This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1 Preparazione di in-house Reagenti lattice <ol><li> Preparazione di glicina soluzione salina tamponata (GBS) <ol><li> Aggiungere 1,5 g di glicina, 11,7 g di cloruro di sodio e 100 ml di acqua distillata ad un bicchiere di vetro da 200 ml. </li><li> Mescolare per sciogliere con un agitatore magnetico. </li><li> Trasferire la miscela di un 500 ml cilindro graduato e aggiungere acqua distillata per un totale di 200 ml. </li><li> Trasferire la soluzione torna nel becher da 200 ml, controllare il pH e regolare a 8,2 con idrossido di sodio 5 M. NOTA: L&#39;idrossido di sodio è corrosivo, indossare dispositivi di protezione individuale. </li><li> Filtro sterilizzare la soluzione con 0,22 micron filtri e diversi 60 ml siringhe in una bottiglia di vetro da 250 ml con tappo a vite preautoclaved. </li><li> Conservare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparazione di GBS con il 0,2% di siero albumina bovina <ol><li> Aggiungere 0,2 g di albumina di siero bovino (BSA) in polvere e 100 ml di GBS per un bicchiere di vetro da 200 ml e frantumarla con un agitatore magnetico. </li><li> Filtrosterilizzare la soluzione attraverso 0.22 micron filtri utilizzando diversi 60 ml siringhe in un ml preautoclaved vite bottiglia di vetro con tappo 250. </li><li> Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del reagente lattice <ol><li> Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo. NOTA: rotondo tubi fondo sono utilizzati per ridurre al minimo sedimentazione delle particelle che possono influenzare l&#39;attaccamento degli anticorpi. </li><li> Usando una pipetta P1000 con punte sterili aggiungono 975 ml di GBS nella provetta per microcentrifuga, poi aggiungere 25 ml di antisiero adeguato pneumococcica per il reagente al lattice in fase di preparazione (cioè, piscina, gruppo, tipo o fattore). Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Diluire particelle di polistirene 01:10 con l&#39;aggiunta di 120 ml di particelle di lattice a 1.080 ml di soluzione fisiologica sterile. NOTA: Questo può essere fatto in grandi volumi, ma deve essere fatta fresca ogni volta i reagenti al lattice sono prodotti. </li><li> Aggiungere 1,000 ml di sospensione 01:10 lattice (preparato al punto 1.3.3) per l&#39;1,000 microlitri di sospensione 01:40 antisiero (preparato al punto 1.3.2). Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Incubare a 37 ° C su una ruota lenta rotazione (ad esempio, 4 rpm per una ruota di diametro 38,5 centimetri) per 2 ore. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 1100 x g. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 2 ml di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 1100 x g. Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di GBS e risospendere delicatamente il pellet. </li><li> Pipettare la sospensione di lattice in un etichettati 5 ml vite ricoperto tubo. Aggiungi un altro 1 ml di GBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di GBS contenente 0,2% di BSA (w / v) (pH 8.2) (preparata al punto 1.2). Aggiungere 40 ml di 10% (w / v) di sodio azide come conservante. NOTA: Sodio azide è pericoloso se inalato, ed è irritante per la pelle e gli occhi. È auspicabile per l&#39;acquisto di una soluzione preparata al 10% piuttosto che la forma in polvere, in quanto questo riduce al minimo il rischio di esposizione per inalazione. Dispositivi di protezione individuale (compresi i guanti unocchiali di protezione antispruzzo d) devono essere indossati quando si maneggia questo reagente. Consultare la scheda di sicurezza per ulteriori dettagli. </li><li> Conservare i reagenti al lattice a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del controllo negativo reagente al lattice <ol><li> Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo. NOTA: rotondo tubi fondo sono utilizzati per ridurre al minimo sedimentazione delle particelle che possono influenzare l&#39;attaccamento degli anticorpi. </li><li> Usando una pipetta P1000 con punte sterili aggiungono 975 ml di GBS nella provetta per microcentrifuga, quindi aggiungere 25 microlitri normale antisiero di coniglio. Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Procedere come nei punti 1.3.3 a 1.3.10 sopra </li></ol></li></ol> 2 Controllo Qualità (QC) di lattice Reagenti <ol><li> Portare reagente al lattice a RT. Immediatamente prima dell&#39;uso, mescolare delicatamente il reagente al lattice capovolgendo la provetta diverse volte. </li><li> Controllare reagente per autoagglutinazione pipettando 15 microlitri su un vetrino da microscopio in vetro e procedere come nei passi 4.7 e 4.8 qui di seguito. Non ci dovrebbe essere ungglutination delle particelle di lattice. Il reagente dovrebbe apparire bianca e liscia. </li><li> Testare il reagente contro un gruppo di basso passaggio isolati di pneumococco. Utilizzare le culture fresche coltivate preparato come al punto 3 Il pannello di isolati dovrebbe includere isolati del sierotipo &#39;obiettivo&#39; (il sierotipo specifico per il reagente in fase di test) e sierotipi &quot;non bersaglio&quot; (isolati di altri sierotipi che non dovrebbero normalmente attraversare reagire con il reagente). Includere almeno un isolato di ciascun bersaglio e non bersaglio sierotipo per ogni reagente al lattice in fase di controllo di qualità. Se vi è un solo bersaglio o non bersaglio sierotipo, prova due diversi isolati di particolare sierotipo. NOTA: Il pannello di test dovrebbe includere diversi isolati di ciascun sierotipo, alcuni dei quali sono rari in malattia invasiva e / o tipo di collezioni di colture. È preferibile includere alcuni carrozza isolati, in quanto sono spesso più impegnativo sierotipo (dati non mostrati), così testare ulteriormente la capacità of i reagenti e garantire che i reagenti sono probabili in grado di sierotipizzazione sia invasivo e isolati carrozza. </li><li> Procedere con il test di reagenti al lattice con bersaglio e non bersaglio pneumococco isolati secondo il metodo descritto nei passaggi 3 e 4. </li><li> Reagenti di controllo della qualità al momento della produzione e poi in seguito almeno annualmente. NOTA: Se un reagente non passa QC, il lotto deve essere scartato e una nuova preparazione fatta. In caso di guasto si consiglia di ripetere il controllo di qualità dei reagenti essere prodotti usando i metodi alternativi descritti in Ortika et al., 2013 8 e nella discussione di seguito. </li></ol> 3 Preparazione delle Culture pneumococco per la sierotipizzazione <ol><li> Utilizzando un&#39;ansa sterile selezionare una singola colonia del pneumococco isolare e realizzato questo su un solido non selettivo agar sangue in modo che l&#39;inoculo primario si estende per circa un terzo della superficie della piastra. Streak per singole colonie. NOTA: Piatti preparati con sangue defibrinato di cavallo o di pecora sono adatte; ma le piastre di sangue preparati con sangue umano o di sangue animale citrato non sono. </li><li> Incubare la piastra O / N a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2. </li><li> Osservare la crescita sulla piastra per la purezza e valutare che vi sia una crescita sufficiente per sierotipizzazione. NOTA: Una cultura pura dell&#39;isolato pneumococco è necessario per sierotipizzazione. Nella nostra esperienza, confluenti, o in prossimità confluenti crescita che copre circa un terzo della superficie della piastra è di solito sufficiente per completare sierotipizzazione. Come culture pneumococco possono essere soggette a autolisi, culture preparati per la sierotipizzazione devono essere testati entro 24 ore della sottocultura. Non prendere la piastra di coltura fuori dell&#39;incubatore più di 15 a 20 minuti prima sierotipizzazione inizio. </li></ol> 4. L&#39;esecuzione di agglutinazione al lattice Sierotipizzazione <ol><li> Rimuovere tutti i reagenti al lattice dal frigorifero e permettere loro di scaldare a temperatura ambiente per circacir- ca 30 min. Immediatamente prima dell&#39;uso, capovolgere delicatamente i tubi per mescolare i reagenti. </li><li> Etichettare un vetrino da microscopio. </li><li> Mettere 15 ml di reagente di controllo negativo in lattice sul vetrino da microscopio. </li><li> Utilizzando un usa e getta ciclo 1 ml sterile prendere una spazzata della cultura pneumococco in modo che il ciclo è di circa mezzo pieno. </li><li> Spalmare delicatamente l&#39;inoculo sulla superficie del