This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1 Preparazione di in-house Reagenti lattice <ol><li> Preparazione di glicina soluzione salina tamponata (GBS) <ol><li> Aggiungere 1,5 g di glicina, 11,7 g di cloruro di sodio e 100 ml di acqua distillata ad un bicchiere di vetro da 200 ml. </li><li> Mescolare per sciogliere con un agitatore magnetico. </li><li> Trasferire la miscela di un 500 ml cilindro graduato e aggiungere acqua distillata per un totale di 200 ml. </li><li> Trasferire la soluzione torna nel becher da 200 ml, controllare il pH e regolare a 8,2 con idrossido di sodio 5 M. NOTA: L&#39;idrossido di sodio è corrosivo, indossare dispositivi di protezione individuale. </li><li> Filtro sterilizzare la soluzione con 0,22 micron filtri e diversi 60 ml siringhe in una bottiglia di vetro da 250 ml con tappo a vite preautoclaved. </li><li> Conservare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparazione di GBS con il 0,2% di siero albumina bovina <ol><li> Aggiungere 0,2 g di albumina di siero bovino (BSA) in polvere e 100 ml di GBS per un bicchiere di vetro da 200 ml e frantumarla con un agitatore magnetico. </li><li> Filtrosterilizzare la soluzione attraverso 0.22 micron filtri utilizzando diversi 60 ml siringhe in un ml preautoclaved vite bottiglia di vetro con tappo 250. </li><li> Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del reagente lattice <ol><li> Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo. NOTA: rotondo tubi fondo sono utilizzati per ridurre al minimo sedimentazione delle particelle che possono influenzare l&#39;attaccamento degli anticorpi. </li><li> Usando una pipetta P1000 con punte sterili aggiungono 975 ml di GBS nella provetta per microcentrifuga, poi aggiungere 25 ml di antisiero adeguato pneumococcica per il reagente al lattice in fase di preparazione (cioè, piscina, gruppo, tipo o fattore). Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Diluire particelle di polistirene 01:10 con l&#39;aggiunta di 120 ml di particelle di lattice a 1.080 ml di soluzione fisiologica sterile. NOTA: Questo può essere fatto in grandi volumi, ma deve essere fatta fresca ogni volta i reagenti al lattice sono prodotti. </li><li> Aggiungere 1,000 ml di sospensione 01:10 lattice (preparato al punto 1.3.3) per l&#39;1,000 microlitri di sospensione 01:40 antisiero (preparato al punto 1.3.2). Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Incubare a 37 ° C su una ruota lenta rotazione (ad esempio, 4 rpm per una ruota di diametro 38,5 centimetri) per 2 ore. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 1100 x g. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 2 ml di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 1100 x g. Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di GBS e risospendere delicatamente il pellet. </li><li> Pipettare la sospensione di lattice in un etichettati 5 ml vite ricoperto tubo. Aggiungi un altro 1 ml di GBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di GBS contenente 0,2% di BSA (w / v) (pH 8.2) (preparata al punto 1.2). Aggiungere 40 ml di 10% (w / v) di sodio azide come conservante. NOTA: Sodio azide è pericoloso se inalato, ed è irritante per la pelle e gli occhi. È auspicabile per l&#39;acquisto di una soluzione preparata al 10% piuttosto che la forma in polvere, in quanto questo riduce al minimo il rischio di esposizione per inalazione. Dispositivi di protezione individuale (compresi i guanti unocchiali di protezione antispruzzo d) devono essere indossati quando si maneggia questo reagente. Consultare la scheda di sicurezza per ulteriori dettagli. </li><li> Conservare i reagenti al lattice a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del controllo negativo reagente al lattice <ol><li> Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo. NOTA: rotondo tubi fondo sono utilizzati per ridurre al minimo sedimentazione delle particelle che possono influenzare l&#39;attaccamento degli anticorpi. </li><li> Usando una pipetta P1000 con punte sterili aggiungono 975 ml di GBS nella provetta per microcentrifuga, quindi aggiungere 25 microlitri normale antisiero di coniglio. Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Procedere come nei punti 1.3.3 a 1.3.10 sopra </li></ol></li></ol> 2 Controllo Qualità (QC) di lattice Reagenti <ol><li> Portare reagente al lattice a RT. Immediatamente prima dell&#39;uso, mescolare delicatamente il reagente al lattice capovolgendo la provetta diverse volte. </li><li> Controllare reagente per autoagglutinazione pipettando 15 microlitri su un vetrino da microscopio in vetro e procedere come nei passi 4.7 e 4.8 qui di seguito. Non ci dovrebbe essere ungglutination delle particelle di lattice. Il reagente dovrebbe apparire bianca e liscia. </li><li> Testare il reagente contro un gruppo di basso passaggio isolati di pneumococco. Utilizzare le culture fresche coltivate preparato come al punto 3 Il pannello di isolati dovrebbe includere isolati del sierotipo &#39;obiettivo&#39; (il sierotipo specifico per il reagente in fase di test) e sierotipi &quot;non bersaglio&quot; (isolati di altri sierotipi che non dovrebbero normalmente attraversare reagire con il reagente). Includere almeno un isolato di ciascun bersaglio e non bersaglio sierotipo per ogni reagente al lattice in fase di controllo di qualità. Se vi è un solo bersaglio o non bersaglio sierotipo, prova due diversi isolati di particolare sierotipo. NOTA: Il pannello di test dovrebbe includere diversi isolati di ciascun sierotipo, alcuni dei quali sono rari in malattia invasiva e / o tipo di collezioni di colture. È