Gli autori ringraziano i membri del gruppo di Sharon per la loro revisione critica e per il loro contributo al manoscritto. Siamo grati per il sostegno dei Programmi Morasha e Bikura, la Israel Science Foundation (Grant numeri 1823-1807 e 378/08), Josef Cohn Minerva Centro per la Ricerca Biomembrane, il Programma per la Famiglia Chais Fellows nuovi scienziati, Abramo e Sonia Rochlin Fondazione, la famiglia Wolfson Charitable Trust, la Helen e Milton A. Kimmelman Centro per la Struttura Biomolecolari e dell&#39;Assemblea, la tenuta di Shlomo e Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, e Karen Siem, Regno Unito. Siamo grati a Dan Tawfik e Itamar Yadid per averci dato l&#39;esempio lectina variante.

Parte 1: Preparazione di oro rivestite capillari per la ionizzazione elettrospray nanoflussi Analisi di complessi non covalenti è di solito eseguita per mezzo di ionizzazione elettrospray nanoflussi (NESI) 6, con vetro o quarzo capillari che sono stati tirati a punta fine (diametro ~ 1 micron interno), e rivestiti con materiale conduttivo (di solito oro) . Tali capillari sono disponibili pronti per l&#39;uso-da fonti commerciali (Nuovo obiettivo o Proxeon), tuttavia, può essere più conveniente per prepararli in casa: <ol><li> Bastone due strisce di una doppia faccia pad adesivo al fondo di una capsula di Petri, 2 cm di distanza. Inserire una bacchetta di vetro (8 cm x 5 mm) al centro di una delle pastiglie. Il pad adesivo terrà i capillari in posizione, e la bacchetta di vetro sosterrà il preparato capillari, e tenere le punte di rottura (Fig. 1). </li><li> Usa vetro borosilicato capillari, 1,0 mm x 0,78 mm di diametro (usiamo confezioni da 500 a pareti sottili capillari in borosilicato da Warner Instruments, cat. No. G100TF-4). Inserire una capillare nel estrattore ago (usiamo il modello P-97 dello strumento Sutter Co.). Bloccare il capillare dolcemente in posizione, e regolarne la posizione in modo che si trova nel centro del filamento di riscaldamento dell&#39;ago di estrattore. Serrare i morsetti delicatamente, fino a quando il capillare è tenuto fermo alle due estremità. </li><li> Tirare il capillare, utilizzando un programma predefinito. Ogni capillare tirato darà luogo a due finali, a forma di capillari. Il processo di programmazione l&#39;estrattore è uno dei tentativi ed errori, fino a una forma accettabile punta si ottiene. Noi usiamo il seguente programma: <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Calore </td><td> Tirare </td><td> Vell </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Rimuovere la tirato capillari dallo strumento e controllare le punte, scartando quelle che vengono deformati o rotti. Usa smussato pinzette (usiamo pinzette di precisione di posizionamento da CK), al posto dei capillari nella scatola di Petri. La base del capillare deve essere allegata al pad adesivo e la parte superiore deve appoggiarsi la bacchetta di vetro, con la punta rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Una volta che la capsula di Petri è pieno (circa 80 in forma capillari in un cm di diametro 10 piatto), inserire la piastra in oro sputter verniciatore (usiamo il modello no. EMS550, da EMS). Assicurarsi che il gas viene scelto in base alle istruzioni del produttore, e attivare un ciclo predefinito rivestimento (che usano la pressione Argon 4 PSI, ad una pressione di vuoto di 5 x 10 -2 mbar, una corrente di 45 mA, e un tempo di rivestimento di 1 min, per 3-6 cicli, fino a quando i capillari sono uniformemente dorate). </li></ol> Parte 2: Preparazione dei campioni <ol><li> Micromolari basse concentrazioni di campione sono tenuti (1 - 20 micron). Se necessario, concentrare l&#39;esempio utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione centrifugo (per esempio, Vivaspin Sartorius, o NanoSep da Pall Corporation). Si consiglia di verificare l&#39;assorbimento del complesso proteina alla membrana dispositivo, prima dell&#39;uso. </li><li> Spesso, i buffer di purificazione o di soluzioni di storage del complesso di proteine ​​non sono compatibili con Nesi, per cui solo soluzioni volatili possono essere utilizzati. Pertanto, buffer di scambio è necessario. Questa fase critica, in cui vengono rimosse tutte le tracce di sali, molecole tampone o qualsiasi altro non volatili addotti come il glicerolo, DTT, o EDTA, determina la qualità degli spettri. Di solito, soluzione acquosa di acetato di ammonio è usato, ad una concentrazione compresa tra 5 mm e 1 M, a 6-8 e pH. Buffer di scambio può essere eseguito utilizzando un gel colonna microcentrifuga filtrazione (ad esempio, Micro Bio-Spin 6 colonne cromatografiche da Bio-Rad). Questa operazione può essere ripetuta 1-3 volte con la diluizione minima (meno di un fattore pari a 1,3 per dispositivo 5), fino a quando lo scambio massimo è raggiunto. Se entrambi concentrazione e lo scambio di buffer sono necessari, questi possono essere fatto insieme, utilizzando ultrafiltrazione centrifuga (e, g., Vivaspin Sartorius, o NanoSep da Pall Corporation). </li></ol> Parte 3: Calibrazione lo spettrometro di massa per misure di massa ad alta La maggior parte degli esperimenti condotti su multi-proteina complessi vengono eseguite utilizzando un electrospray nano quadrupolo-tempo di volo (Q-TOF) strumento. Si consiglia di utilizzare un filtro quadrupolo di massa regolare alle basse frequenze, per consentire l&#39;analisi e la trasmissione di massa di ioni ad alta m / z valori 7,8. E &#39;raccomanda inoltre di ingressi gas 7,8 o 9 maniche essere aggiunte allo strumento nella guida agli ioni di prima, per permettere il controllo della pressione nella fase di vuoto per primo. Quest&#39;ultimo consente l&#39;ottimizzazione della trasmissione, e desolvatazione di ioni molto grande 7-9. Attualmente, commerciale ESI-TOF e Q-ToF strumenti sono disponibili presso diversi produttori (per esempio, Waters, SCIEX, Bruker, o Agilent) che possono essere modificate in modo relativamente semplice e conveniente, per le applicazioni native di MS 7,8. E &#39;possibile, tuttavia, di utilizzare configurazioni standard o ToF QTof su strumenti come LCT o QToF1 (Waters) per acquisire spettri di massa per i complessi fino a 1 MDA, senza la necessità di modifiche hardware 5. Il protocollo descritto di seguito è stata condotta su uno strumento Synapt (Waters). <ol><li> La preparazione di 100 mg / ml soluzione di CsI in acqua purificata. CsI ​​è utilizzato per la calibrazione di massa elevata come i grappoli sale singolarmente carica, (CSI) n Cs + si estendono su una vasta gamma di massa, da 393 m / z a oltre 10.000 (Fig. 2). </li><li> Utilizzando le pinzette smussato, prendere un capillare rivestito dalla capsula di Petri e 2μL carico della soluzione di CsI nel capillare, utilizzando una punta GeLoader Eppendorf. </li><li> Inserire il capillare nel supporto capillare, e regolare il capillare in modo che la punta è di circa 10 mm dal bordo del titolare. </li><li> Far scorrere la soluzione verso la punta del capillare sia manualmente, o usando un adattatore spin down. </li><li> Mettere il capillare sotto un microscopio ottico e tagliare la punta, con il forte AA-tipo pinzette. </li><li> Collegare il supporto capillare per l&#39;interfaccia ES nanoflussi. Ruotare la fase xyz all&#39;indietro per evitare di danneggiare i capillari, e spingere il palco nella sua posizione attivata. Il capillare deve