MH riconosce il sostegno della &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; (DFG). Autore Contributi: MH progettato ricerca; KT, JS e MT svolto attività di ricerca e analizzato i dati, KT e MH ha scritto il giornale.

1. Coltura di Chlamydomonas <ol><li> Il seguente C. reinhardtii ceppi sono stati utilizzati nel presente studio: WT cc124, WT cw15-arg7 (parete cellulare carente e arginina auxotroph), un ceppo mutante ΔPSI 29 e un pgrl1 knock-out ceppo 4. </li><li> Tutti i ceppi sono stati coltivati ​​in Tris-acetato-fosfato (TAP)-mezzo 30, a 25 ° C con una intensità di luce continua di 20-50 μE / m 2 sec e agitazione a 120 rpm. La cultura della ΔPSI deve essere avvolto con della carta tissue per esposizione alla luce &lt;5 μE / m 2 sec. </li><li> Le culture dei ceppi etichettati (ΔPSI e WT cc124, rispettivamente) contenevano 7,5 mm 15 N NH 4 Cl, mentre le colture di ceppi nonlabeled (WT cw15-arg7 e pgrl1, rispettivamente) contenevano 7,5 mm 14 N NH 4 Cl. Le cellule devono crescere per almeno quattro generationi per raggiungere la piena etichettatura e devono essere mantenuti a fase di crescita esponenziale. </li><li> Il giorno prima di iniziare il conteggio dell&#39;esperimento e diluire le cellule ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in un volume di almeno 750 ml / ceppo. </li></ol> Si prega di notare che due tipi di gradiente discontinuo di densità di saccarosio sono descritte nella seguente protocollo. I gradienti di densità di saccarosio fotosistema secondo Takahashi et al. 9 sono utilizzati per separare i diversi complessi proteici fotosintetici da tilacoidi isolati e solubilizzate durante durante la notte centrifugazione e devono essere preparati il giorno prima (vedi protocollo 2) ed i tilacoidi gradienti di densità di saccarosio 8 sono applicati nella procedura di isolamento tilacoidale (vedi protocollo 3). 2. Preparazione del fotosistema saccarosio gradienti di densità <ol><li> Per versare le pendenze sono necessarie tre soluzioni stock: <ol><li> 2 M saccarosio </li><li> 10% β-DM in H 2 O </li><li> 0,5 M Tricina, pH 8,0 (NaOH) </li></ol></li><li> L&#39;utilizzo di questi titoli, preparare le seguenti soluzioni: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> Concentrazione: </td><td style="width:75px;"> 1.3 M </td><td style="width:75px;"> 1,0 M </td><td style="width:75px;"> 0.85 M </td><td style="width:75px;"> 0,7 M </td><td style="width:75px;"> 0.65 M </td><td style="width:75px;"> 0,4 M </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 2 M saccarosio </td><td style="width:75px;"> 13 ml </td><td style="width:75px;"> 10 ml </td><td style="width:75px;"> 8.5 ml </td><td style="width:75px;"> 7 ml </td><td style="width:75px;"> 6.5 ml </td><td style="width:75px;"> 4 ml </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 10%46;-DM </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 0,5 M Tricina </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td></tr><tr height="20"><td height="21" style="height:20px;width:94px;"> H 2 O </td><td style="width:75px;"> 6.7 ml </td><td style="width:75px;"> 9.7 ml </td><td style="width:75px;"> 11.2 ml </td><td style="width:75px;"> 12.7 ml </td><td style="width:75px;"> 13.2 ml </td><td style="width:75px;"> 15.7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Utilizzare 14 millimetri tubi x 89 millimetri centrifuga e versare le pendenze molto lentamente, a partire con la soluzione di più alta densità di saccarosio per la soluzione minore densità. </li><li> Versare solo 1 ml ciascuno per i 1.3 e 1.0 M soluzioni e 2 ml per il resto delle soluzioni. </li><li> Lasciare gradienti durante la notte