Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society.

1. Creazione di plasmidi <ol><li> Subclone i cDNA per ogni proteina di interesse in entrambi i vettori pluc e pYFP, ​​utilizzando tecniche di biologia molecolare standard (Figura 1). Per i protocolli dettagliati vedere Green et al 13. </li><li> Sequenza tutti i costrutti per verificare che le proteine ​​di interesse in frame con la sequenza Luc / YFP senza intermedi codoni di stop. </li><li> Effettuare saggi funzionali come desiderato per confermare che le proteine ​​di fusione conservano attività biologica. Nel caso qui presentato localizzazione subcellulare delle proteine ​​di fusione YFP è stata accertata mediante microscopia a fluorescenza. </li><li> Fai plasmidi di espressione appropriata, proteine ​​di controllo Luc e YFP progettando i segnali di targeting rilevanti nei vettori di espressione pluc e pYFP. Nel caso qui presentato, generare Luc e YFP costrutti nucleari mirati inserendo un segnale di localizzazione nucleare nei vettori pluc e pYFP. </li><li> Rendereun costrutto controllo positivo in cui Luc e YFP si fondono in un singolo polipeptide. Nel caso qui presentato, generare un controllo positivo in cui la sequenza codificante YFP è inserito nel vettore pluc. </li><li> Selezionare un plasmide riempitivo neutro da utilizzare per equalizzare la massa di DNA in miscele di trasfezione. Utilizzare un plasmide che non ha promotore eucariotico e quindi sarà trascrizionalmente inattivo in cellule di mammifero, come un vettore di clonazione batterica. </li></ol> 2. Preparazione dei Mixes DNA <ol><li> Valutare la concentrazione di tutti i plasmidi descritti nella Sezione 1 basato su assorbanza a 260 nm (1 unità di assorbanza è equivalente a 50 mg / ml di DNA). Determinare la massa molecolare di ciascun plasmide moltiplicando il numero di coppie di basi da 650 bis. Utilizzare la concentrazione e la massa molecolare per calcolare la concentrazione molare di ciascun preparato plasmide. Diluire le preparazioni di DNA plasmide ad una concentrazione di 36 nM. Questi saranno i titoli di lavoroche verranno utilizzati per preparare le miscele DNA per trasfezione. </li><li> Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 1.800 ng di plasmide riempitivo in un volume finale di 20 ml di acqua. </li><li> Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di costrutto pluc-controllo. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. </li><li> Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di pluc controllo costrutto e 5 ml di pYFP controllo costrutto. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. </li><li> Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di costrutto di controllo positivo. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. </li><li> Preparare la seguente miscela DNA per verificare omodimerizzazione di una proteina di interesse, X. Per ogni miscela di DNA combinare 5 microlitri del relativo pluc costruire e 5 microlitri del pYFP costruire. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. A) pluc-controllo e pYFP-X B) pluc-X e pYFP controllo C) pluc-X e pYFP-X </li><li> Preparare la seguente miscela DNA per verificare un&#39;interazione tra una coppia di proteine ​​di interesse, X e Y. Per ogni miscela di DNA combinano 5 microlitri del relativo pluc costruire e 5 ml di pYFP costruire. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. A) pluc-controllo e pYFP-X B) pluc-X e pYFP controllo C) pluc-controllo e pYFP-Y D) pluc-Y e pYFP controllo E) pluc-X e pYFP-Y F) pluc-Y e pYFP-X </li></ol> 3. Transfezione <ol><li> Harvest subconfluente cellule HEK293 da un pallone 75 centimetri 2. Diluire il 10% delle cellule totali in 13 ml di terreno di coltura. Pipettare 130 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una biancachiaro a fondo piastra a 96 pozzetti di coltura tissutale. Cellule di coltura per 24 ore. </li><li> Calcolare il numero di pozzetti da trasfettate moltiplicando il numero di miscele di DNA da 3. Portare terreno privo di siero cultura a temperatura ambiente. Preparare una master mix contenente 6,3 ml di mezzo privo di siero e 0,18 ml di reagente di trasfezione per bene. Mescolare nel vortex e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Preparare miscele di trasfezione con l&#39;aggiunta di 2 ml di miscela di DNA a 20 microlitri di media / trasfezione reagente master mix privo di siero. Non vortex. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Transfect tre pozzi con ciascuna miscela di trasfezione erogazione di 6,5 ml di miscela di trasfezione per pozzetto. Cultura le cellule di un ulteriore 36-48 ore. </li></ol> 4. Misurazione di segnale BRET <ol><li> Sciogliere live-cell substrato luciferasi a 34 mg / ml in DMSO di vortex. </li><li> Diluire ricostituito live-cell substrato luciferasi a 1:1000 in substrato diluizione medio pri-riscaldato a 37 ° C. Lasciare 50 ml di substrato medio diluizione per pozzetto. Vortex per mescolare. Potrebbe formarsi un precipitato, ma non interferisce con il test. </li><li> Aspirare il terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti. Dispensare 50 ml di diluito live-cell substrato di luciferasi in ciascun pozzetto. Cellule di coltura per almeno 2 ore (fino a 24 ore). </li><li> Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti ed incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente all&#39;interno luminometro. </li><li> Misurare le emissioni da Luc e YFP un bene alla volta. Misurare le emissioni da Luc usando un filtro di blocco lunghezze d&#39;onda superiore a 470 nm. Misurare le emissioni di YFP usando un filtro passa-banda 500-600 nm. Integrare segnali di emissione oltre 10 sec. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Calcolare la media dei valori di emissione Luc dai 3 pozzi che hanno ricevuto solo il plasmide di riempimento. Sottrarre questo valore da tutte le altre letture di emissione Luc per produrre i valori di emissione Luc fondo-sottratto.</li><li> Calcolare la media dei valori di emissione YFP dai 3 pozzi che hanno ricevuto solo il plasmide di riempimento. Sottrarre questo valore da tutte le altre letture di emissione YFP per produrre i valori di emissione YFP fondo-sottratto. </li><li> Per ogni bene, dividere il valore delle emissioni YFP background-sottratto dal valore delle emissioni Luc background-sottratto per dare il rapporto BRET corretta. </li><li> Calcolare la media dei rapporti BRET corretti dai tre pozzi che sono state trasfettate con il solo plasmide pluc-controllo. Sottrarre questo valore da tutti gli altri rapporti BRET corretti per dare i rapporti BRET corretti. </li><li> Per ciascuno dei rimanenti gruppi di rapporti BRET corretti, la media dei valori delle tre pozzi trasfettate avere un rapporto BRET finale. </li></ol>

