Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Bill e Melinda (Grant 53.085), la Fondazione JR Oishei, e The American Lung Association (Grant RG-123721-N) per APH, e NIH (NIDCD) borsa di studio F31DC011218 di EAC.

1. Preparazione di colture batteriche <ol><li> Crescente cultura per l&#39;uso negli esperimenti <ol><li> In un blocco di riscaldamento a 37 ° C, scongelare un gelato di stock fiala di S. pneumoniae e aggiungere il contenuto di 9 ml di fresco, preriscaldata Todd-Hewitt brodo con estratto di lievito 0,5% (THY) per un volume totale di 10 ml in una provetta di coltura di vetro. </li><li> Incubare staticamente a 37 ° C fino a che la coltura raggiunga fase mid-log (Abs 600nm ≈ 0.5-0.6). </li></ol></li></ol> 2. Rilevamento depolarizzazione della membrana e rottura <ol><li> Reagenti Preparazione <ol><li> Preparare uno stock di 50 micron di DiBAC 4 (3) in 100% DMSO, e 2 mg / ml magazzino di PI in DDH 2 O. Il DiBAC 4 (3) stock è stabile a -20 ° C per almeno 6 mesi. Il PI azione è stabile a 4 ° C per almeno 6 mesi. </li><li> Avvolgere le scorte in fogli per proteggere dalla luce. </li></ol></li><li> Caricamentobatteri <ol><li> Agglomerare le cellule batteriche dal punto 1.2.2 mediante centrifugazione a 2400 xg per 10 min a temperatura ambiente e lavata due volte eliminando il surnatante, risospendere il pellet in 10 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), e centrifugare nuovamente a 2.400 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in PBS al volume originale. Ciò fornirà per circa 10 8 unità formanti colonia di batteri per ml. Rimuovere 1 ml (sufficiente per 5 campioni) delle cellule lavate e posto in una provetta. </li><li> Per queste cellule, aggiungere 25 ml di una soluzione 1 M sterilizzata per filtrazione magazzino di glucosio (preparata in DDH 2 O e filtrato attraverso un filtro da 0,45 micron) per una concentrazione finale di 25 mM di glucosio, e incubare una piastra riscaldante a 37 ° C per quindici minuti. NOTA: Questo fornisce energia per tutti i canali di membrana ATP-dipendenti e componenti cellulari. La necessità di questo passaggio può variare, a seconda dell&#39;esperimento. </li><li> Aggiungere 5 ml di 50 mM DiBAC 4 (3) stock e 10 ml di 2 mg / ml PI magazzino. Questo prevede concentrazioni finali di 250 Nm e 20 mcg / ml, rispettivamente. Mescolare accuratamente pipettando su e giù parecchie volte. Aggiungere 200 ml di questa sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una chiara piastra a 96 pozzetti. </li></ol></li><li> Rilevamento della fluorescenza <ol><li> Posto piatto in un (37 ° C) lettore di piastre di rilevazione di fluorescenza preriscaldata. </li><li> Assicurarsi che i filtri siano in atto adeguate per DiBAC 4 (3) (490 nm di eccitazione, emissione 516 nm) e PI (535 nm di eccitazione, emissione 617 nm) di rilevamento. </li><li> Per consentire (e contemporaneamente monitorare) equilibratura di DiBAC 4 (3) sopra la membrana, impostare il lettore a prendere misure di fluorescenza ogni min circa 30-40 minuti, o fino a quando la lettura si stabilizza, questo serve come una lettura &quot;pretrattamento&quot;. </li><li> Espellere piastra e aggiungere l&#39;agente sperimentale di scelta e immediately posizionare la piastra posteriore nel lettore a continuare a monitorare DiBAC 4 (3) e PI fluorescenza per il tempo desiderato. Se il trattamento di diversi campioni alla volta, usando una pipetta multicanale può essere utile aggiungere l&#39;agente simultaneamente a tutti i pozzetti. </li><li> Esportare le letture di un programma di analisi dati, ad esempio Microsoft Excel. Fluorescenza Plot nel corso del tempo per valutare depolarizzazione della membrana e la rottura. L&#39;aumento di fluorescenza di DiBAC e PI indica che la depolarizzazione e la rottura si verificano. </li></ol></li></ol> 3. Rilevamento Variazioni intracellulare Ca 2 + o K + concentrazioni <ol><li> Preparazione dei reagenti e tampone di caricamento <ol><li> Preparare i seguenti reagenti: 5 stock mM del colorante fluorescente sensibile agli ioni (Fura-2/AM o PBFI / AM, aggiungere la giusta quantità di DMSO ad una provetta contenente 50 mg del colorante), &quot;100x&quot; probenecid (aggiungere 1 ml