Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health e George E. Hewitt Foundation Fellowship (AP).

Gel elettroforesi Nota tecnica: Prima di iniziare la procedura, i vostri campioni di proteine ​​pronto. Durante questa prima fase, le proteine ​​nel campione sono separati in base al loro peso molecolare mediante elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide (PAG). Il NuPAGE ® Sample Buffer LDS caricato con solfato di litio Dodecyl (LDS) mantiene in uno stato di polipeptidi denaturati una volta il campione è stato riscaldato a 70 ° C per 10 minuti. Un forte agente riducente viene utilizzato in combinazione per rimuovere la struttura secondaria e terziaria (DTT, per rompere i legami disolfuro). Inoltre, le proteine ​​del campione si ricoprono in carica negativa LDS e quindi passare attraverso le maglie del gel acrilamide verso l&#39;elettrodo con carica positiva. Questo permette la loro separazione in base al peso molecolare (misurato in Dalton chilo, kDa). Dettagliate passo-passo i protocolli per la preparazione del campione e la procedura PAGE si possono trovare sul sito Invitrogen 2, o nella guida tecnica NuPAGE 3. Consigli tecnici <ol><li> Nel NuPAGE Invitrogen Bis-Tris sistema discontinuo buffer, la mobilità elettroforetica delle proteine ​​e la gamma successiva separazione del gel dipende da due fattori: i) la concentrazione acrylamid del gel (con una maggiore concentrazione di acrilamide traduce in una migliore risoluzione di minori peso molecolare delle proteine) e ii) lo ione finale del tampone di corsa, MOPS o MES. Di scegliere la combinazione appropriati per la gamma di separazione che si desidera ottenere, fare riferimento alla tabella di migrazione Gel 1. Lo spessore del gel e il numero di pozzi dipende dal volume e la quantità di campioni che si prevede di carico, rispettivamente. </li><li> Quando si carica i campioni nei pozzetti del gel, almeno una corsia è riservata ad un marcatore di peso molecolare (o scala). Questi standard proteine ​​sono disponibili in commercio da più aziende e in genere costituiti da una miscela di proteine ​​macchiato aver definito pesi molecolari, in modo da formare bande visibili che consentono di seguire l&#39;avanzamento della migrazione. Scegli una gamma di pesi molecolari che sia compatibile con la risoluzione gel. </li><li> Per ottenere un modello migratorio bella e anche noi consigliamo di caricare tutti i pozzi del gel con un volume analogo di campione o 1X tampone campione LDS. </li></ol> Trasferimento Nota tecnica: Prima di iniziare la fase di trasferimento, preparare il buffer di trasferimento (1X con il 10% metanolo) e pre-raffreddamento a 4 ° C in una stanza fredda. Al fine di rendere le proteine ​​accessibile al rilevamento degli anticorpi, essi sono trasferiti da elettroblotting dal gel su una membrana di nitrocellulosa. Il legame alle proteine ​​è basata su interazioni idrofobiche, così come le interazioni di carica tra la membrana e proteine. (Polivinilidene fluoruro (PVDF), membrana può anche essere usato come alternativa. In questo caso, la membrana PVDF deve essere pre-umido in metanolo per almeno 30 secondi prima dell&#39;uso.) Una dettagliata passo-passo protocollo della procedura di trasferimento può essere trovato in riferimento 4 se si utilizza il Bio-Rad Mini Trans-Blot cella elettroforetica di trasferimento, o nei riferimenti 2-3 se il laboratorio è dotato della Invitrogen XCell II ™ Blot Module. Come risultato di questo processo, le proteine ​​sono esposte su un sottile strato superficiale e pronto per il rilevamento. L&#39;efficacia complessiva uniformità e di trasferimento delle proteine ​​dal gel alla membrana possono essere controllate dalla colorazione della membrana tingere i reversibile Ponceau S. Colorazione Ponceau S procedura (opzionale): <ol><li> Dopo aver trasferito le proteine, la membrana posto in un vassoio di incubazione (proteine ​​rivolto verso l&#39;alto). </li><li> Aggiungere abbastanza colorazione Ponceau S per coprire la membrana e incubare almeno 