in cella. </li></ol> 3. Anaerobica Induzione e isolamento di tilacoidale Membrane 8 <ol><li> Prima di iniziare con l&#39;isolamento delle membrane tilacoidi, indurre condizioni anaerobiche con argon per 4 ore. La formazione di bolle può essere effettuata tramite una pipetta di vetro in coltura fiaschi con una costante miscelazione della cultura con un bastoncino magnetico. </li><li> Iniziare con l&#39;isolamento delle membrane tilacoidi pastigliando le cellule per 5 minuti a 2500 xg, risospendere in tampone H1 (0,3 M saccarosio, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl 2). (Si prega di notare che quando si inizia con l&#39;isolamento di tilacoidali membrane campioni should essere tenuti in ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine, tutte le fasi di centrifugazione sono eseguite a 4 ° C e lavorare con i guanti si consiglia vivamente di evitare la contaminazione cheratina.) </li><li> Cellule pellet per 5 min a 2500 xg, risospendere in tampone H1. </li><li> Rompere le celle con due passaggi attraverso un nebulizzatore con una pressione di azoto di 1500 hPa (per i ceppi senza parete cellulare solo fare un passaggio). </li><li> Spin le cellule per 7 minuti a 2500 x g. (Dopo questo passo il surnatante deve essere di colore verde chiaro, in caso contrario, la rottura delle cellule non è riuscita.) </li><li> Risospendere le cellule in tampone H2 (0.3 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e cellule pellet per 10 min a 32800 x g. </li><li> Risospendere le cellule in tampone H3 (1.8 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e omogeneizzare pellet con potter (senza particelle verdi dovrebbero rimanere alla fine di questa fase di lavorazione). </li><li> Preparare tilacoidali gradienti di densità di saccarosio in vascaes (25 millimetri x 89 mm) avviando in fondo con uno strato di 12 ml H3 buffer con le cellule, versare uno strato intermedio di 12 ml di tampone H4 (1.3 M saccarosio, 5 HEPES mM (pH 7,5), EDTA 10 mM ( pH 8,0)) e sulla parte superiore 12 ml di tampone H5 (0,5 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). Prestare attenzione quando si versa le pendenze ed evitare la miscelazione dei tre strati. </li><li> Equilibrio con tampone H5 e centrifugare tilacoidali gradienti di densità di saccarosio per 1 ora a 70.700 x g. </li><li> Rimuovere le bande tilacoidali dalle tilacoidali gradienti di densità di saccarosio e diluirli con un adeguato volume di tampone H6 (5 HEPES mM (pH 7,5) EDTA 10 mM (pH 8,0)). </li><li> Spin le cellule a 37.900 xg per 20 min. Se il pellet non è stretto, più di buffer H6 è necessario per questa fase di centrifugazione. </li><li> Risospendere tilacoidi in un buffer H6 piccolo volume e procedere con determinazione della concentrazione di clorofilla. </li></ol> 4. Determinazione della clorofilla Concentrazione 31 </sup&gt; <ol><li> La determinazione della quantità clorofilla viene eseguita con 80% acetone. </li><li> Mescolare 995 ml 80% acetone e 5 ml di tilacoidi in tampone H6 (diluizione 1:200). </li><li> Vortex per alcuni secondi fino particelle verdi rimangono e poi girano giù a 14.1 g per 5 min. </li><li> Prendete il surnatante e misurare l&#39;estinzione a 663,6 e 646,6 nm e 750 nm, rispettivamente. </li><li> Calcolare la quantità di clorofilla utilizzando le seguenti formule: <ol><li> C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * fattore di diluizione </li><li> C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * fattore di diluizione </li><li> C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b </li></ol></li></ol> 5. Caricamento del fotosistema saccarosio gradienti di densità <ol><li> Calcolare la quantità di tilacoidi, β-DM e tampone H6 che sono necessariper ogni sfumatura: <ol><li> Ogni sfumatura deve essere caricata con un volume totale di 700 ml con 0,8 mg / ml clorofilla a 0,9% β-DM (sciogliere β-DM in H 2 O), riempire il volume rimanente con tampone H6. </li></ol></li><li> Per solubilizzazione preparare diverse aliquote con tilacoidi, β-DM e tampone H6 per ogni sfumatura. </li><li> Lasciare i campioni per 20 minuti sul ghiaccio con mescolando regolarmente (invertito) ogni pochi minuti (solubilizzazione passo). </li><li> Centrifugare alla massima velocità (14.000 xg) per 10 min a 4 ° C. (Dopo centrifugazione, il pellet dovrebbe essere piccolo e biancastro mentre il surnatante è verde scuro.) </li><li> Caricare surnatante sulle pendenze. </li><li> Equilibrio con tampone H6 e spin usando Ultracentrifuge a 134.470 xg durante la notte (14 ore) a 4 ° C. (Si prega di notare che il successo separazione dei complessi fotosintetici utilizzando gradienti di densità fotosistema saccarosio come presentato in questo protocollo si ottiene solo quando using isolate di fresco tilacoidi, poiché una previsione per solubilizzazione e separazione complesso è difficile fare quando si lavora con membrane tilacoidi che sono stati congelati prima.) </li></ol> 6. Frazionamento del fotosistema saccarosio gradienti di densità <ol><li> Scattare foto dei gradienti. </li><li> Perforare un foro nella parte inferiore del tubo con ago e gradienti frazionare in tubi 500 microlitri. In alternativa, il frazionamento può essere eseguita anche utilizzando una piastra a 96 pozzetti (micropiastra). </li><li> Quando si utilizza una micropiastra, determinare l&#39;assorbanza delle diverse frazioni gradiente a 675 nm. (A questo passo campioni possono essere conservati a -80 ° C per alcune settimane.) </li></ol> 7. SDS-PAGE e immunorivelazione (Si prega di notare che solo per il confronto delle WT vs ΔPSI è stata effettuata un&#39;analisi western blot per selezionare le frazioni per la successiva MS-analisi. Per l&#39;esperimento WT vs pgrl1 frazioni sono stati scelti mediante l&#39;assorbanza nelle diverse frazioni.) <ol><li> Separa i 30 ml di ogni frazione di WT e ΔPSI sfumato su un 13% di SDS poliacrilammide gel 32. </li><li> Eseguire l&#39;analisi Western Blot 33 utilizzando i seguenti anticorpi: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, il PSI subunità psad 32 e il PSII nucleo subunità D1. Utilizzare tutti gli anticorpi con una diluizione di 1:1000 (per una migliore tecnica chemiluminescenza), fatta eccezione per l&#39;anticorpo D1, che dovrebbe essere utilizzato con una diluizione di 1:10.000. </li><li> Sulla base dei risultati del immunorivelazione, prendere le frazioni di picco di ANR1, PGRL1 e PSAD per WT e ΔPSI (qui frazioni 6 e 13, rispettivamente), miscelare 30 ml di frazione 6 da WT e ΔPSI e fare lo stesso con la frazione da 13 entrambi preparati e li separano di nuovo su un gel SDS poliacrilammide 13%. </li><li> Per il confronto quantitativo di WT vs pgrl1 prendere la CFrazioni EF-supercomplex come determinata misurando l&#39;assorbanza nelle diverse frazioni gradiente e Mescolare 30 ml di entrambi i campioni seguiti da separazione su gel di poliacrilammide SDS 13%. </li><li> Macchiare le bande proteiche con una soluzione di Coomassie (85% acido fosforoso, 757 mM di solfato di ammonio, 1,2% blu brillante Coomassie, 20% metanolo) per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. </li><li> Per rimuovere la colorazione aspecifica, lavare più volte con DDH 2 O. </li><li> Tagliare le corsie a 1 millimetro pezzi di gel e procedere con la digestione in-gel. (In