di PBS per una fiala 77 mg). Il solubilizzatocoloranti possono essere congelati a -20 ° C una volta e sono stabili in soluzione per 3 mesi, mentre il probenecid è stabile in soluzione a -20 ° C per 6 mesi. </li><li> Preparare 1 ml di 2x Loading Buffer come segue: Nel fondo di una provetta di plastica da 15 ml, 20 ml di dispensare 100x PowerLoad concentrato (stabili a 2-8 ° C per 6 mesi), seguiti da 2 microlitri dello ione 5 mM sensibile colorante direttamente nel PowerLoad. Vortex brevemente per mescolare. Aggiungere 960 ml di PBS seguita da 20 ml di 100x probenecid. Agitare la miscela un&#39;ultima volta. Avvolgere nella pellicola per proteggerlo dalla luce. </li></ol></li><li> Caricamento dei batteri con la tintura <ol><li> Pellet e lavare la coltura batterica fase di mid-log, come descritto al punto 2.2.1. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 5 ml di PBS per ottenere una sospensione cellulare &quot;2x&quot;. </li><li> Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare 2x alla 2x Loading Buffer. Ciò fornirà un volume finale di 2 ml e Concentrazione finalezioni di 1x PowerLoad, 5 micron colorante fluorescente, e 1x probenecid. NOTA: Questa sospensione fornisce abbastanza volume per 10 campioni poiché ogni bene campione per la misura conterrà 200 ml. </li><li> Incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 75 min, al riparo dalla luce. NOTA: Il colorante viene caricato in cellule batteriche in assenza di substrati glicolitico e in presenza di probenecid per minimizzare efflusso del colorante. </li><li> LAVAGGIO 1: agglomerare le cellule per centrifugazione a 2.400 xg per 10 min, rimuovere il surnatante e risospendere in 2 ml di PBS contenente probenecid 1x. WASH 2, 3: Ripetere il passaggio 3.2.4 2x. Incubare a 37 ° C per altri 30 minuti. Questo consentirà di avere tempo per esterasi batteriche di idrolizzare il gruppo estere AM lontano dai coloranti fluorescenti interiorizzati. </li><li> LAVAGGIO 4: agglomerare le cellule per centrifugazione a 2.400 xg per 10 min, rimuovere il surnatante e risospendere in 2 ml di PBS contenente probenecid 1x. NOTA: A seconda del experiment, il glucosio può essere aggiunto di nuovo qui per ri-energizzare i batteri. </li></ol></li><li> Rilevamento della fluorescenza <ol><li> Preriscaldare il lettore di piastre piastra-reader rivelazione di fluorescenza a 37 ° C. </li><li> Per ogni campione desiderata, aggiungere 200 microlitri di cellule caricate (dal punto 3.2.8) ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. (Eseguire le seguenti operazioni per il completamento di un bene / campione alla volta). </li><li> Per stabilire una linea di base per la lettura di un pozzo, piastra posto nella rilevazione della fluorescenza piastra-reader per misurare la fluorescenza (340 nm di eccitazione / 510 nm di emissione per il &quot;Valore 1&quot; e 380 nm di eccitazione / emissione 510 nm per &quot;Valore 2&quot;) a ogni secondo per un min. </li><li> Espellere piatto, aggiungere il trattamento di scelta per tale bene (in un piccolo volume di circa 5 ml), in modo rapido pipetta su e giù un paio di volte per mescolare, e subito mettere di nuovo nella rilevazione della fluorescenza piastra-reader per leggere ogni sec per lo desideri lunghezza di tempo. (Se l&#39;ininiettori associati al lettore di piastre sono disponibili, essi potrebbero essere utilizzati anche per aggiungere perfettamente il trattamento desiderato, eliminando la necessità di interrompere la lettura ed espellere la piastra). </li><li> Esportare le letture di un programma di analisi dati, ad esempio Microsoft Excel. Calcolare il rapporto dei valori di fluorescenza per ogni time-point dividendo valore 1 per Valore 2, e riportare i valori del rapporto su un grafico. </li></ol></li></ol> 4. Cambiamenti Rilevamento a pH intracellulare <ol><li> Preparazione dei reagenti e tamponi di calibrazione <ol><li> Preparare i seguenti reagenti: 5 stock mM di BCECF / AM (. Aggiungere la giusta quantità di DMSO ad una provetta contenente 50 mg del colorante stock è stabile a -20 ° C per 3 mesi); 100x probenecid (aggiungere 1 ml di PBS a un 77 mg fiala);. 