30 secondi e scuotendo con cautela. </li><li> Risciacquare con acqua distillata membrana fino a quando il fondo è chiara. </li><li> Decolorare la membrana con acqua distillata per 2-3 minuti. </li><li> Posizionare la membrana nella soluzione bloccante (vedi sotto). </li></ol> Suggerimenti tecnici: <ol><li> Si consiglia di etichettatura la membrana con una matita prima del trasferimento delle proteine ​​al fine di indicare il lato in cui sono state esposte le proteine ​​e l&#39;orientamento dei tuoi campioni. </li><li> Entrambi Ponceau S colorazione e gli indicatori peso molecolare può essere utilizzata per tagliare la membrana dopo il trasferimento per sondare le parti risultante con anticorpi </li></ol> Immunolocalizzazione: Nota tecnica: questa procedura immunolocalizzazione viene fornito come direttiva. Ottimizzazione può essere richiesto per ogni formicaibody; informazioni specifiche si possono trovare nella maggior parte delle schede tecniche degli anticorpi commercialmente disponibili (ad esempio, di lavoro di diluizione, tempo di incubazione, ecc.) Durante questo ultimo processo, la proteina bersaglio verrà rilevato utilizzando un anticorpo specifico e apparirà come una fascia sulla pellicola. La posizione della band è dipendente del peso molecolare della proteina bersaglio, mentre l&#39;intensità banda dipende dalla quantità di proteina presente obiettivo. In genere, questa si ottiene dopo tre sottofasi: <ol><li> Blocco: per evitare la mancanza di specifiche interazioni degli anticorpi con la membrana (lo spazio in eccesso sulla membrana è ricoperta con una soluzione diluita di una proteina generica). </li><li> Probing: La proteina di interesse viene rilevato da uno specifico <a title="Anticorpo primario" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">anticorpo primario</a> . Dopo l&#39;anticorpo primario non legato viene lavato via, la membrana è esposta a un anticorpo diversa legata al giornalista <a title="Enzima" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">enzimi</a> , <a title="Perossidasi di rafano" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">perossidasi di rafano</a> (HRP). Questo anticorpo secondario è diretto contro la specie-specifica porzione di anticorpo primario (ad esempio un anticorpo anti-coniglio secondari si legano a tutti i conigli di origine anticorpo primario). </li><li> Rilevamento: Un agente chemiluminescenza è usato come substrato che luminesce se esposti alla HRP sui anticorpo secondario. Questa reazione produce luminescenza in luogo e in proporzione alla quantità di proteine ​​sondato. La luce viene poi rilevata da pellicola fotografica. </li></ol> Un generico passo-passo procedura è fornito di seguito. Altre procedure dettagliate si possono trovare nel ECL Plus Western Blotting di rilevamento manuale di istruzioni reagenti 5 o nella maggior parte scheda tecnica che accompagna gli anticorpi disponibili in commercio. Tempo di incubazione, diluizione degli anticorpi, e il blocco e soluzioni di lavaggio devono essere empiricamente ottimizzate per ogni anticorpo. Immunolocalizzazione procedura: <ol><li> Bloccare il legame aspecifico incubando con un volume sufficiente di soluzione di caseina PBS 1% di blocco per coprire l&#39;intera membrana. Posto su una sedia a dondolo per almeno 30 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. </li><li> Incubare la membrana con il tuo anticorpo primario (specifico per la proteina di interesse). L&#39;anticorpo primario deve essere diluito in soluzione di bloccaggio. Per la maggior parte degli anticorpi, legame completo si ottiene dopo 1-2 ore di incubazione a temperatura ambiente sotto agitazione. In alternativa, la fase di incubazione può essere eseguita durante la notte a 4 ° C per aumentare il rapporto segnale-rumore. </li><li> Rimuovere la soluzione (scartare o tenere a 4 ° C a -20 ° C per uso ripetuto) e lavare rapidamente la membrana una sola volta. Poi 3X10 minuti con PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) a temperatura ambiente