Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio McMahon per la loro assistenza e sostegno. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni provenienti da un NIH / NCI R01 CA176839-01 (MM) e un Premio di Ricerca Istituzionale and Academic Career Development (IRACDA a JS).

1. Preparazione dei lisati cellulari intero di coltura cellulare <ol><li> Posizionare cellule di coltura piatti su ghiaccio e aggiungere PBS freddo con 5 mM EDTA (es. 5 ml di PBS con 5 EDTA/10 mm cm 2 piastra). Rimuovere le cellule aderenti dal piatto usando un raschietto cellulare e poi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml freddo. </li><li> Agglomerare le sospensioni di cellule per centrifugazione a bassa velocità a 1000 rpm (230 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Mettere tubi conici su ghiaccio e aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di PBS con 5 mM EDTA e trasferire sospensione cellulare ad un raffreddore 1,5 ml provetta da centrifuga. Sospensione giro veloce a 13.000 rpm (13.226 xg) per 10 secondi a pellet cellule. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare i tubi pellet e posto sul ghiaccio. </li><li> Risospendere il pellet in 25-200 ml (a seconda delle dimensioni del pellet, cioè per 3 x 10 6 cellule aggiungere ~ 150 ml di tampone RIPA) inTampone RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% sodio desossicolato, 1% NP-40) contenente proteasi appena aggiunto e inibitori di fosfatasi ad una concentrazione finale 2x. Brevemente vortice ogni provetta e incubare sospensione per 20-30 minuti in ghiaccio. Nota: ci sono diversi buffer di lisi che possono essere utilizzati per estrarre proteine, che differiscono nella loro capacità di solubilizzare le proteine ​​e la forza della loro detersivo denaturazione (cioè SDS, Triton X-100, o NP-40). RIPA buffer è utile per la preparazione di lisati cellulari totali e interrompere le interazioni proteina-proteina. </li><li> Per creare una frazione post-nucleare, lisati centrifuga a 14.000 rpm (15.339 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta senza interrompere il pellet e posizionare i tubi nucleare arricchito su ghiaccio. Nota: il pellet nucleare arricchito può anche staccare dal tubo durante l&#39;estrazione del surnatante. Per evitare di raccogliere il pellet nucleare arricchito, posizionare la punta della pipetta direttamente into il pellet nucleare arricchito viscoso e tirarla su con la pipetta, al fine di disporne. </li><li> Determinare le concentrazioni di proteine ​​di ciascun campione secondo le istruzioni del costruttore, utilizzando tali dosaggi della proteina di quantificazione come BCA o Bradford. </li></ol> 2. Preparazione del campione e elettroforesi <ol><li> Preparare ogni campione in base alla seguente tabella descritto di seguito. In alternativa, β-mercaptoetanolo può anche essere utilizzato ad una concentrazione finale di 2,5%. Tuttavia, l&#39;agente riducente deve essere aggiunto a ciascun campione fino a un&#39;ora prima di caricare il gel. I conti del volume totale delle variazioni di pipettaggio con soli 20 ml di ogni campione preparato caricati per bene. <table border="1"><tbody><tr><td> REATTIVO </td><td> CAMPIONE RIDOTTO </td></tr><tr><td> Protein Sample </td><td> X microlitri </td></tr><tr><td> 4x LDS Sample Buffer </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> 500 nM DTT Reducing agente </td><td> 2.4 microlitri </td></tr><tr><td> L&#39;acqua deionizzata </td><td> Fino a 15.6 ml </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 24 microlitri </td></tr></tbody></table></li><li> Campioni di calore a 70 ° C per 10 min. Mentre i campioni sono il riscaldamento, preparare 1.000 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa (50 ml 20x MES o MOPS tampone di corsa più 950 ml di acqua deionizzata). MOPS tampone di corsa risolve proteine ​​di medie dimensioni tra 14-200 kDa, mentre MES tampone di corsa si risolve più piccole proteine ​​di peso molecolare tra 2-200 kDa con un pKa inferiore, che permette il MES tampone di corsa per correre più veloce rispetto alle MOPS 4. Pertanto, questi due buffer hanno effetti sulla migrazione di ioni all&#39;interno del gel di impilamento che porta a differenze nella separazione delle bande proteiche 4 contrastanti. Mettere da parte e unire 200 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa con 500 ml di antiossidanti, che saranno utilizzati per riempire il buffer Sezione del Min SuperioreUnità di elettroforesi i-Cell. </li><li> Una volta che i campioni sono finiti riscaldamento, campioni giro veloce prima di immetterli sul ghiaccio. </li><li> Per il montaggio dei prefabbricati gel Bis-Tris nell&#39;unità di Mini-Cell per elettroforesi seguire le istruzioni del produttore. Nota: assicurarsi che ogni gel è orientata in modo tale che il più breve (minore) cassette di ogni gel rivolto verso l&#39;interno verso il Buffer Core e gel sono di livello e ben premuto contro il buffer core per evitare perdite dal Buffer Camera Alta. </li><li> Riempire il Buffer Camera Alta con 200 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa contenente la antiossidante e Buffer Camera dell&#39;unità Mini-Cell con circa 600 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa inferiore. I supplementari 200-300 ml di tampone di corsa possono essere salvate per un uso successivo. Tuttavia, non è consigliabile per riciclare il buffer utilizzato durante la corsa elettroforetica come il pH e