1 stock mM preparazione di nigericin in etanolo (obbligatorio per equilibrare il pH intracellulare (pH i) delle cellule al pH del tampone circostante stock è sTavolo a -20 ° C per 6 mesi);. 0,5 magazzino mM di carbonile cianuro 3 chlorophenylhydrazone (CCCP) in DMSO (protonophore per disaccoppiare la forza motrice protonica stock è stabile a -20 ° C per 6 mesi) </li><li> Preparare 10 ml delle seguenti buffer di potassio: NaOH 135 mM KH 2 PO 4/20 mm (monobasico) e 110 K mM NaOH 2 HPO 4/20 mm (bibasico). Filtro sterilizzare usando un filtro di 0,45 micron. (Questi tamponi possono essere conservati a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso). </li><li> Mescolare i buffer di potassio in quantità necessaria per creare buffer di potassio con almeno 5-6 valori di pH variabili 6,5-8,0. </li><li> Preparare 1 ml di 2x Loading Buffer come segue: Nel fondo di una provetta di plastica da 15 ml, 40 ml di dispensare 100x PowerLoad, seguiti da 20 ml di 5 mM colorante sensibile agli ioni direttamente nel PowerLoad. Vortex brevemente per mescolare. Aggiungere 900 ml di PBS seguita da 40 ml di 100x probenecid. Vortex miscela un&#39;ultima volta. Avvolgere nella pellicola per proteggerlo dalla luce. </li></ol></li><li> Caricamento dei batteri con la tintura <ol><li> Pellet e lavare gli 8 ml di coltura batterica fase di mid-log come descritto al punto 2.2.1. Rimuovere il surnatante, risospendere pellet in 2 ml di PBS per ottenere una sospensione cellulare &quot;4x&quot;. </li><li> Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare 4x a 2x Loading Buffer. Ciò fornirà un volume finale di 2 ml e concentrazioni finali di cellule 2x, 2x PowerLoad, 50 pm colorante fluorescente e 2x probenecid. </li><li> Incubare in un bagno d&#39;acqua a 30 ° per 40 minuti, al riparo dalla luce. NOTA: Il colorante viene caricato nelle cellule batteriche alla temperatura inferiore di 30 ° C e in assenza di substrati glicolitici per minimizzare efflusso del colorante. </li><li> WASH 1: Pellet le cellule per centrifugazione a 2400 xg per 10 minuti, rimuovere il surnatante per sbarazzarsi di un eccesso di colorante, e risospendere in 4 ml di PBS contenente 2x probenecid unglucosio mM nd 1 (a rivitalizzare i batteri). LAVAGGIO 2, 3: Ripetere passaggio 4.2.7 due volte, con risospensione finale in 4 ml di PBS (per una concentrazione finale di cellule 1x) contenente 2x probenecid e glucosio 10 mM. </li><li> Incubare a 37 ° C per 5 min. Ciò consentirà alle cellule di eccitare completamente e consentire il tempo per esterasi batteriche per fendere il gruppo estere AM lontano dal BCECF interiorizzato. </li></ol></li><li> Stabilire fluorescenza di fondo e in curva di calibrazione vivo <ol><li> Preriscaldare il lettore di piastre piastra-reader rivelazione di fluorescenza a 37 ° C. </li><li> Per determinare la fluorescenza, filtro-sterilizzare circa 500 microlitri della sospensione batterica caricato e eccitato (dal punto 4.2.7) per rimuovere i batteri, e aggiungere 200 ml di filtrato al pozzetto della piastra a 96 pozzetti. </li><li> Posizionare placca nella rivelazione di fluorescenza piastra-reader per misurare la fluorescenza (eccitazione 490 nm / 530 nm di emissione per&quot;Valore 1&quot; e 440 nm di eccitazione / emissione 530 nm per &quot;Valore 2&quot;) per 1 min. Questa fluorescenza di fondo deve essere sottratto prima del calcolo dei coefficienti sia per la curva di calibrazione ei campioni sperimentali. </li><li> Per ottenere una curva di calibrazione in vivo, lavare 500 microlitri aliquote delle cellule caricati e alimentati dal punto 4.2.7 volta e risospendere in buffer di potassio a diversi valori di pH (che vanno 6,5-8,0). </li><li> Aggiungere 20 mM nigericin ai campioni per equilibrare il pH intracellulare delle cellule al pH del tampone circostante e incubare a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 200 ml di combinazioni tampone batteri / pH ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Posizionare placca nella rivelazione di fluorescenza piastra-reader per misurare la fluorescenza per pochi minuti per stabilire una lettura stabile per ciascun pozzetto. Esportare le letture di un programma di analisi dati, ad esempio Microsoft Excel. </li><li> Dopo aver sottratto il bavalori di