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	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il design dei costrutti di espressione della proteina di fusione è un passo fondamentale nella creazione del test BRET. Negli esperimenti presentati qui, le proteine ​​di interesse sono stati fusi al C-terminale della luciferasi o YFP. E &#39;anche possibile, e può essere necessario, per fondere le proteine ​​al N-terminale della luciferasi / YFP. Per alcune proteine, le fusioni possono essere accettate solo sia la N-o C-terminale al fine di evitare interruzioni della struttura e funzione delle proteine. Inolt...

Sia il collegamento classica e sequenziamento di prossima generazione analisi dei disturbi umani stanno rivelando la rilevanza clinica delle proteine ​​coinvolte in una serie di percorsi biologici. E &#39;spesso il caso che, prima della loro identificazione in tali studi, c&#39;è stata poca o nessuna indagine del ruolo biologico di queste proteine. Una via ancora da cominciare ad esplorare la funzione biologica di una proteina di interesse è quello di identificare quali altre proteine ​​interagisce con nel suo contesto fisiologico. Caratterizzare reti molecolari in questo modo fornisce approfondimenti sui percorsi biologici alla base del fenotipo umano. Lo screening su larga scala più frequentemente utilizzato approcci per l&#39;identificazione di partner di interazione candidati per le proteine ​​di interesse sono il lievito di screening del doppio ibrido 1 e massa proteomica basata spettrometria-2. Questi metodi possono essere molto efficace nel suggerire proteine ​​che interagiscono potenziali, ma arposta vulnerabile a risultati falsi positivi. Pertanto, la conferma di una interazione individuato da lievito doppio ibrido o lo screening spettrometria di massa richiede la convalida dell&#39;interazione con una seconda tecnica. In genere si utilizza un co-immunoprecipitazione o dosaggio pull-down per questo scopo 3. Uno svantaggio dell&#39;utilizzo di tali tecniche per la validazione è il requisito per la lisi delle cellule, che distrugge le condizioni intracellulari che possono essere essenziali per mantenere certe interazioni proteina. Un secondo svantaggio è che le interazioni deboli o transitori proteine ​​potrebbero essere disturbati durante le fasi di lavaggio. Inoltre, questi saggi richiedono hands-on tempo significativo, sono limitate nel numero di campioni che possono essere elaborati simultaneamente, e spesso richiedono l&#39;ottimizzazione in termini di tempo di reagenti e protocolli. Per superare alcuni dei problemi associati con esperimenti di co-immunoprecipitazione, diverse analisi sono stati sviluppati sulla base fluorescente e bioluminescent proteine ​​che possono essere utilizzati in cellule vive. I primi tali saggi erano basati su fluorescenza (o Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), il trasferimento non radiativo di energia tra due proteine ​​fluorescenti con sovrapposizione di emissione e spettri di eccitazione 4. L&#39;efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, quindi osservazione del fenomeno FRET richiede che i fluorofori donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse, una proteina è espressa come una fusione con il fluoroforo donatore (proteina fluorescente comunemente ciano; PCP) e la seconda come una fusione con il fluoroforo accettore (proteina fluorescente comunemente giallo; YFP). L&#39;interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare i fluorofori donatore e accettore sufficientemente vicini per il trasferimento di energia si verifichi, che si tradurrà in un aumento misurabile l&#39;emissione di luce da accettore YFP relativa al donatore PCP. FRET è riuscita a individuare le interazioni proteina-proteina in cellule vive 4. Lo svantaggio principale di utilizzare FRET per rilevare le interazioni proteina-proteina è il requisito per illuminazione esterna per l&#39;eccitazione del fluoroforo donatore. Risultati illuminazione esterna in