la qualità del buffer possono essere modificati. </li><li> Caricare 20 ml di ogni samp proteinele in ogni pozzetto. Se sezionare la membrana in varie strisce, al fine di verificare la presenza di anticorpi multipli (cioè più di 2), si consiglia vivamente di caricare 2-5 microlitri della norma proteina prestained nel primo e ultimo pozzetti di ogni gel come questo servirà come guide di taglio per separare le varie sezioni della membrana senza influenzare la rappresentazione delle bande proteiche. </li><li> Gel funzionare a 200 V costante per 35 min con una corrente previsto di 110-125 mA / gel all&#39;inizio e 70-80 mA per gel alla fine. L&#39;elettroforesi è completa quando il colorante inseguimento migra verso il filo di platino lungo il buffer core. </li></ol> 3. Proteina di trasferimento Uso del Blotting sistema iBlot Dry <ol><li> Completamente separare i mini-gel rompendo le parti incollate della cassetta (puo &#39;produrre un rumore crepitante). Eliminare il corto (piccolo) piastra e trasferire accuratamente il gel dalla più lunga (intaglio), piastra in un contenitore con acqua deionizzata erimuovere la parte spessa zampe del gel trova nella parte inferiore. Nota: in rari casi, il gel può allegare alla piastra inferiore invece della più lunga, intaglio piatto. In questo caso, scartare il più lungo, piastra scanalata e rimuovere la parte spessa zampe del gel trova nella parte inferiore. Poi, trasferire accuratamente il gel dalla piastra inferiore di acqua deionizzata. </li><li> Montare l&#39;anodo e catodo trasferimento pile secondo le istruzioni del produttore. Nota: entrambi nitrocellulosa o PVDF membrane di fornire alta qualità ed efficiente trasferimento delle proteine ​​e sono compatibili con la rilevazione fluorescente 8. Tuttavia, membrana PVDF ha una elevata capacità di legame (240 g / cm 3) di nitrocellulosa (200 g / cm 3) 8. </li><li> Rimuovere accuratamente eventuali bolle o aria intrappolata tra il gel e la membrana in modo da evitare qualsiasi distorsione delle bande proteiche durante il trasferimento. Nota: non tagliare la membrana o il trasfer impilare per misura il vostro formato gel come questo farà sì che il contatto diretto tra anodo e catodo stack. </li><li> Dopo aver montato correttamente le pile di trasferimento sul dispositivo assorbente asciutto, selezionare il programma tensione appropriata (ad esempio Programma 3: 20 V per 7 min) e iniziare il trasferimento. Nota: proteine ​​superiore a 150 kDa tendono migrare più lentamente e possono richiedere un tempo più lungo di trasferimento 8-10 min. Inoltre, prima incubazione del gel in etanolo al 20% per 5-10 min contribuirà anche a migliorare l&#39;efficienza di trasferimento di queste grandi proteine. Una volta che il programma di trasferimento è completo, il dispositivo si spegne automaticamente la corrente. È meglio rimuovere immediatamente la membrana e procedere con la procedura di blocco per garantire una migliore rilevazione delle proteine ​​ed evitare di seccare la membrana. </li></ol> 4. La rilevazione infrarossa proteina fluorescente <ol><li> Membrana Block (s) in un minimo di 0,8 ml / cm 2 di Odyssey Blocking Buffer (non aggiungere Tween-20) per 1 ora onotte a 4 ° C. Membrana (s) può anche essere bloccato con latte in polvere senza grassi, ma puo causare alto sfondo ed interferire con il rilevamento di proteine. </li><li> Incubare membrana (s) in anticorpo primario alla concentrazione desiderata in Odyssey tampone di bloccaggio con 0.1% Tween-20 notte a 4 ° C. Per il rilevamento di due colori, in cui due antigeni differenti vengono visualizzati sullo stesso blot, i due anticorpi primari devono essere derivati ​​da diverse specie ospiti e aggiunte contemporaneamente alla membrana (s). Nota: prima dell&#39;incubazione la membrana (s) in anticorpo primario, la membrana (s) può essere sezionato in vari pezzi, al fine di rilevare anticorpi multipli (cioè più di 2) sulla stessa membrana. </li><li> Lavare membrana (s) 3x per 10 min in TBS più 0,1% Tween-20 con un leggero scuotimento. </li><li> Incubare membrana (s) con gli anticorpi secondari fluorescenza marcata ad una diluizione di 1:20.000 per il canale 700 nm e 1:6,000-1:10,000 per il canale 800 nm in Odyssey tampone di bloccaggio con 0.1% Tween-20 per 30-60 min (incubando membrana (s) per più di 1 ora può aumentare background). Proteggere membrana (s) dalla luce. Nota: gli anticorpi secondari devono essere ottenuto dalla stessa specie ospiti ciascuno degli anticorpi primari e marcato con differenti fluorofori. </li><li> Lavare membrana (s) 3x per 10 min in TBS più 0,1% Tween-20 con un leggero scuotimento. Proteggere membrana (s) dalla luce. </li><li> Membrane (s) può essere essiccato o conservato sia in TBS o PBS senza Tween-20 a 4 ° C fino digitalizzato e ripreso con un sistema di imaging a raggi infrarossi. Segnale fluorescente rimane stabile per diversi mesi se adeguatamente protetto dalla luce. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I passaggi critici nella generazione di alta qualità, macchie occidentali quantitativi in ​​base a questo protocollo sono i seguenti: 1) misurare le concentrazioni di proteine, 2) la preparazione del campione; 3) bloccando la membrana e, 4) qualità e calibro dell&#39;anticorpo primario. La precisione della misurazione delle concentrazioni di proteine ​​totali può avere un impatto importante sulla quantificazione bande proteiche in quanto la eccezionale sensibilità di rilevazione ...