fluorescenza SFONDO, calcolare il rapporto dei valori di fluorescenza dividendo valore 1 per Valore 2. Tracciare i valori del rapporto per ciascun tampone pH per creare la curva di calibrazione. (Una curva di calibrazione deve essere generato per ogni nuovo lotto di cellule caricate, come la quantità di colorante fluorescente che viene caricato nei batteri può variare ogni volta). </li></ol></li><li> Variazioni di misura di pH intracellulare <ol><li> Per ogni campione desiderato, aggiungere 200 ml di cellule caricate e tensione (dal punto 4.2.7) per i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Posizionare placca nella rivelazione di fluorescenza piastra-reader e misurare la fluorescenza dei campioni ogni 5 secondi per 5 min. </li><li> Estrarre la piastra e aggiungere 10 pM CCCP ad un pozzetto (serve come controllo positivo per la diminuzione del pH intracellulare) e l&#39;agente sperimentale (s) di interesse per gli altri pozzetti. Per confrontare con precisione i loro effetti nel corso del tempo, aggiungere la CCCP e agenti di scelta allo stesso tempo utilizzando amultichannel pipetta. </li><li> Restituire immediatamente la piastra alla piastra-reader e continua a misurare la fluorescenza ogni 5 secondi per 10 min. Come controllo aggiuntivo, espellere la piastra e aggiungere 20 pM Nigericina a tutti i campioni per equilibrare l&#39;i ​​pH dei batteri al pH del tampone circostante, e leggere per 5 min. </li><li> Dopo sottraendo i valori di fluorescenza di fondo, calcolare i rapporti di fluorescenza per ciascun campione. Interpolare la i pH per ogni lettura dalla curva di calibrazione. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+a+human+milk+protein.">Apoptosis induced by a human milk protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).</li><li>Hakansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+alpha-lactalbumin+with+bactericidal+activity+against+Streptococcus+pneumoniae.">A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae.</a> Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).</li><li>Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-Like+Death+in+Bacteria+Induced+by+HAMLET,+a+Human+Milk+Lipid-Protein+Complex.">Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex.</a> PLoS One. 6 (3), (2011).</li><li>Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+human+alpha-lactalbumin+induces+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+mitochondria.">A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria.</a> Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(&#916;&#968;+m)+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (&#916;&#968; m) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).</li><li>Dominguez, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+bacteria.">Calcium signalling in bacteria.</a> Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).</li><li>Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+and+sodium+transport+in+non-animal+cells:+the+Trk/Ktr/HKT+transporter+family.">Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family.</a> Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).</li><li>Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patch-clamp+study+of+Bacillus+subtilis.">A patch-clamp study of Bacillus subtilis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).</li><li>Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+composite+ion+channels+in+Bacillus+subtilis.">Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).</li><li>Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+cytometric+membrane+potential+measurement+in+bacteria+using+diethyloxacarbocyanine+and+a+ratiometric+technique.">Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique.</a> Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).</li><li>Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+analysis+of+antibiotic+effects+on+membrane+potential,+membrane+permeability,+and+bacterial+counts+of+Staphylococcus+aureus+and+Micrococcus+luteus.">Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+estimation+by+flow+cytometry.">Membrane potential estimation by flow cytometry.</a> Methods. 