alta sfondo nel segnale di emissione, di eccitazione indesiderata della accettore, e photobleaching del donatore e del fluorofori accettore. Questi effetti riducono la sensibilità del saggio per rivelare le interazioni proteina-proteina. Una modifica del dosaggio FRET che supera il problema di fondo elevato di illuminazione esterna è la bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET) dosaggio 5,6. Nel sistema di BRET il fluoroforo donatore viene sostituito da un enzima luciferasi. Così l&#39;energia per l&#39;eccitazione del fluoroforo accettore viene generato all&#39;interno del sistema per ossidazione di un substrato di luciferasi, rendendo inutile illuminazione esterna. Nella piùconfigurazione comune di questo test, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l&#39;accettore è YFP (per una discussione di donatore alternativo e proteine ​​accettore vedere Pfleger et al. 5). Di conseguenza, in questo sistema, una proteina di interesse è fuso ad una proteina luciferasi e potenzialmente interagenti per YFP, o viceversa. La prova BRET richiede l&#39;aggiunta di coelenterazina come substrato per la luciferasi. Poiché coelenterazina è cellula-permeabile, è possibile effettuare saggi BRET in cellule vive. Tuttavia, coelenterazina nativo è instabile in soluzione acquosa, e la ripartizione enzima-indipendente di coelenterazina sia riduce la concentrazione di substrato disponibile per il dosaggio e genera autoluminescence, che riduce la sensibilità di misurazione dell&#39;attività di luciferasi. L&#39;uso di BRET in cellule vive è stata facilitata dallo sviluppo di coelenterazines protette, che sono stabili in soluzione acquosa, ma vengono scisse da esterasi citosolicos dopo la diffusione attraverso la membrana cellulare per generare coelenterazina attiva all&#39;interno della cella 7. Dopo l&#39;aggiunta di substrato di cellule che esprimono proteine ​​YFP-fusione-luciferasi, e il trasferimento di energia derivante da interazioni proteina-proteina viene quantificata attraverso il monitoraggio delle emissioni di luciferasi e YFP. Poiché le interazioni proteina possono essere monitorati direttamente in cellule vive in piastre multi-pozzetto, il saggio BRET costituisce un metodo semplice e scalabile per la convalida interazioni putativi che costo e in tempi rapidi. Oltre a convalidare putativi interattori identificati in studi di screening proteomica, il sistema di BRET può essere utilizzato anche per interattori prova candidati derivanti da precedenti studi biochimici e strutturali sulla proteina di interesse. Una volta stabilita l&#39;esistenza di una interazione proteina-proteina (utilizzando la prova BRET o con altre tecniche), esiste il potenziale per la prova BRET sia empnon legato per caratterizzare ulteriormente l&#39;interazione. Ad esempio, le regioni interagenti possono essere mappati generando versioni troncate di proteine, e il coinvolgimento di specifici residui nell&#39;interazione possono essere dimostrati creando mutazioni puntiformi. Inoltre, l&#39;effetto modulatorio di modifiche post-traduzionali o piccole molecole (ad esempio farmaci o ligandi) sulle interazioni proteina-proteina può essere indagata 8-10. Il test BRET ha anche un grande potenziale per lo studio mutazioni identificate nel DNA del paziente. Nei casi in cui è stato stabilito un ruolo causativo per una mutazione, studiando l&#39;effetto della mutazione sulle interazioni proteina-proteina mediante BRET può rivelare più sulla eziologia molecolare del fenotipo 11. Con l&#39;avvento delle metodologie di sequenziamento di prossima generazione, è sempre più comune per le diverse mutazioni potenzialmente dannosi per l&#39;identificazione all&#39;interno di un individuo, nel qual caso non è chiaro quali sono relenenti al fenotipo 12. In questa situazione la prova BRET può essere utile nel valutare l&#39;impatto di mutazioni sulla funzione della proteina e quindi la loro rilevanza per il disturbo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