<html> La tecnica del Western blotting è stato sviluppato tra il 1977 e il 1979 al fine di creare un metodo migliore per rilevare proteine ​​utilizzando anticorpi 1-3. Questa procedura utilizzata trasferimento elettroforetico delle proteine ​​di membrane da gel SDS-PAGE con proteine ​​bersaglio visualizzati usando anticorpi secondari e rilevati mediante autoradiografia, luce UV, o un prodotto di reazione perossidasi 3. Così, questi stessi principi di base sono ancora ampiamente utilizzati in protocolli di Western blot di oggi. Tuttavia, questa tecnica classica Western blotting fa presenti molti svantaggi, quali tempi lenti corsa elettroforetica, bassa risoluzione e bande proteiche artificiali, suscettibilità alla degradazione delle proteine, e limitata sensibilità nonché scarsa qualità dei dati 4. Pertanto, questo protocollo descrive progressi e miglioramenti significativi alla procedura di Western Blot standard che genera dati qualitativi e quantitativi più precisi. &quot;&gt; Il sistema di Laemmli per separare una vasta gamma di proteine ​​mediante SDS-PAGE è il sistema gel più utilizzato per Western blotting 5. Nonostante la popolarità di questo sistema di Western blotting, questo metodo può portare a una distorsione band, perdita di risoluzione, e bande spurie 4. Questa può essere una conseguenza della deaminazione e alchilazione di proteine ​​a causa del pH elevato (9.5) del gel di separazione, riossidazione di legami disolfuro ridotto grazie alla variabile di stato redox del gel e scissione di aspartil-prolil prestiti stessi al riscaldamento della proteina in tampone Laemmli (pH 5,2) 4,6 peptidici. Il sistema gel Bis-Tris, che opera ad un pH neutro (7.0), fornisce vantaggi significativi rispetto al sistema Lamemmli. Questo sistema migliora la stabilità della proteina, minimizza modificazioni delle proteine, mantiene le proteine ​​nei loro stati ridotti, impedisce aspartyl-prolyl scissione durante l&#39;elettroforesi, e, soprattutto, il tempo di elettroforesi familiare è 35 min 4,6,7. Inoltre, tSistema di gel lui Bis-Tris produce anche fasce più nitide, maggiore risoluzione e separazione, e una maggiore sensibilità conseguente dati più affidabili 4. In combinazione con il sistema gel Bis-Tris, il sistema blotting secco iBlot utilizza alta intensità di campo e le correnti di ridurre significativamente il tempo di trasferimento delle proteine ​​dal gel su membrane in 7 min 8. Questo sistema di trasferimento si basa sul metodo blotting secco che genera un trasferimento più efficiente e affidabile di proteine ​​8. Per un confronto dettagliato dell&#39;efficacia del sistema di trasferimento iBlot ai sistemi di trasferimento convenzionali consultare il seguente sito web: <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Si utilizza uno stack anodo e catodo, che sono costituiti da una matrice di gel contenente i buffer di trasferimento appropriate, che fungono da serbatoi di litio 8. Durante il trasferimento, elettrolisi dell&#39;acqua aiuta a prevenire la generazione di ossigeno dall&#39;anodo rame conseguente trasferimento proteina più coerente senza causare distorsioni banda 8. Inoltre, questo sistema di trasferimento aumenta anche la velocità di trasferimento riducendo la distanza tra gli elettrodi 8. Anche se chemiluminescenza è la tecnica più comune e tradizionale per la rilevazione della proteina di Western Blot analisi, rilevazione fluorescente a raggi infrarossi a due colori migliora notevolmente la sensibilità, la qualità e l&#39;accuratezza dei dati Western Blot. Questo metodo di rilevamento utilizza infrarossi eccitazione laser in due lunghezze d&#39;onda ottimali, 700 nme 800 nm, per generare un&#39;immagine chiara dati con il massimo rapporto segnale-rumore e massima sensibilità 9. Così, due proteine ​​bersaglio possono essere visualizzate contemporaneamente sulla stessa membrana utilizzando il 700 nm e 800 nm canali di rilevamento fluorescenti. Ancora più importante, la linearità e la gamma dinamica di fluorescenza a raggi infrarossi permette di precisa analisi quantitativa sia forti e deboli bande proteiche 9. Inoltre, questo protocollo fornisce enormi vantaggi e miglioramenti rispetto alla classica tecnica Western blotting diminuendo l&#39;elettroforesi e tempi di trasferimento di questo esperimento senza compromettere l&#39;efficacia di questi processi e utilizzando rilevazione proteina fluorescente infrarosso per produrre maggiori dati di Western blot qualitativi e quantitativi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