21 (3), 271-279 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+analysis+at+the+single-cell+level:+tasks+and+techniques.">Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques.</a> J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).</li><li>Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavior+of+oxonol+dyes+in+phospholipid+dispersions.">The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions.</a> Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).</li><li>Suzuki, H., Wang, Z. -. Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+transmembrane+potential+of+bacterial+cells+by+voltage-sensitive+dyes.">Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes.</a> Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).</li><li>Breeuwer, P., Abee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+membrane+potential,+intracellular+pH+and+respiration+of+bacteria+employing+fluorescence+techniques.">Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques.</a> Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).</li><li>Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+monitoring+of+antibiotic-induced+injury+in+Escherichia+coli+using+cell-impermeant+fluorescent+probes.">Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).</li><li>Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Initiation+Mechanism+of+Death+in+Streptococcus+pneumoniae+Induced+by+the+Human+Milk+Protein-Lipid+Complex+HAMLET+and+Activated+during+Physiological+Death.">A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death.</a> J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).</li><li>Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Streptococcus+pneumoniae+mutant+with+altered+electric+transmembrane+potential.">Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential.</a> J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).</li><li>Trombe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+calcium+porter+of+Streptococcus+pneumoniae+involved+in+calcium+regulation+of+growth+and+competence.">Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence.</a> J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).</li><li>Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+Staphylococcus+aureus+to+Methicillin+and+Other+Antibiotics+In+Vitro+and+In+Vivo+in+the+Presence+of+HAMLET.">Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET.</a> PLoS ONE. 8 (5), (2013).</li><li>Futsaether, C. M., Johnsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fura-2+to+measure+intracellular+free+calcium+in+Propionibacterium+acnes.">Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes.</a> Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).</li><li>Tisa, L. S., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+properties+of+Escherichia+coli+mutants+having+abnormal+Ca2++content.">Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content.</a> J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).</li><li>Werthen, M., Lundgren, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++mobilization+and+kinase+activity+during+acylated+homoserine+lactone-dependent+quorum+sensing+in+Serratia+liquefaciens.">Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens.</a> J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).</li><li>Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types.+Induction+of+transformation+by+a+dexoxyribonuceic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).</li><li>Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+of+Equine+Lysozyme+and+Oleic+Acid+with+Bactericidal+Activity+against.">A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against.</a> PLoS One. . 8, (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Nonostante la limitazione che presenta dimensioni per elettrofisiologia con metodi classici per rilevare variazioni di polarità e l&#39;integrità della membrana e variazioni nelle concentrazioni di ioni all&#39;interno batteri, abbiamo descritto un modo per misurare questi eventi in S. pneumoniae utilizzando coloranti fluorescenti. I nostri protocolli sono i primi nel loro genere descritto per il pneumococco e uno dei pochi descritto per specie batteriche in generale. Utilizzando un lettore di piastra di rile...

