Animals are required to walk along a horizontal ladder on which the spacing of the rungs is variable and is periodically changed. Changes in rung spacing prevent animals from learning the absolute and relative location of the rungs and so minimize the ability of the animals to compensate for impairments through learning. In addition, changing the spacing between the rungs allows the test to be used repeatedly in long-term studies. Methods are described for both quantitative and qualitative description of both fore- and hindlimb performance, including limb placing, stepping, co-ordination. Furthermore, use of compensatory strategies is indicated by missteps or compensatory steps in response to another limb&#x2019;s misplacement. 

The ladder rung walking task is a new test to assess skilled walking and measure both forelimb and hindlimb placing, stepping, and inter-limb co-ordination.

Il ramo Ladder Walking attività: un sistema di punteggio e la sua applicazione pratica.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico da kit di raccolta del sangue per Plasma Proteina Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Una guida pratica per Phylogenetics per i non esperti

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

Il più veloce occidentale in città: un tocco contemporaneo alla classica analisi Western Blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...