Le prove basate sul trasferimento bioluminescenza Resonance Energy (BRET) forniscono un mezzo sensibile e affidabile per monitorare le interazioni proteina-proteina in cellule vive. BRET è il trasferimento non radiativo di energia da un &#39;donatore&#39; enzima luciferasi ad una proteina fluorescente &#39;accettore&#39;. Nella configurazione più comune di questa analisi, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l&#39;accettante è proteina fluorescente gialla (YFP). Poiché l&#39;efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, osservazione del fenomeno BRET richiede che il donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse in cellule di mammifero in coltura, una proteina è espressa come una fusione con luciferasi e la seconda come una fusione con YFP. L&#39;interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare il donatore e accettore sufficientemente stretto per trasferimento di energia a verificarsi. Rispetto ad altre tecniche per indagare proteina-proteina ininterazioni, il saggio BRET è sensibile, richiede poca hands-on tempo e poche reagenti, ed è in grado di rilevare le interazioni che sono deboli, transitori, o dipendente per l&#39;ambiente biochimico trovato all&#39;interno di una cella dal vivo. E &#39;quindi un approccio ideale per la conferma interazioni putativi suggeriti da lievito two-hybrid o spettrometria di massa proteomica studi, e in aggiunta è particolarmente adatto per le regioni mappatura interagire, valutando l&#39;effetto di modificazioni post-traduzionali sulle interazioni proteina-proteina, e valutare l&#39;impatto delle mutazioni identificate nel DNA paziente.

Il principio della prova BRET è illustrato nella Figura 2. Il setup dosaggio utilizzato nel corso degli esperimenti presentati qui è mostrata in Figura 3. L&#39;individuazione di un forte segnale BRET da cellule trasfettate con una proteina di fusione luciferasi-YFP confermato che il trasferimento di energia era osservabile in questa configurazione sperimentale (Figura 4). La nostra ricerca si concentra sul ruolo della famiglia FOXP di rep...

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Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Le interazioni tra le proteine ​​sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l&#39;interazione fra una coppia di proteine ​​può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Views.  Max Planck Institute for Psycholinguistics.  Le interazioni tra le proteine ​​sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l'interazione fra una coppia di proteine ​​può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati. 

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Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidica Co-coltura di cellule epiteliali e batteri per le indagini solubile del segnale mediato da Interazioni

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Ricerca

Biologia

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...