Il nostro laboratorio ha identificato un complesso proteico-lipidico del latte umano di nome HAMLET (for Human Alpha-lattoalbumina Fatto letale per le cellule tumorali) che induce apoptosi nelle cellule tumore, ma è anche in grado di uccidere una grande varietà di specie batteriche 1,2. Le specie che sono stati trovati per essere particolarmente sensibile erano quelli che colpiscono le vie respiratorie, con Streptococcus pneumoniae (pneumococco) visualizzando la massima sensibilità e un fenotipo simile all&#39;apoptosi di morte 2,3. Depolarizzazione della membrana e di ioni specifici eventi di trasporto sono ben descritti e eventi cruciali durante l&#39;apoptosi nelle cellule eucariotiche, particolari nei mitocondri, dove sono stati utilizzati radioattive + ioni TPP e coloranti fluorescenti, tra cui JC-1 e TMRE per dimostrare depolarizzazione della membrana mitocondriale 3 -5. Così, abbiamo cercato di saperne di più circa l&#39;effetto di HAMLET su queste caratteristiche di membrana correlate in pneumococco, come abbiamo concentrato i nostri sforzi persviluppare una migliore comprensione dei componenti meccanicistiche del fenotipo simile all&#39;apoptosi nei batteri, con un grande potenziale per identificare terapie antibatteriche o di nuovi vaccini candidati nel processo. Nel cercare di stabilire protocolli per i nostri studi meccanicistici, abbiamo scoperto che, contrariamente alla metodologia ben descritto in sistemi eucariotici, ci sono pochi studi pubblicati che descrivono elettrofisiologia e meccanismi di trasporto ionico della membrana batterica 6,7. Questo è principalmente attribuito alla dimensione più piccola di microrganismi e la loro architettura superficie, in particolare la presenza di parete cellulare, che limita l&#39;accessibilità della membrana per uso di metodi convenzionali come eucariotiche Patch di serraggio, anche se alcuni studi con protoplasti giganti sono stati eseguiti con successo mista 8,9. Come lavoro con questi protoplasti giganti non è un metodo ideale o anche pratico per la maggior parte delle specie batteriche poiché richiede uomobatteri ipulated in uno stato innaturale e abiotico, gli studi limitati di membrana batterica polarità che sono stati eseguiti hanno principalmente impiegato citofluorimetria e l&#39;uso di coloranti fluorescenti cianina e oxonol 10-16. Invece di citometria a flusso, che raccoglie le letture della fluorescenza singoli da un batterio ad un unico punto di tempo, abbiamo scelto di utilizzare un lettore di piastra di rilevamento di fluorescenza per rilevare l&#39;intensità di fluorescenza delle sospensioni batteriche in un formato a 96 pozzetti nel tempo. Questo ci ha consentito di trattare una popolazione di batteri in vari momenti con maggiore semplicità e facilità, e monitorare la cinetica di fluorescenza di tutta la popolazione per lunghi periodi di tempo, che è difficile da ottenere in citometria a flusso. Dopo aver testato una grande varietà di coloranti fluorescenti potenziali sensibili (fra cui quelli citati per l&#39;uso con i mitocondri), abbiamo ottenuto il miglior successo tecnico e pratico usando l&#39;bis-oxonol colorante chiamato DiBAC 4 (3) (bis-(acido 1,3-dibutylbarbituric) trimethine oxonol) per monitorare i cambiamenti di polarità. Abbiamo anche trovato prezioso per monitorare contemporaneamente interruzioni nella integrità della membrana con ioduro di propidio (PI). Questo colorante fluorescente in seguito al legame di acido nucleico, ma è solo in grado di fare in modo che quando l&#39;integrità della membrana batterica è compromessa, il che rende il componente popolare utilizzato per rilevare le cellule morte in saggi di colorazione vivi-morti. Oltre a PI, Sytox verde e TO-PRO-1 sono coloranti fluorescenti che sono simili in azione e sono stati precedentemente utilizzati per i batteri in pochi studi in citometria a flusso metodi di rilevamento 17. Abbiamo scelto di usare PI a causa della sua lunghezza d&#39;onda di eccitazione che ci ha permesso di monitorare la propria fluorescenza in concomitanza con DiBAC in un dato campione. Nei nostri studi, abbiamo osservato che AMLETO, così come un altro complesso proteina-lipide correlata con attività battericidanoto come Eloa, depolarizzazione indotta e rottura della membrana batterica come indicato dall&#39;aumento nel fluorescenza di entrambi i coloranti in seguito al trattamento del pneumococchi 3,18,26. Per entrambi i complessi, abbiamo osservato che l&#39;intensità di fluorescenza di DiBAC 4 (3) aumentata prima dell &#39;aumento di intensità di PI, indicando che depolarizzazione verificato prima della rottura ed è, quindi, un evento specifico indotta dai nostri complessi proteina-lipide battericida dei interesse. Questa distinzione è importante fare, come rottura della membrana stessa può causare depolarizzazione aspecifica. Cinetica misurare ed analizzare sia DiBAC 4 (3) e PI fluorescenza contemporaneamente ci ha permesso di esaminare questo rapporto tra i due eventi membrana, che è un ulteriore vantaggio di utilizzare fluorometria invece di citometria a flusso. Per monitorare flusso di ioni batterica, c&#39;è stato qualche successo precedente con l&#39;utilizzo di radioisotopi misura incluso l&#39;assorbimento di45 Ca 2 + nel pneumococco 19,20, che abbiamo usato anche nei nostri recenti studi 18, 21. Tuttavia, lavorando con questi ioni radioattivi ha diversi svantaggi. Possono essere costoso, richiede tempo, e disordinato, e può anche esporre la persona che esegue l&#39;esperimento a danneggiare, a seconda della isotopo di interesse. Inoltre, è difficile controllare rapidi cambiamenti nel tempo. Così, ci siamo rivolti verso un metodo alternativo di misura che utilizza le versioni acetossimetilico (AM) estere di indicatore fluorescente coloranti ionici sensibili. Di per sé, il colorante indicatore è carico e non passa attraverso la membrana facilmente, ma con l&#39;aggiunta del gruppo estere lipofilo, la molecola ora uncharged può passare attraverso la membrana del batterio. Entrando interni, i esterasi batteriche fendere il gruppo estere lasciando colorante libero all&#39;interno della cellula e di nuovo caricato, rallentando significativamente la sua capacità per uscire dalla cella e consentendo il colorante to accumularsi all&#39;interno nel tempo. Tuttavia, l&#39;uso di questi coloranti estere è stata descritta solo in alcune specie batteriche per rilevare variazioni di Ca2 + intracellulare 22-24 e H + 16, con diversi metodi di carico, rilevamento, e il successo. Con il desiderio di monitorare i cambiamenti in intracellulare di Ca 2 + e anche i livelli di K + e H + in S. pneumoniae in seguito al trattamento con Amleto e altri composti, abbiamo creato con successo i protocolli di caricare in modo efficiente coloranti indicatori fluorescenti in cellule batteriche. Loading efficace nei batteri necessari sia probenecid che aumenta la ritenzione di colorante bloccando anioni-trasportatori e PowerLoad, un composto brevettato da Life Technologies che aumenta l&#39;efficienza di carico. Fura-2/AM (rilevazione Ca 2 +), PBFI / AM (rilevamento K +), e BCECF / AM (rilevamento H +) sono stati caricati con successo in entrambi unencapsulated e incapsulato pneumococco stpiogge che consentono la misurazione delle risultanti pattern di fluorescenza dopo l&#39;aggiunta di ionofori, come ionomicina (Ca 2 + disaccoppiatore), valinomicina (K + disaccoppiatore) e CCCP (H + disaccoppiatore) utilizzando un lettore di piastra di rilevamento di fluorescenza 18, 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