Le tecniche di Western Blot che sono stati originariamente stabiliti alla fine del 1970 sono ancora attivamente utilizzati oggi. Tuttavia, questo metodo tradizionale di Western blotting ha diversi inconvenienti che includono risoluzione bassa qualità, bande spurie, diminuita sensibilità e integrità proteina poveri. I recenti progressi hanno drasticamente migliorato numerosi aspetti del protocollo Western Blot standard per la produzione di dati qualitativi e quantitativi più elevati. Il sistema gel Bis-Tris, in alternativa al sistema Laemmli convenzionale, genera una migliore separazione delle proteine ​​e risoluzione, mantiene l&#39;integrità proteine, e riduce elettroforesi per un tempo di 35 min di esecuzione. Inoltre, il sistema blotting secco iBlot, migliora notevolmente l&#39;efficacia e la velocità di trasferimento proteina alla membrana in 7 min, che è in contrasto con i tradizionali metodi di trasferimento proteine ​​che sono spesso più inefficiente con lunghi tempi di trasferimento. In combinazione con queste modifiche altamente innovative, proteine ​​detection utilizzando risultati di imaging fluorescente infrarosso in qualità superiore, più accurato e dati coerenti rispetto alla tecnica Western blotting tenore di chemiluminescenza. Questa tecnologia può rilevare simultaneamente due antigeni differenti sullo stesso membrana utilizzando due colori coloranti vicino infrarosso che vengono visualizzati in canali fluorescenti differenti. Inoltre, la linearità e la gamma dinamica di immagini fluorescenti consente per la quantificazione precisa di bande proteiche sia forti e deboli. Così, questo protocollo descrive i principali miglioramenti al classico metodo di Western blotting, in cui questi progressi aumentano notevolmente la qualità dei dati riducendo notevolmente il tempo di esecuzione di questo esperimento.