preferibile includere alcuni carrozza isolati, in quanto sono spesso più impegnativo sierotipo (dati non mostrati), così testare ulteriormente la capacità of i reagenti e garantire che i reagenti sono probabili in grado di sierotipizzazione sia invasivo e isolati carrozza. </li><li> Procedere con il test di reagenti al lattice con bersaglio e non bersaglio pneumococco isolati secondo il metodo descritto nei passaggi 3 e 4. </li><li> Reagenti di controllo della qualità al momento della produzione e poi in seguito almeno annualmente. NOTA: Se un reagente non passa QC, il lotto deve essere scartato e una nuova preparazione fatta. In caso di guasto si consiglia di ripetere il controllo di qualità dei reagenti essere prodotti usando i metodi alternativi descritti in Ortika et al., 2013 8 e nella discussione di seguito. </li></ol> 3 Preparazione delle Culture pneumococco per la sierotipizzazione <ol><li> Utilizzando un&#39;ansa sterile selezionare una singola colonia del pneumococco isolare e realizzato questo su un solido non selettivo agar sangue in modo che l&#39;inoculo primario si estende per circa un terzo della superficie della piastra. Streak per singole colonie. NOTA: Piatti preparati con sangue defibrinato di cavallo o di pecora sono adatte; ma le piastre di sangue preparati con sangue umano o di sangue animale citrato non sono. </li><li> Incubare la piastra O / N a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2. </li><li> Osservare la crescita sulla piastra per la purezza e valutare che vi sia una crescita sufficiente per sierotipizzazione. NOTA: Una cultura pura dell&#39;isolato pneumococco è necessario per sierotipizzazione. Nella nostra esperienza, confluenti, o in prossimità confluenti crescita che copre circa un terzo della superficie della piastra è di solito sufficiente per completare sierotipizzazione. Come culture pneumococco possono essere soggette a autolisi, culture preparati per la sierotipizzazione devono essere testati entro 24 ore della sottocultura. Non prendere la piastra di coltura fuori dell&#39;incubatore più di 15 a 20 minuti prima sierotipizzazione inizio. </li></ol> 4. L&#39;esecuzione di agglutinazione al lattice Sierotipizzazione <ol><li> Rimuovere tutti i reagenti al lattice dal frigorifero e permettere loro di scaldare a temperatura ambiente per circacir- ca 30 min. Immediatamente prima dell&#39;uso, capovolgere delicatamente i tubi per mescolare i reagenti. </li><li> Etichettare un vetrino da microscopio. </li><li> Mettere 15 ml di reagente di controllo negativo in lattice sul vetrino da microscopio. </li><li> Utilizzando un usa e getta ciclo 1 ml sterile prendere una spazzata della cultura pneumococco in modo che il ciclo è di circa mezzo pieno. </li><li> Spalmare delicatamente l&#39;inoculo sulla superficie del vetrino vicino alla goccia di reagente di controllo negativo lattice. L&#39;inoculo dovrebbe essere visibile sul vetrino. </li><li> Mescolare velocemente e accuratamente l&#39;inoculo nel reagente di controllo negativo in lattice utilizzando il loop. Assicurarsi che la goccia non si diffonde oltre la sua dimensione iniziale. </li><li> Raccogliete la diapositiva, tenendolo ad entrambe le estremità. Rock the scorrere avanti e indietro per 1 min. Fare attenzione a mantenere il liquido si muove lentamente, e assicurare che la dimensione della goccia non aumenta. NOTA: In alternativa, utilizzare un rocker piatto. </li><li> Osservare per agglutinazione macroscopica (cioè,occhio nudo) e compensazione della sospensione contro uno sfondo nero. </li><li> Se il reagente di controllo negativo non mostra alcuna agglutinazione al lattice o di compensazione continuare testare la cultura, sostituendo i reagenti al lattice per la negativa reagente al lattice controllo nei passaggi 4,1-4,8 sopra. Un ciclo fresco deve essere utilizzato ogni volta. Procedere con il test dei reagenti al lattice che iniziano con le piscine. </li><li> Prova ciascuno dei &quot;pool&quot; reagenti al lattice in successione fino ad ottenere un test positivo. NOTA:. L&#39;ordine delle prove delle piscine può essere fatto in &quot;round&quot; per riflettere l&#39;incidenza locale di particolari sierotipi (ad esempio, testando per le tre piscine più probabili sulla prima diapositiva Se non si ottiene una reazione positiva, allora prova il prossimo tre più probabile delle restanti piscine sulla seconda slitta, e così via fino ad ottenere una reazione positiva). Questo assicura che i sierotipi più comuni sono testati prima, riducendo al minimo il tempo e reagenti necessari. </li><li>Usando la chiave del produttore antisieri determinare quali antisieri individuali sono rappresentati nella piscina positivo. </li><li> Prova ciascuno dei gruppi o tipi contenuti nella piscina positivo individualmente per determinare il &#39;gruppo&#39; o &#39;tipo&#39; come nei passaggi 4,1-4,8 sopra. </li><li> Determinare il risultato con riferimento alla chiave del produttore antisieri. Se un &#39;tipo&#39; è determinato (ad esempio, sierotipo 5), quindi nessun ulteriore test è necessario e questo risultato viene registrato. </li><li> Se un &#39;gruppo&#39; è determinato (ad esempio, gruppo 19), quindi fare riferimento alla chiave produttori per determinare i fattori da testare. Continuare il test con i singoli reagenti al lattice &#39;Factor&#39; e determinare il sierotipo finale (ad esempio, sierotipo 19B). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Agglutinazione del lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per la sierotipizzazione pneumococco. Reagenti di agglutinazione al lattice pneumococco commerciali sono disponibili, ma attualmente non permettono di distinguere tutti pneumococcica noto sierotipi 10,12. Tuttavia, i reagenti di agglutinazione al lattice possono essere facilmente prodotte in-house usando antisieri acquistato sollevata contro specifici antigeni capsulari pneumococco. Nel metodo descritto qui, gli anticorpi sono passivamente collegati a particelle di lattice per fare una serie di reagenti di agglutinazione al lattice. Una reazione positiva lattice si verifica quando gli anticorpi specifici legati alle particelle di lattice si attaccano agli antigeni sulla capsula del polisaccaride pneumococcico isolare 18,19. Le particelle di lattice allegate agli anticorpi consentire la reazione specifica antigene-anticorpo per essere visualizzato senza ingrandimento. Latex agglutinazione è un metodo adatto per i laboratori ad alto rendimento di und anche per i poveri di risorse. I principali vantaggi del metodo di agglutinazione al lattice sono che nessuna attrezzatura specializzata è necessario per eseguire il test, i reagenti hanno una durata di almeno 2 anni se conservato a 4 ° C 8, e che è poco costoso, semplice e veloce da eseguire. Sierotipizzazione un isolato da pneumococco agglutinazione al lattice impiega circa 10 minuti, e fino a quattro reagenti al lattice può essere testato in parallelo su una diapositiva. Inoltre, se la prevalenza dei sierotipi è noto per l&#39;impostazione epidemiologico rilevante, il test può essere eseguito in turni che iniziano con le piscine che contengono i sierotipi più comuni in modo simile alla prova Quellung 17. Questo approccio riduce al minimo il numero di prove necessarie per determinare il sierotipo. Il metodo è anche altamente riproducibile tra diversi operatori (dati non mostrati). Uno svantaggio di agglutinazione al lattice sierotipizzazione è che la produzione di reagenti molto tempo, prendendo circa 4 ore; anche se Reage multiplanti può essere facilmente prodotta in parallelo. Inoltre, alcuni antigeni sono comuni tra i diversi sierotipi di pneumococco, causando reazioni crociate con alcuni antisieri (ad esempio, sierotipo 29, 42 e Gruppo 35). Tuttavia, queste reazioni trasversali sono ben caratterizzati quando si utilizzano antisieri commerciali (che di solito è preabsorbed per eliminare gli anticorpi cross-reagenti più problematici) e le tabelle di reazione aggiuntivi sono forniti dal produttore, al fine di distinguere quale sierotipo è presente. Reagenti al lattice può anche attraversare reagire se gli anticorpi non sono allineati correttamente sulle particelle di lattice; questi vengono rilevati come errori di QC. Nella nostra esperienza, rigoroso controllo di qualità è fondamentale per il successo di questo metodo, anche quando antisieri disponibili in commercio vengono utilizzati per la produzione. QC richiede circa 15 minuti per ogni reagente e si basa su una serie di appropriate QC isolati come descritto sopra. Il metodo qui descritto si traduce in reagenti che danno una positiva reazione ben wisottile il periodo di prova. Nella nostra esperienza, i falsi positivi sono rari nella pratica (dati non riportati). Occasionali reazioni false negative si osservano; di solito si riferiscono a problemi noti con un particolare antisiero (ad esempio, sierogruppo 6 isolati non possono reagire con piscina B antisiero), o down regulation dell&#39;espressione capsula da parte l&#39;isolato. Utilizzando il algrorithm sierotipizzazione fornito dal produttore è anche importante, come nella maggior parte dei casi una falsa reazione positiva o negativa porterà a un risultato &#39;finale cieca&#39;. In questi casi, e quando le reazioni sono di difficile interpretazione, si consiglia di ripetere il test e / o prove con un metodo alternativo, come la reazione Quellung. Alcuni la risoluzione dei problemi è a volte necessario per rendere reagenti al lattice soddisfacenti. Nel metodo qui descritto, l&#39;anticorpo è attaccato a particelle di lattice tramite adsorbimento passivo 15,19, quindi una variabile critica è la concentrazione di anticorpo utilizzato, che determina quanto benela superficie delle particelle di lattice è coperto e il conseguente allineamento delle anticorpali siti attivi 15,20. Di conseguenza, se l&#39;anticorpo insufficiente o in eccesso è collegato alle particelle di lattice, le reazioni antigene-anticorpo non saranno ottimali, e reagenti insoddisfacenti possono essere prodotti 15,20,21. Come titoli anticorpali variano tra i diversi lotti di antisieri, un set standard di diluizioni non può produrre i reagenti che eseguono bene 8. Un utile punto di partenza è quello di utilizzare una diluizione 1:40 di antisiero, e se questo non è successo, diluire ulteriormente l&#39;antisiero. Nella nostra esperienza questa di solito si risolve il problema 8. In un piccolo numero di casi reagenti possono mostrare agglutinazione debole che non è accompagnato dalla compensazione della sospensione durante il test con l&#39;obiettivo di isolare. In questi casi la diluizione di antisiero non migliora la qualità del reagente, ma reagenti soddisfacenti possono solitamente essere prodotti omettendo la centrifugazione e lavaggio passi 8,22 </sup&gt;. Legate agli anticorpi particelle di lattice sono utilizzati comunemente in microbiologia diagnostica per la rilevazione, l&#39;identificazione o la sierotipizzazione di molti microbi diversi 15,20. Come tale, il metodo qui descritto può essere adatto per la preparazione di reagenti al lattice per altri scopi, a condizione antisieri adatto è disponibile e di adeguate procedure di controllo di qualità sono adottati.

Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei bambini sotto l&#39;età di cinque anni, in particolare in contesti poveri di risorse 1,2 in tutto il mondo. Gamme di malattia pneumococcica da infezioni localizzate a condizioni di pericolo di vita come la polmonite, la sepsi e la meningite 1,2. Più di 90 sierotipi di pneumococco sono stati identificati sulla base di differenze nella loro polisaccaride capsulare 3. Vaccini attuali di mira il polisaccaride capsulare e forniscono protezione dalle principali sierotipi che causano malattia invasiva 4. Sierotipizzazione pneumococco isolati è importante per valutare l&#39;impatto della vaccinazione sulla carrozza e le malattie, oltre a fornire informazioni più ampie epidemiologiche 5,6. L&#39;attuale metodo di &#39;gold standard&#39; per la sierotipizzazione pneumococco è la prova Quellung, ma richiede tempo e richiede una certa abilità a perform 7. Agglutinazione al lattice è un metodo alternativo sierotipizzazione raccomandata dall&#39;Organizzazione mondiale della sanità 7. Agglutinazione del lattice è veloce e semplice da eseguire, ed è impiegato in molti laboratori in tutto il mondo 8-11. È importante sottolineare che, di agglutinazione al lattice ha mostrato un&#39;accuratezza paragonabile alla prova Quellung per la sierotipizzazione pneumococco 10,12-14. Nel complesso, questo metodo è ideale per gli ambienti poveri di risorse, nonché i laboratori ad alto rendimento. Reagenti di agglutinazione al lattice (latex &#39;reagenti&#39;) sono creati mediante l&#39;applicazione di anticorpi a particelle di lattice 15. In una reazione positiva, queste particelle etichettate agglutinano in presenza di antigene specifico. Reagenti al lattice commerciali sono disponibili per una gamma limitata di sierotipi. Reagenti al lattice possono anche essere preparati in casa utilizzando antisieri disponibili in commercio 10. Miscele di antisieri (&#39;pool&#39;), così come antisieri specifici per s pneumococcoerogroups (ad esempio, gruppo 19), i singoli sierotipi (ad esempio, sierotipo 5), e di antigeni specifici («fattori», ad es., fattore 19c riconoscendo sierotipo 19A) per definire ulteriormente i sierotipi all&#39;interno dei gruppi sono disponibili 16. Questo manoscritto descrive le principali fasi della produzione di reagenti al lattice utilizzano attaccamento passivo commercialmente disponibile antisieri di particelle di lattice. Il controllo di qualità (QC) aspetti di questo metodo sono descritti, e un protocollo per l&#39;utilizzo di reagenti al lattice per la sierotipizzazione pneumococco è incluso.