alternativa, i campioni possono essere asciugati in pochi minuti in una centrifuga a vuoto e conservati per un paio di settimane prima di continuare con la digestione in-gel.) </li></ol> 8. In-gel Digestione (Modificato da Shevchenko et al. 35) Si prega di notare per preparare tutti i buffer e le soluzioni poco prima dell&#39;uso e prendere bottiglie di vetro per tamponi contenenti acetonitrile (ACN). &lt;br /&gt; ATTENZIONE! Lavorare con ACN potrebbe essere dannoso; ulteriori informazioni può essere scaricato da: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013). <ol><li> Lavare i pezzi di gel con&gt; 10 volumi di DDH 2 O (~ 200 ml) per 30 sec. </li><li> Incubare i pezzi di gel con 300 ml di 25 mM NH 4 HCO 3 per 15 minuti con agitazione, rimuovere il liquido. </li><li> Incubare i pezzi di gel con 300 ml di 25 mM NH 4 HCO 3 nel 50% ACN (prepara mescolando ACN e 50 NH mm 4 HCO 3 con un rapporto di 1:1) per 15 minuti con agitazione, rimuovere il liquido. </li><li> Se i pezzi gel sono ancora blu, ripetere l&#39;NH 4 HCO 3 e NH 4 HCO 3 / ACN lava fino a quando la maggior parte del Coomassie viene rimosso. (Anche se la maggior parte di Coomassie colorante deve essere rimosso, non è necessario Destain completamente i pezzi di gel.) </li><li> Aggiungere 100 ml di ACN a disidratare i pezzi di gel per 5 min. I pezzi di gel dovrebbero ridurre unand guardare completamente bianco. </li><li> Rimuovere il più ACN possibile e procedere con tripsina digestione. In alternativa, i campioni possono essere conservati a -20 ° C per alcune settimane. </li><li> Aggiungere 10-20 ml per ogni gruppo di 20 ng / mL tripsina nel 10% ACN / 25 NH mm 4 HCO 3 (appena diluito), mantenere i campioni in ghiaccio. </li><li> Dopo 30 minuti, controllare se tutto soluzione è stata assorbita e aggiungere più tampone tripsina, se necessario. Pezzi di gel devono essere completamente coperti con tampone di tripsina. Conservare i campioni in ghiaccio. </li><li> Lasciare pezzi di gel per altri 90 minuti sul ghiaccio di saturare loro con tripsina. (Passaggio critico: la resa di peptidi triptici aumenta notevolmente con l&#39;aumentare i tempi di incubazione in ghiaccio, probabilmente a causa della lenta diffusione dell&#39;enzima nella matrice poliacrilammide E &#39;necessario avere un piccolo eccesso di soluzione copre i pezzi di gel per evitare che i pezzi. cadere asciutto durante la notte di incubazione.) </li><li> Digerire a 37 ° C per 4-6 ore. Per esperimenti che richiedonorecupero peptide massimo, digerire durante la notte. </li><li> Dopo la digestione spin down del buffer condensato. </li><li> Tubi ultrasuoni per 5 min a eluiscano peptidi e centrifugare di nuovo. </li><li> Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta. </li><li> Procedere all&#39;estrazione del peptide con 80 ml di 30% ACN / acido formico 1% (FA) in un bagno sonico per 15 min. </li><li> Eseguire l&#39;estrazione con 80 ml di 30% ACN / 1% FA in un bagno sonico per 15 min. </li><li> Eseguire l&#39;estrazione con 80 ml di 70% ACN / 1% FA in un bagno sonico per 15 min. </li><li> Centrifuga di nuovo e la piscina surnatante con l&#39;eluato precedente. (FA serve per inattivare la tripsina e aumentare il peptide solubilità.) </li><li> Soluzione peptide asciugare completamente in una centrifuga a vuoto. (A questo punto i campioni possono essere conservati per un paio di settimane a -20 ° C prima di procedere con MS-analisi.) </li><li> Peptidi Risospendere in 6 microlitri di buffer MS (5% ACN, 0,1 v / v FA, acqua) e ultrasuoni per 2-5 min. </li><li> Centrifugare i campioni a maximum velocità per 5 minuti per rimuovere il materiale