essere collocato 1-10 mm dal cono orifizio. </li><li> Applicare la tensione capillare (1050-1400 V) e la pressione nanoflussi bassa (0,00-0,03 bar) fino a spruzzo è iniziata, quindi provare a ridurre la pressione nanoflussi ad un valore minimo. </li><li> Ottimizzare l&#39;intensità del segnale, regolando la posizione del palco xyz, la tensione capillare, la pressione nanoflussi, e il flusso di gas desolvatazione. </li><li> Per rilevare una vasta gamma di massa di CsI picco di serie, le tensioni di accelerazione deve essere ottimizzata (usiamo i seguenti parametri: capillare 1,3-1,7 kV, cono di campione 80-150V, estrazione cono 1-3 V). </li><li> Per ottimizzare la trasmissione di ioni di massa elevata, quando le condizioni desolvatazione gentile, la pressione di sostegno nella fase di vuoto iniziale, tra la sorgente e l&#39;analizzatore, dovrebbe essere aumentato. Ciò può essere ottenuto con attenzione riducendo la conduttanza della linea di vuoto di origine alla pompa di scorrimento, con la parziale chiusura della valvola di isolamento (SpeediValve). Al fine di definire il punto ottimale, il secondo dovrebbe essere fatto durante il monitoraggio l&#39;effetto sulla intensità del segnale (di solito uso 3,0-6,5 mBar). </li><li> Raccogliere circa 30 scansioni a 1 scan / sec, con un m / z intervallo compreso tra 1.000 e 15.000 m / z. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione, calibrare il TOF usando la tabella di calibrazione. </li></ol> Parte 4: analisi MS di complessi proteici integri <ol><li> Caricare il campione, come descritto (Parte 3, sezioni 2-5), e avviare spray. </li><li> Inizia l&#39;ottimizzazione iniziale del getto (parte 3, sezioni 6-9), fino a quando il segnale viene rilevato. L&#39;esatta posizione degli stati di carica è la proteina-dipendente, tuttavia, può essere previsto, utilizzando la relazione tra la massa di ioni e stato di carica media, in questo modo: (Z av) 10: Z av = 0,0778 √ (m), in cui m è la massa del complesso di Dalton. Per evitare complesso dissociazione, non scaldano il sorgente di ioni: o spegnere il riscaldatore, o mantenere la temperatura sotto i 40 ° C. </li><li> Variare la posizione capillare, cono campione e tensioni di aspirazione per massimizzare la trasmissione di ioni, e verificare con conseguente cambiamento di spettri. Un possibile punto di partenza potrebbe essere cono tensione di 100 V; estrattore cono: 1 V, la tensione capillare 1,5 kV. Ottimizzare questi parametri, in combinazione con la pressione nanoflussi. </li><li> Per migliorare desolvatazione e spogliano l&#39;acqua residua e componenti tampone, aumentare la tensione di polarizzazione e la pressione del gas nella cella di collisione. Questa operazione deve essere eseguita con attenzione, per evitare che la dissociazione del complesso. Tensioni di polarizzazione tipiche sono nel range di 10-100 V, con un flusso di gas trappola di 1-10 ml / min (Fig. 3). Regolazione manuale della regolazione RF e il profilo quadrupolo può migliorare la trasmissione degli ioni di massa elevata. </li><li> Regolare il Trap e le energie di collisione di trasferimento. Spesso, tensioni superiori sono necessari per la trasmissione di ioni di massa elevata (di solito all&#39;interno della gamma di 10-30 V). A questo punto, è importante per evitare la collisione indotta dissociazione del complesso. </li><li> Dopo un segnale stabile è reached, si raccomanda che la pressione e la tensione capillare nanoflussi essere ridotta a valori minimi, pur mantenendo stabile a spruzzo. </li></ol> Parte 5: la spettrometria di massa tandem: complessi proteici dissociare <ol><li> Una volta che un segnale ottimale e stabile è stato