Depolarizzazione della membrana e flussi ionici sono eventi che sono stati studiati ampiamente nei sistemi biologici a causa della loro capacità di influire profondamente funzioni cellulari, tra cui l&#39;energetica e trasduzione del segnale. Mentre entrambi i metodi fluorescenti ed elettrofisiologici, incluso l&#39;impiego dell&#39;elettrodo e patch-bloccaggio, sono stati ben sviluppati per misurare questi eventi in cellule eucariotiche, una metodologia per misurare eventi simili a microrganismi hanno dimostrato più impegnativo per sviluppare in loro piccole dimensioni in combinazione con il più complesso superficie esterna dei batteri schermanti membrana. Durante i nostri studi di morte-iniziazione Streptococcus pneumoniae (pneumococco), abbiamo voluto chiarire il ruolo degli eventi di membrana, compresi i cambiamenti di polarità, l&#39;integrità e la concentrazione di ioni intracellulari. Ricerca della letteratura, abbiamo scoperto che esistono pochissimi studi. Altri ricercatori hanno monitorato radioisotopo captazione o di equilibrio per misurare l&#39;influenza di ionixes e potenziale di membrana e un numero limitato di studi, soprattutto negli organismi Gram-negativi, avevano visto un certo successo con carbocyanine o oxonol coloranti fluorescenti per misurare il potenziale di membrana, oppure caricare i batteri con acetossimetilico cellula-permeabile (AM) versioni estere di ione-sensibile coloranti indicatori fluorescenti. Abbiamo quindi stabilito e ottimizzato i protocolli per la misura del potenziale di membrana, la rottura, e ionico trasporto nell&#39;organismo Gram-positivi S. pneumoniae. Abbiamo sviluppato protocolli usando il colorante bis-oxonol DiBAC 4 (3) e il colorante propidio ioduro cellula-impermeant per misurare depolarizzazione della membrana e la rottura, rispettivamente, così come i metodi per caricare in modo ottimale la pneumococchi con gli esteri AM dei coloranti raziometrici Fura-2, PBFI, e BCECF per rilevare cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Ca 2 +, K +, H + e, rispettivamente, utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza di rilevamento. Questi protocolli sono i primi nel loro genere per il pneumococcoe la maggioranza di questi coloranti non sono stati utilizzati in altre specie batteriche. Anche se sono stati ottimizzati i nostri protocolli per S. pneumoniae, crediamo che questi approcci dovrebbero costituire un ottimo punto di partenza per studi simili in altre specie batteriche.