particolato. </li><li> Utilizzare 4 ml di surnatante per l&#39;analisi di spettrometria di massa. </li></ol> 9. MS-Analisi dei dati con &quot;Proteomatic&quot; L&#39;analisi dei dati è stata effettuata con il software open-source &quot;Proteomatic&quot; (che può essere scaricato http://www.proteomatic.org/), una piattaforma che consente la generazione e completamento di MS / MS condotte valutazione dei dati in base software libero e commerciale 36. In breve, le impostazioni sono descritte di seguito e più dettagliate informazioni possono essere trovati in 6,26. <ol><li> Identificazione e quantificazione di MS-dati Identificazione e quantificazione delle proteine ​​dal esperimenti WT vs ΔPSI sono state fatte con OMSSA (versione 2.1.4 37) e qTrace 26, rispettivamente, come descritto 6,26. Per l&#39;analisi MS-dati dall&#39;esperimento WT vs pgrl1 seguente conduttura aggiornato è stato utilizzato:<ol><li> Oltre a OMSSA 37, proteine ​​sono state anche identificate con X! Tandem (versione 2013/02/01 38). Entrambi gli algoritmi sono stati applicati da una ricerca su un database generato combinando il JGI Chlamydomonas database model gene versione 4.3 con la versione del database AUGUSTUS 10.2, nonché un database unita del NCBI banche dati BK000554.2 e NC_001638.1. </li><li> MS 2 Identificazione di peptidi è stata effettuata utilizzando un approccio target-richiamo 39. Un richiamo per ogni proteina è stato creato da mischiare a caso peptidi triptici, pur mantenendo la ridondanza dei peptidi nonproteotypic. </li><li> Validazione statistica dei peptidi è stata effettuata con il software qvality (versione 0.3.3 40) con una probabilità di errore posteriore (PEP) soglia inferiore a 0,01 e risultati sono stati filtrati con una tolleranza massa precursore di 5 ppm. </li><li> Peptidi da OMSSA e X! Corre Tandem sono state riunite e quantificate con qTrace <sup&gt; 26 applicando i seguenti passaggi filtranti: richiede MS 2 Identificazione, aggiungere i nomi di proteine ​​/ informazioni sul gruppo e richiedono entrambi i peptidi sorella. </li></ol></li></ol> Per studiare se Proporzioni proteina erano significativamente differenti l&#39;una verso l&#39;altra nelle frazioni CEF-supercomplex contrastanti da WT e pgrl1, analisi statistica è stata effettuata applicando il software SPSS (versione 21). Le subunità del citocromo b complesso 6 / f sono stati testati contro l&#39;altro, così come le proteine ​​FNR, FTSH2 e HCF136 contro le subunità PSI. I rapporti peptidici ogni conteggio scansione per proteine ​​di tutti i quattro replicati sono stati testati per la distribuzione normale con il test di Shapiro-Wilks. Poiché le popolazioni peptide non erano normalmente distribuiti (p &lt;0.001), sono stati eseguiti statistica non parametrica. In primo luogo, il test di Kruskal-Wallis è stato applicato valutare una divergenza significativa tra i gruppi. Solo se questo test previsto differenza significativas tra gruppi, ulteriori analisi è stata effettuata per prevedere differenze significative tra i due gruppi indipendenti con il test di Mann-Whitney-U.

Gli autori dichiarano assenza concorrente interesse finanziario.

Diversi studi di proteomica quantitativa, utilizzando l&#39;etichettatura degli isotopi stabili sono stati pubblicati negli ultimi anni. In questi esperimenti solitamente due diversi campioni sono confrontati, di cui un campione è marcato con un isotopo stabile. Successivamente proteine ​​o peptidi dai due campioni vengono combinati in un rapporto uguale e successivamente trattati insieme 48. Tali studi spesso intendono confrontare compartimenti definiti isolati cellulari (ad esempio cloroplasti...