vetrino vicino alla goccia di reagente di controllo negativo lattice. L&#39;inoculo dovrebbe essere visibile sul vetrino. </li><li> Mescolare velocemente e accuratamente l&#39;inoculo nel reagente di controllo negativo in lattice utilizzando il loop. Assicurarsi che la goccia non si diffonde oltre la sua dimensione iniziale. </li><li> Raccogliete la diapositiva, tenendolo ad entrambe le estremità. Rock the scorrere avanti e indietro per 1 min. Fare attenzione a mantenere il liquido si muove lentamente, e assicurare che la dimensione della goccia non aumenta. NOTA: In alternativa, utilizzare un rocker piatto. </li><li> Osservare per agglutinazione macroscopica (cioè,occhio nudo) e compensazione della sospensione contro uno sfondo nero. </li><li> Se il reagente di controllo negativo non mostra alcuna agglutinazione al lattice o di compensazione continuare testare la cultura, sostituendo i reagenti al lattice per la negativa reagente al lattice controllo nei passaggi 4,1-4,8 sopra. Un ciclo fresco deve essere utilizzato ogni volta. Procedere con il test dei reagenti al lattice che iniziano con le piscine. </li><li> Prova ciascuno dei &quot;pool&quot; reagenti al lattice in successione fino ad ottenere un test positivo. NOTA:. L&#39;ordine delle prove delle piscine può essere fatto in &quot;round&quot; per riflettere l&#39;incidenza locale di particolari sierotipi (ad esempio, testando per le tre piscine più probabili sulla prima diapositiva Se non si ottiene una reazione positiva, allora prova il prossimo tre più probabile delle restanti piscine sulla seconda slitta, e così via fino ad ottenere una reazione positiva). Questo assicura che i sierotipi più comuni sono testati prima, riducendo al minimo il tempo e reagenti necessari. </li><li>Usando la chiave del produttore antisieri determinare quali antisieri individuali sono rappresentati nella piscina positivo. </li><li> Prova ciascuno dei gruppi o tipi contenuti nella piscina positivo individualmente per determinare il &#39;gruppo&#39; o &#39;tipo&#39; come nei passaggi 4,1-4,8 sopra. </li><li> Determinare il risultato con riferimento alla chiave del produttore antisieri. Se un &#39;tipo&#39; è determinato (ad esempio, sierotipo 5), quindi nessun ulteriore test è necessario e questo risultato viene registrato. </li><li> Se un &#39;gruppo&#39; è determinato (ad esempio, gruppo 19), quindi fare riferimento alla chiave produttori per determinare i fattori da testare. Continuare il test con i singoli reagenti al lattice &#39;Factor&#39; e determinare il sierotipo finale (ad esempio, sierotipo 19B). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Agglutinazione del lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per la sierotipizzazione pneumococco. Reagenti di agglutinazione al lattice pneumococco commerciali sono disponibili, ma attualmente non permettono di distinguere tutti pneumococcica noto sierotipi 10,12. Tuttavia, i reagenti di agglutinazione al lattice possono essere facilmente prodotte in-house usando antisieri acquistato sollevata contro specifici antigeni capsulari pneumococco. Nel metodo descritto qui, gli anticorpi sono passivamente collegati a particelle di lattice per fare una serie di reagenti di agglutinazione al lattice. Una reazione positiva lattice si verifica quando gli anticorpi specifici legati alle particelle di lattice si attaccano agli antigeni sulla capsula del polisaccaride pneumococcico isolare 18,19. Le particelle di lattice allegate agli anticorpi consentire la reazione specifica antigene-anticorpo per essere visualizzato senza ingrandimento. Latex agglutinazione è un metodo adatto per i laboratori ad alto rendimento di und anche per i poveri di risorse. I principali vantaggi del metodo di agglutinazione al lattice sono che nessuna attrezzatura specializzata è necessario per eseguire il test, i reagenti hanno una durata di almeno 2 anni se conservato a 4 ° C 8, e che è poco costoso, semplice e veloce da eseguire. Sierotipizzazione un isolato da pneumococco agglutinazione al lattice impiega circa 10 minuti, e fino a quattro reagenti al lattice può essere testato in parallelo su una diapositiva. Inoltre, se la prevalenza dei sierotipi è noto