Per tutti gli esperimenti, c&#39;è un campione e insieme di condizioni presenti in ciascun pozzetto. Così, ogni tracciato rappresenta l&#39;intensità di fluorescenza di un&#39;intera popolazione di batteri nel tempo. I risultati dovrebbero essere facilmente interpretabile, con una netta distinzione tra la fluorescenza dei campioni trattati e quella dei controlli non trattati. La cinetica e gradi di un cambiamento osservato in fluorescenza potrebbero fornire informazioni sul possibile meccanismo e la portata ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes at JoVE.c

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

A differenza di quanto osservato per eucarioti, c&#39;è una scarsità di studi che dettaglio depolarizzazione della membrana e concentrazione di ioni cambiamenti nei batteri, principalmente come loro piccole dimensioni lo metodi convenzionali di misura difficile. Qui, i protocolli di dettaglio per il monitoraggio di tali eventi nel significativa Gram-positivi patogeno Streptococcus pneumoniae utilizzando tecniche di fluorescenza.

Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo di tinture fluorescenti

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

monitoring-changes-membrane-polarity-membrane-integrity-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

13.5K Views.  University at Buffalo, State University of New York.  A differenza di quanto osservato per eucarioti, c'è una scarsità di studi che dettaglio depolarizzazione della membrana e concentrazione di ioni cambiamenti nei batteri, principalmente come loro piccole dimensioni lo metodi convenzionali di misura difficile. Qui, i protocolli di dettaglio per il monitoraggio di tali eventi nel significativa Gram-positivi patogeno Streptococcus pneumoniae utilizzando tecniche di fluorescenza. 

Video: Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo della reazione Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Da agglutinazione al lattice

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine ​​magnetica A e proteine ​​G perline

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

Purificazione del compartimento di membrana per la degradazione del reticolo endoplasmatico-collegata di antigeni esogeni in Cross-presentazione

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...