Processi fotosintetici nelle membrane tilacoidi di piante e alghe possono funzionare in modo lineare e ciclica. Durante lineare flusso di elettroni (LEF) fotosistema I (PSI), fotosistema II (PSII) e citocromo b 6 / f definitiva trasferire elettroni dall&#39;acqua al NADP + 1, che porta alla generazione di NADPH e ATP 2. Al contrario, ciclico flusso di elettroni (CEF), che è noto per essere indotta in diverse condizioni ambientali come stato 2 e 3 anaerobici condizioni 4, provoca la re-riduzione del PSI ossidato iniettando elettroni indietro nella catena di trasporto degli elettroni. Questo processo può avvenire sia sul lato stromale del citocromo b complesso di 6 / f 1 o in piscina plastoquinone 5 e genera ATP, ma non NADPH 2. Lo scopo del protocollo presentato è dimostrare una spettrometria di massa (MS) m basatoetodo per il confronto, l&#39;analisi quantitativa dei complessi multiproteici nelle membrane tilacoidi di Chlamydomonas reinhardtii al fine di conoscere la composizione di questi complessi in condizioni diverse (esemplificati confrontando ceppi geneticamente differenti). Questo approccio è stato applicato in una pubblicazione di Terashima et al. Nel 2012 mostra un Ca 2 +-dipendente regolamento del CEF in C. reinhardtii mediata da un complesso multiproteico comprese le proteine ​​CAS, ANR1, e PGRL1 6. La procedura verrà spiegata analizzando comparativamente la composizione del CEF-supercomplex in due ceppi geneticamente diversi, sfruttando così etichettatura uno dei due ceppi con azoto pesante (15 N). Brevemente, il protocollo prevede la preparazione di membrane tilacoidi, seguita da detersivo solubilizzazione e frazionamento di complessi fotosintetici in un gradiente di densità di saccarosio. Dopo frazionamento del gradiente, Frac selezionatozioni di due ceppi sono mescolati basano sulla parità di volume, separate mediante SDS-PAGE seguita da in-gel digestione e successiva analisi MS quantitativa. Come accennato in precedenza, CEF è indotta in diverse condizioni ambientali e una pubblicazione dal 2010 dimostra l&#39;isolamento di un funzionale CEF-supercomplex da stato 2 celle bloccate di C. reinhardtii 7, che è stata eseguita separando membrane tilacoidi solubilizzate su un gradiente di saccarosio durante ultracentrifugazione. Diverso da Iwai et al. 7, il protocollo presentato descrive l&#39;isolamento del CEF-supercomplex da anaerobico cresciuto C. culture reinhardtii seguendo una procedura alternativa. Questo comprende cambiamenti nel protocollo di isolamento tilacoidi nonché le differenze riguardanti la fase di solubilizzazione e la separazione dei complessi proteici mediante ultracentrifugazione. Nel presente protocollo, le membrane tilacoidisono isolati applicando la procedura pubblicata da Chua e Bennoun 8, mentre i buffer utilizzati per la preparazione tilacoidi da Iwai et al. contenute Mes 25 mM, saccarosio 0,33 M, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) come descritto 9. La solubilizzazione è stata effettuata con 0,7-0,8% di detergente (n-tridecil-β-D-maltoside) per 30 min in ghiaccio in caso di Iwai e collaboratori, mentre il metodo di solubilizzazione qui descritto si basa sull&#39;utilizzo di 0,9% di detergente (n -Dodecil-β-D-maltoside (β-DM)) e viene eseguita solo per 20 min in ghiaccio. Entrambi i gruppi utilizzati 0,8 mg di clorofilla per ml per la solubilizzazione con il rispettivo detersivo. Per la separazione dei complessi fotosintetici dalle membrane tilacoidi solubilizzate Iwai et al. Applicato concentrazioni di saccarosio tra 0,1-1,3 M, che di questo protocollo gli autori hanno utilizzato concentrazioni comprese 0,4-1,3 M. L&#39;ultima differenza è la velocità di centrifugazione, che è inferiore rispetto Per il bisrlier pubblicazione. Solubilizzazione delle membrane tilacoidi con detergenti non ionici seguite da densità gradiente di saccarosio frazionamento già applicato in numerosi studi che vanno dal 1980 fino ad oggi 7, 9-14 e anche l&#39;applicazione di marcatura metabolica delle proteine ​​è un metodo diffuso nel campo proteomica. L&#39;approccio descritto si applica l&#39;etichettatura 15 N metabolica per uno dei due ceppi confrontati da coltura in presenza di azoto pesante come unica fonte di azoto in forma di 15 N NH 4 Cl, che è integrata in tutti gli aminoacidi che conducono ad una massa spostare a seconda della sequenza amminoacidica del peptide. Quando si analizza una miscela di 14 N e 15 N entro un MS eseguito, questo spostamento di massa può essere utilizzato per determinare l&#39;origine del