<table><tbody><tr><td>Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Or other volumes as required</td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Antibodies Australia&amp;nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Or other volumes as required, bring to RT before use</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Various</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Bring to rRT before use</td></tr><tr><td>Sodium azide 10% (v/v) solution&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Round bottom</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Calibrated disposable inoculating loops 1 &amp;micro;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Caution: highly corrosive</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com.au/&quot;&gt;http://www.thermofisher.com.au&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Rotating wheel</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringes without needles</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure on Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Key to determining serotypes&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Key to pneumococcal factor serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>For determining serotype within Groups&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*alternative sources are available for most materials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Una reazione positiva si verifica quando lattice anticorpo specifico tipo allegata alla particella di lattice si lega alla capsula del pneumococco, e agglutinazione delle particelle anticorpo marcato Segue 15. Figura 1A mostra una reazione positiva che si caratterizza per agglutinazione visibile e compensazione dello sfondo sospensione. Una reazione negativa è caratterizzata dalla sospensione reagente al lattice restante liscio e bianco (Figura 1B). I reagenti sono ottimizzati in modo che una reazione positiva deve osservare prima della fine dell&#39;intervallo di tempo di un minuto (generalmente rilevabili in circa 20 sec). Noi non consigliamo di leggere le reazioni dopo l&#39;intervallo di tempo 1 min. Molto raramente, reazioni mostrano agglutinazione debole intorno al bordo della goccia che non sia accompagnato dalla compensazione della sospensione sfondo, o apparire &#39;filante&#39; senza sfondo clearing (dati non riportati). Questi sono più come<html> reazioni negative ly. In questi casi, si consiglia di ripetere le prove e / o ulteriori indagini utilizzando un altro metodo sierotipizzazione (per esempio la reazione Quellung 17). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Le reazioni di agglutinazione al lattice positive e negative. Preparazioni dei pneumococcica isolare mescolati con il reagente di agglutinazione al lattice che mostra una reazione positiva (A) o una reazione negativa (B). Agglutinazione accompagnato dalla compensazione dello sfondo si vede nella reazione positiva (A) .C&#39;è nessuna agglutinazione visibile con il reagente di controllo negativo lattice o in una reazione test negativo (B). Fotografie 8 utilizzati con il permesso.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Test di agglutinazione al lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae, ed è anche stato ampiamente applicato in microbiologia diagnostica. Questo manoscritto descrive la produzione interna dei reagenti di agglutinazione al lattice, procedure di controllo della qualità e l&#39;applicazione di questa tecnica per sierotipizzazione pneumococco.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Da agglutinazione al lattice

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.8K Views.  Murdoch Childrens Research Institute.  Test di agglutinazione al lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae, ed è anche stato ampiamente applicato in microbiologia diagnostica. Questo manoscritto descrive la produzione interna dei reagenti di agglutinazione al lattice, procedure di controllo della qualità e l'applicazione di questa tecnica per sierotipizzazione pneumococco. 

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Metodo di particelle agglutinazione per l&#39;identificazione Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Biochimica

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Sperimentale trasporto pneumococco umano

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Medicina

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo della reazione Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualizzazione<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Entro cardiache microlesioni e successive rimodellamento cardiaco

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Bioingegneria

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Capsulare Sierotipizzazione di

Riepilogo

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Metodo di particelle agglutinazione per l'identificazione Poliovirus