con agitazione vigorosa. </li><li> Incubare la membrana con una HRP-coupled anticorpo secondario diluito in soluzione di bloccaggio. Scegli un anticorpo che riconosce la porzione IgG della specie in cui è cresciuta l&#39;anticorpo primario. L&#39;incubazione è effettuata per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione. </li><li> Scartare la soluzione e lavare rapidamente la membrana una sola volta. Poi 3X10 minuti con PBST a temperatura ambiente con agitazione vigorosa. </li><li> Procedere alla rilevazione chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore. Usiamo il reagenti ECL Plus occidentale Detection Blotting di GE Healthcare (vedi riferimento 5 per istruzioni specifiche). </li><li> Posizionare la membrana in pellicola trasparente o un sacchetto e posto all&#39;interno di una cassetta autoradiografia. Assicurati di drenare il liquido in eccesso e rimuovere tutte le bolle d&#39;aria. </li><li> Esporre la pellicola fotografica a membrana in una stanza buia. Inizia con un tempo di esposizione 1 minuto e regolare in base all&#39;intensità del segnale desiderato. </li></ol> Suggerimenti tecnici: <ol><li> Blocco di legame non specifico si ottiene mettendo la membrana in una soluzione diluita di proteine. Usiamo tipicamente l&#39;1% di caseina, ma <a title="Albumina di siero bovino" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">sieroalbumina bovina</a> (~ 2% BSA) o non-grassa del latte secco (~ 5%) può essere utilizzato come alternativa. </li><li> Tris-Buffered Saline (TBS) può essere utilizzato durante tutta la procedura, invece di PBS. Si consiglia di utilizzare TBS se avete intenzione di sondare la membrana con anticorpi phosphospecific. </li><li> L&#39;utilizzo di un bagliore-in-the-dark adesivo (ad esempio, è Stratagene Glogos ® II Markers Autorad) filettato sul fondo della cassetta autoradiografia vi aiuterà ad allineare il tuo film e la membrana durante la fase di analisi. </li></ol> Analisi Ora che avete esposto il vostro film, vi renderete conto che in termini pratici, non tutti i western di proteine ​​rivelano come una banda bel singolo. Additionabande l può anche apparire a causa del legame aspecifico degli anticorpi primario e secondario. Questo segnale di fondo può essere ridotto attraverso l&#39;ottimizzazione della procedura di immunolocalizzazione. Inoltre, un controllo appropriato (ad esempio, le cellule untransfected, siRNA cellule trattate, ecc) sarà utile per determinare la specificità del vostro anticorpi e la posizione esatta della proteina bersaglio sulla membrana. Dopo la marcatura sulla pellicola la posizione delle bande colorate standard di proteine ​​di membrana, la trama il log di ogni peso molecolare degli standard di proteine ​​(asse y) contro la loro mobilità corrispondente relativa (asse x). Mobilità relativa (Rf) è il termine utilizzato per il rapporto tra la distanza della proteina si è spostato dal suo punto di origine (parte superiore del gel) rispetto alla distanza del colorante inseguimento o un pennarello a basso peso molecolare è stato spostato (la parte anteriore gel) . Determinare la retta di regressione della curva standard per ottenere valori di pendenza e intercetta. Il peso molecolare sconosciuto (dimensione) della proteina bersaglio è stimato utilizzando il suo Rf e la seguente equazione modificata: log = peso molecolare (pendenza) (mobilità o Rf della proteina bersaglio) + y intercetta (Vedi riferimento 6 per istruzioni dettagliate). Approssimazioni livello di espressione sono prese confrontando l&#39;intensità banda della proteina bersaglio a quella di una proteina strutturale (per esempio, tubulina e actina) o di un prodotto come il gene housekeeping GAPDH. Questo cosiddetto &quot;controllo di carico&quot; non dovrebbe cambiare tra i campioni e si rivela con uno specifico anticorpo primario. L&#39;immagine può essere ulteriormente analizzato da densitometria per valutare la quantità relativa di colorazione delle proteine ​​e quantificare i risultati in termini di densità ottica.