campione per ogni peptide e peptide abbondanza relativa possono essere calcolati rappresentano abbondanze relative per l&#39;corrispondonoing proteine ​​15. Numerosi studi di proteomica quantitative C. reinhardtii sono disponibili, che confronta una quantità definita di proteine ​​per analizzare i cambiamenti del proteoma tra le condizioni sperimentali (ad esempio cambiamenti nella proteoma a causa di nutrienti 16-19 o alla luce di stress 20,21). Rispetto a tali studi, nell&#39;approccio attualmente presentata uguali volumi di campioni vengono combinati e analizzati. Questa configurazione permette di studiare il comportamento di migrazione delle proteine ​​all&#39;interno del gradiente ed inoltre per analizzare la composizione di diversi complessi rispetto ai ceppi esaminati. Questo metodo sarà spiegata principalmente da concentrandosi su tre proteine: Il primo candidato è il calcio proteina sensore CAS cloroplasto-localizzato, che ha dimostrato di essere coinvolti in foto-acclimatazione in C. reinhardtii 22. Il calcio è considerato un segnale importantezione di ioni per percorsi che vengono attivati ​​a causa di diversi stress biotici e abiotici, infine, che porta a cambiamenti nell&#39;espressione genica e fisiologia cellulare 23 ed è stato proposto che cloroplasti potrebbero contribuire a cellulare Ca 2 + segnalazione tramite la proteina CAS 22,24,25. La seconda proteina è ANR1 (risposta anaerobica 1 6), una proteina che ha dimostrato di essere indotta in condizioni anossiche crescita in C. reinhardtii 26. In particolare, CAS nonché ANR1 sono stati identificati come subunità del CEF-supercomplex ed inoltre, utilizzando approcci di genetica inversa, è stato dimostrato che entrambe le proteine ​​contribuiscono funzionalmente al CEF in vivo 6, sostenendo il loro ruolo di subunità funzionali di questo complesso proteico. La terza proteina è la proteina tilacoidi PGR5-Like 1 (PGRL1), che ha dimostrato di essere coinvolti in CEF in Chlamydomonas 4,27 e 5,28 in Arabidopsis e era anche identified nel lavoro di Iwai et al. 7 Questo approccio sarà presentato mostrando i risultati di due esperimenti diversi: di tipo selvatico (WT) contro (vs) una ΔPSI 29 ceppo, esibendo una delezione del gene PSAB, che codifica per un fotosistema I essenziale subunità, che è anche parte del CEF-supercomplex e WT contro un pgrl1 knock-out ceppo 4. Per ciascuno di questi esperimenti la composizione quantitativa del CEF-supercomplex tra 15 N e un ceppo 14 N-marcato è stato confrontato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1135">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Chemicals</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetone</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Acetonitrile Optigrade f&#252;r LC-MS</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">9340</td>
			<td style="width:199px;">harmful, work with gloves 
			see protocol text for further precautions</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Ammonium chloride 15N</td>
			<td style="width:427px;">Cambridge Isotope Laboratories 
			website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td>
			<td style="width:119px;">39466-62-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium chloride 14N</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium sulfate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:427px;">Fisher Scientific 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td>
			<td>10041653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formic acid&#160;&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hepes</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td>A4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phosphorous acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Di-Potassium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Potassium di-hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tricine</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Tris</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer</td>
			<td style="width:427px;">Promega 
			website: http://www.promega.de/</td>
			<td style="width:119px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Neboulizer (BioNeb cell disruptor)</td>
			<td style="width:427px;">Glas-Col 
			website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes (14 x 89 mm)&#160; 
			for preparation of takahashi style gradients</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes 25 x 89 mm 