Due colori di fluorescenza a raggi infrarossi rileva bande sia forti e deboli sulla stessa membrana con una maggiore sensibilità e il più alto rapporto segnale-rumore per produrre immagini chiare di Western blot. I risultati tipici generati da due colori rilevamento Western blot visualizzato sia nel 700 nm e 800 nm canali fluorescenti sono esemplificati nelle figure 1 e 2. Il Western blot superiore nella Figura 1 mostra la concomitante (overlay) rivelazione di totale ...

Watch this Scientific Journal Video about The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis at JoVE.com

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Questo protocollo esplora le ultime innovazioni in esecuzione di analisi di Western Blot. Queste nuove modifiche impiegano un sistema gel Bis-Tris con elettroforesi eseguire tempo 35 min, un sistema di trasferimento blotting secco 7 min, e infrarossi rilevamento proteina fluorescente e di imaging che genera maggiore risoluzione, qualità, sensibilità e maggiore precisione dei dati occidentali.

Il più veloce occidentale in città: un tocco contemporaneo alla classica analisi Western Blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

the-fastest-western-town-contemporary-twist-on-classic-western-blot

Research

JoVE Journal

Biology

26.9K Views.  University of California, San Francisco.  Questo protocollo esplora le ultime innovazioni in esecuzione di analisi di Western Blot. Queste nuove modifiche impiegano un sistema gel Bis-Tris con elettroforesi eseguire tempo 35 min, un sistema di trasferimento blotting secco 7 min, e infrarossi rilevamento proteina fluorescente e di imaging che genera maggiore risoluzione, qualità, sensibilità e maggiore precisione dei dati occidentali. 

Video: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western Blotting Utilizzando il Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Ricerca

Biologia

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Induzione chirurgica di Idrope endolinfatico da Obliterazione del dotto endolinfatico

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Trasformazione Floral-Dip di lino (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Per generare transgenici progenie con una trasformazione Tasso alta

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d&#39;onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Imaging il traffico intracellulare di APP con GFP fotoattivabile

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...