per l&#39;impostazione epidemiologico rilevante, il test può essere eseguito in turni che iniziano con le piscine che contengono i sierotipi più comuni in modo simile alla prova Quellung 17. Questo approccio riduce al minimo il numero di prove necessarie per determinare il sierotipo. Il metodo è anche altamente riproducibile tra diversi operatori (dati non mostrati). Uno svantaggio di agglutinazione al lattice sierotipizzazione è che la produzione di reagenti molto tempo, prendendo circa 4 ore; anche se Reage multiplanti può essere facilmente prodotta in parallelo. Inoltre, alcuni antigeni sono comuni tra i diversi sierotipi di pneumococco, causando reazioni crociate con alcuni antisieri (ad esempio, sierotipo 29, 42 e Gruppo 35). Tuttavia, queste reazioni trasversali sono ben caratterizzati quando si utilizzano antisieri commerciali (che di solito è preabsorbed per eliminare gli anticorpi cross-reagenti più problematici) e le tabelle di reazione aggiuntivi sono forniti dal produttore, al fine di distinguere quale sierotipo è presente. Reagenti al lattice può anche attraversare reagire se gli anticorpi non sono allineati correttamente sulle particelle di lattice; questi vengono rilevati come errori di QC. Nella nostra esperienza, rigoroso controllo di qualità è fondamentale per il successo di questo metodo, anche quando antisieri disponibili in commercio vengono utilizzati per la produzione. QC richiede circa 15 minuti per ogni reagente e si basa su una serie di appropriate QC isolati come descritto sopra. Il metodo qui descritto si traduce in reagenti che danno una positiva reazione ben wisottile il periodo di prova. Nella nostra esperienza, i falsi positivi sono rari nella pratica (dati non riportati). Occasionali reazioni false negative si osservano; di solito si riferiscono a problemi noti con un particolare antisiero (ad esempio, sierogruppo 6 isolati non possono reagire con piscina B antisiero), o down regulation dell&#39;espressione capsula da parte l&#39;isolato. Utilizzando il algrorithm sierotipizzazione fornito dal produttore è anche importante, come nella maggior parte dei casi una falsa reazione positiva o negativa porterà a un risultato &#39;finale cieca&#39;. In questi casi, e quando le reazioni sono di difficile interpretazione, si consiglia di ripetere il test e / o prove con un metodo alternativo, come la reazione Quellung. Alcuni la risoluzione dei problemi è a volte necessario per rendere reagenti al lattice soddisfacenti. Nel metodo qui descritto, l&#39;anticorpo è attaccato a particelle di lattice tramite adsorbimento passivo 15,19, quindi una variabile critica è la concentrazione di anticorpo utilizzato, che determina quanto benela superficie delle particelle di lattice è coperto e il conseguente allineamento delle anticorpali siti attivi 15,20. Di conseguenza, se l&#39;anticorpo insufficiente o in eccesso è collegato alle particelle di lattice, le reazioni antigene-anticorpo non saranno ottimali, e reagenti insoddisfacenti possono essere prodotti 15,20,21. Come titoli anticorpali variano tra i diversi lotti di antisieri, un set standard di diluizioni non può produrre i reagenti che eseguono bene 8. Un utile punto di partenza è quello di utilizzare una diluizione 1:40 di antisiero, e se questo non è successo, diluire ulteriormente l&#39;antisiero. Nella nostra esperienza questa di solito si risolve il problema 8. In un piccolo numero di casi reagenti possono mostrare agglutinazione debole che non è accompagnato dalla compensazione della sospensione durante il test con l&#39;obiettivo di isolare. In questi casi la diluizione di antisiero non migliora la qualità del reagente, ma reagenti soddisfacenti possono solitamente essere prodotti omettendo la centrifugazione e lavaggio passi 8,22 </sup&gt;. Legate agli anticorpi particelle di lattice sono utilizzati comunemente in microbiologia diagnostica per la rilevazione, l&#39;identificazione o la sierotipizzazione di molti microbi diversi 15,20. Come tale, il metodo qui descritto può essere adatto per la preparazione di reagenti al lattice per altri scopi, a condizione antisieri adatto è disponibile e di adeguate procedure di controllo di qualità sono adottati.

Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei bambini sotto l&#39;età di cinque anni, in particolare in contesti poveri di risorse 1,2 in tutto il mondo. Gamme di malattia pneumococcica da infezioni localizzate a condizioni di pericolo di vita come la polmonite, la sepsi e la meningite 1,2. Più di 90 sierotipi di pneumococco sono stati identificati sulla base di differenze nella loro polisaccaride capsulare 3. Vaccini attuali di mira il polisaccaride capsulare e forniscono protezione dalle principali sierotipi che causano malattia invasiva 4. Sierotipizzazione pneumococco isolati è importante per valutare l&#39;impatto della vaccinazione sulla carrozza e le malattie, oltre a fornire informazioni più ampie epidemiologiche 5,6. L&#39;attuale metodo di &#39;gold standard&#39; per la sierotipizzazione pneumococco è la prova Quellung, ma richiede tempo e richiede una certa abilità a perform 7. Agglutinazione al lattice è un metodo alternativo sierotipizzazione raccomandata dall&#39;Organizzazione mondiale della sanità 7. Agglutinazione del lattice è veloce e semplice da eseguire, ed è impiegato in molti laboratori in tutto il mondo 8-11. È importante sottolineare che, di agglutinazione al lattice ha mostrato un&#39;accuratezza paragonabile alla prova Quellung per la sierotipizzazione pneumococco 10,12-14. Nel complesso, questo metodo è ideale per gli ambienti poveri di risorse, nonché i laboratori ad alto rendimento. Reagenti di agglutinazione al lattice (latex &#39;reagenti&#39;) sono creati mediante l&#39;applicazione di anticorpi a particelle di lattice 15. In una reazione positiva, queste particelle etichettate agglutinano in presenza di antigene specifico. Reagenti al lattice commerciali sono disponibili per una gamma limitata di sierotipi. Reagenti al lattice possono anche essere preparati in casa utilizzando antisieri disponibili in commercio 10. Miscele di antisieri (&#39;pool&#39;), così come antisieri specifici per s pneumococcoerogroups (ad esempio, gruppo 19), i singoli sierotipi (ad esempio, sierotipo 5), e di antigeni specifici («fattori», ad es., fattore 19c riconoscendo sierotipo 19A) per definire ulteriormente i sierotipi all&#39;interno dei gruppi sono disponibili 16. Questo manoscritto descrive le principali fasi della produzione di reagenti al lattice utilizzano attaccamento passivo commercialmente disponibile antisieri di particelle di lattice. Il controllo di qualità (QC) aspetti di questo metodo sono descritti, e un protocollo per l&#39;utilizzo di reagenti al lattice per la sierotipizzazione pneumococco è incluso.

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			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Una reazione positiva si verifica quando lattice anticorpo specifico tipo allegata alla particella di lattice si lega alla capsula del pneumococco, e agglutinazione delle particelle anticorpo marcato Segue 15. Figura 1A mostra una reazione positiva che si caratterizza per agglutinazione visibile e compensazione dello sfondo sospensione. Una reazione negativa è caratterizzata dalla sospensione reagente al lattice restante liscio e bianco (Figura 1B). I reagenti sono ottimizzati in modo che una reazione positiva deve osservare prima della fine dell&#39;intervallo di tempo di un minuto (generalmente rilevabili in circa 20 sec). Noi non consigliamo di leggere le reazioni dopo l&#39;intervallo di tempo 1 min. Molto raramente, reazioni mostrano agglutinazione debole intorno al bordo della goccia che non sia accompagnato dalla compensazione della sospensione sfondo, o apparire &#39;filante&#39; senza sfondo clearing (dati non riportati). Questi sono più come<html> reazioni negative ly. In questi casi, si consiglia di ripetere le prove e / o ulteriori indagini utilizzando un altro metodo sierotipizzazione (per esempio la reazione Quellung 17). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Le reazioni di agglutinazione al lattice positive e negative. Preparazioni dei pneumococcica isolare mescolati con il reagente di agglutinazione al lattice che mostra una reazione positiva (A) o una reazione negativa (B). Agglutinazione accompagnato dalla compensazione dello sfondo si vede nella reazione positiva (A) .C&#39;è nessuna agglutinazione visibile con il reagente di controllo negativo lattice o in una reazione test negativo (B). Fotografie 8 utilizzati con il permesso.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Test di agglutinazione al lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae, ed è anche stato ampiamente applicato in microbiologia diagnostica. Questo manoscritto descrive la produzione interna dei reagenti di agglutinazione al lattice, procedure di controllo della qualità e l&#39;applicazione di questa tecnica per sierotipizzazione pneumococco.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Da agglutinazione al lattice

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K Views.  Murdoch Childrens Research Institute.  Test di agglutinazione al lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae, ed è anche stato ampiamente applicato in microbiologia diagnostica. Questo manoscritto descrive la produzione interna dei reagenti di agglutinazione al lattice, procedure di controllo della qualità e l'applicazione di questa tecnica per sierotipizzazione pneumococco. 

Video: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Metodo di particelle agglutinazione per l&#39;identificazione Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo di tinture fluorescenti

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo della reazione Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modello murino di Gruppo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonizzazione vaginale

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...