			for preparation of thylakoid isolation gradients&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fuchs-Rosenthal cell couting chamber</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">449/72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Homogenizer (Potter) 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">10618242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Pistil for homogenizer</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">105252220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Other</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Antibodies&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Agrisera 
			website: http://www.agrisera.com/en/index.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15n metabolic labeling and quantitative mass spectrometry

Il protocollo introdotto fornisce uno strumento per l&#39;analisi di complessi multiproteici nella membrana tilacoidi, rivelando intuizioni composizione complessa in condizioni diverse. In questo protocollo l&#39;approccio è dimostrato confrontando la composizione della proteina complessa responsabile ciclico flusso di elettroni (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolata da ceppi geneticamente diversi. Il procedimento comprende l&#39;isolamento di membrane tilacoidi, seguita dalla loro separazione in complessi multiproteici da centrifugazione su gradiente di densità di saccarosio, SDS-PAGE, immunodetection e comparativa, spettrometria di massa quantitativa (MS) basato su marcatura metabolica differenziale (14 N / 15 N) del ceppi analizzati. Detergente membrane tilacoidi solubilizzate vengono caricati su gradienti di densità di saccarosio in concentrazione pari clorofilla. Dopo ultracentrifugazione, le pendenze sono separati in frazioni, che vengono analizzati dai mass-spectrometry basato sulla parità di volume. Questo approccio permette l&#39;indagine della composizione all&#39;interno delle frazioni gradiente ed inoltre per analizzare il comportamento di migrazione di diverse proteine, in particolare concentrandosi su ANR1, CAS, e PGRL1. Inoltre, questo metodo è dimostrato confermando i risultati con immunoblotting e inoltre sostenendo i risultati di studi precedenti (identificazione e di migrazione PSI-dipendente delle proteine ​​precedentemente descritti a far parte del CEF-supercomplex come PGRL1, FNR, e cyt f). In particolare, questo approccio è applicabile ad affrontare una vasta gamma di domande per le quali questo protocollo può essere adottato e, ad esempio utilizzato per le analisi comparative dei multiproteico composizione complessa isolato da condizioni ambientali diverse.

L&#39;approccio di proteomica quantitativa introdotto mira a caratterizzare la composizione dei complessi multiproteici in membrane tilacoidi dimostrato dall&#39;analisi comparata dei componenti CEF-supercomplex in geneticamente differenti C. reinhardtii ceppi. Il metodo descritto è stato applicato con successo da Terashima et al. 6 e comprende l&#39;isolamento di membrane tilacoidi da colture anaerobiche cresciuta, seguiti da solubilizzazione detergente. Successivamente, i campioni vengono...

Watch this Scientific Journal Video about A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry at JoVE.com

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Il confronto, approccio di proteomica quantitativa descritta mira ad ottenere intuizioni nella composizione dei complessi multiproteici in condizioni diverse ed è dimostrato dal confronto ceppi geneticamente diversi. Per l&#39;analisi quantitativa volumi uguali di frazioni diverse da un gradiente di densità di saccarosio sono mescolati e analizzati mediante spettrometria di massa.

Un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

12.1K Views.  University of Münster.  Il confronto, approccio di proteomica quantitativa descritta mira ad ottenere intuizioni nella composizione dei complessi multiproteici in condizioni diverse ed è dimostrato dal confronto ceppi geneticamente diversi. Per l'analisi quantitativa volumi uguali di frazioni diverse da un gradiente di densità di saccarosio sono mescolati e analizzati mediante spettrometria di massa. 

Video: A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Ricerca

Biologia

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio &amp; massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantificazione di site-specific Protein lisina acetilazione e stechiometria Succinylation usando la spettrometria totale di acquisizione dati-indipendente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...