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

La procedura qui presentata usa un gel Bis-Tris con MES esecuzione buffer come un esempio di denaturazione PAGINA utilizzando il sistema di elettroforesi Invitrogen NuPAGE Novex. Inoltre, questo pre-cast sistema gel permette la separazione delle proteine ​​in denaturazione o non denaturazione condizioni e ospita una vasta gamma di pesi molecolari (1-200 kDa per il gel Bis-Tris di 36-400 kDa per la Tris- gel acetato). A seconda del vostro esperimento, si può scegliere di seguire solo una parte della tecnica di western blotting qui descr...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

Western Blotting (o immunoblotting) è una procedura standard di laboratorio che consente agli investigatori di verificare l&#39;espressione di una proteina, determinare la quantità relativa delle proteine ​​presenti in diversi campioni, e analizzare i risultati di esperimenti di co-immunoprecipitazione. In questo metodo, una proteina bersaglio viene rilevata con un anticorpo primario specifico in un dato campione di tessuto omogenato o estratto. Separazione delle proteine ​​in base al peso molecolare è realizzato utilizzando denaturazione SDS-PAGE. Dopo il trasferimento di una membrana, la proteina bersaglio è sondato con uno specifico anticorpo primario e rilevati da chemiluminescenza. Fin dalla sua prima descrizione, la tecnica Western-blotting ha subito diversi miglioramenti, tra cui prefabbricati gel e di facile utilizzo dell&#39;apparecchiatura. Nel nostro laboratorio, abbiamo scelto di utilizzare il commercio sistema di elettroforesi NuPAGE da Invitrogen. Si tratta di un innovativo pH neutro, discontinuo SDS-PAGE, prefabbricati mini-gel sistema. Questo sistema presenta diversi vantaggi rispetto alla tecnica tradizionale Laemmli tra cui: i) una maggiore durata di conservazione dei prefabbricati gel che vanno da 8 mesi a 1 anno, ii) una vasta gamma di separazione pesi molecolari 1-400 kDa a seconda del tipo di gel utilizzati, e iii) una maggiore versatilità (intervallo di percentuale di acrilamide, il tipo di gel, e la composizione ionica del tampone di corsa). La procedura descritta in questo articolo il video utilizza il Bis-Tris sistema discontinuo buffer con 4-12% Bis-Tris gradiente di gel e MES esecuzione tampone, come illustrazione di come eseguire un western-blot utilizzando il sistema NuPAGE Invitrogen elettroforesi. Nel nostro laboratorio, abbiamo ottenuto buoni risultati e riproducibili per varie applicazioni biochimiche con questo metodo western blotting.

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Questo articolo descrive una tecnica standard occidentale-blotting utilizzando la procedura disponibile sul mercato elettroforesi NuPAGE Mini-Gel sistema da Invitrogen.

Western Blotting Utilizzando il Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K Views.  University of California, Irvine (UCI). Questo articolo descrive una tecnica standard occidentale-blotting utilizzando la procedura disponibile sul mercato elettroforesi NuPAGE Mini-Gel sistema da Invitrogen.

Video: Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Ricerca

Biologia

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di &quot;Sicura del fucile&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Utilizzando ad alta risoluzione Tomografia Computerizzata Per visualizzare la struttura tridimensionale e funzione delle piante Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

Flusso di lavoro senza macchie V3 per un controllo pratico, conveniente e affidabile del carico totale delle proteine nell'blotting occidentale

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

Il più veloce occidentale in città: un tocco contemporaneo alla classica analisi Western Blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d&#39;onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...