ottenuto, selezionare uno ione precursore. Impostare il centro di massa e la larghezza di isolamento (generalmente usiamo una risoluzione LM di 12 anni, e una risoluzione di HM tra 13 e 15). Utilizzare una vasta gamma di massa per individuare la massa alto / basso costo prodotti dissociazione. Si consiglia di impostare la m / z gamma al massimo livello, e poi ridurre a valori desiderati. Vi proponiamo la sovrapposizione di MS e MS / MS spettri, per convalidare l&#39;isolamento dello ione precursore selezionato. </li><li> Per eseguire MS / MS, dissociare lo ione precursore, aumentando l&#39;energia di collisione (CE) e la pressione sulla cella di collisione. Aumentare sia Trappola o Bonifico CE gradualmente, con incrementi di 10-20V, ed elevare la pressione del gas di collisione a 0-5 ml / min (valori comuni). Monitorare i cambiamenti negli spettri fino a condizioni di attivazione ottimali si raggiungono. Energia di attivazione elevata può indurre la dissociazione di una o più subunità dal complesso intatto, e chiarire le affinità interazione di diverse subunità. Usiamo tipicamente Argon come gas di collisione nella trappola / trasferimento cellule, anche se i benefici di utilizzare un gas più pesante (ad esempio, Xe o SF 6) sono stati segnalati, tuttavia, questi gas sono sostanzialmente più costose 11 (Fig. 3). </li><li> Si raccomanda che più di uno stato di carica essere selezionato per MS / MS. Nel caso di componenti sovrapposte, acquisendo una serie di tandem MS spettri aiuterà a risolvere la serie di carica delle diverse popolazioni. Inoltre, stati di carica più alta si dissociano più facilmente, rispetto a stati di carica inferiore 12. </li><li> Oltre alla caratterizzazione del complesso intatto, si suggerisce che i piccoli subcomplessi in soluzione verrà generato, in condizioni di lieve denaturazione. Le analisi MS e MS / MS di subcomplessi costituiscono la base per definire l&#39;architettura subunità del complesso 13. Per l&#39;interruzione parziale della subunità-subunità interazioni, aggiungere gradualmente solventi organici (ad esempio metanolo, isopropanolo o acetonitrile) fino ad una concentrazione del 50%, o modificare il pH della soluzione con l&#39;aggiunta di ammoniaca o acido formico (fino ad una concentrazione di 4 %). </li><li> Per determinare le masse delle singole unità che compongono il complesso, è importante acquisire uno spettro in condizioni di denaturazione. Questo può essere effettuata con Zip-Tip C 4 (Millipore) con 25:75 acqua / acetonitrile rapporto, con 1% di acido formico come solvente di eluizione. </li></ol> Parte 6: L&#39;elaborazione dei dati e analisi <ol><li> I dati vengono analizzati in linea, con un programmi di analisi spettrale per MS spettri. Noi di solito utilizzare il programma MassLynx (Waters). </li><li> Per spettri che abbracciano un ampio m / z gamma, si consiglia di diversi regimi di levigatura e centroide parametri da applicare per l&#39;alta e bassa m / z regioni, per riflettere la differenza di risoluzione di punta di queste regioni. </li><li> Per identificare serie di carica e di calcolare gli stati di carica e le masse, il &quot;Manuale di trovare&quot; la funzione di MassLynx può essere applicata. In caso di spettri di massa complessi con componenti sovrapposti, calcolo manuale delle masse può essere più facile. </li><li> Per facilitare questi processi di assegnazione, software aggiuntivo può essere utilizzato, ad esempio: Maxent per deconvoluzione spettri 14, SOMMS per il montaggio e la simulazione di picco 15 e SUMMIT per assegnare la composizione e la stechiometria di subcomplessi proteine ​​e la generazione di reti di interazione proteina 13,16,17 . </li></ol> Parte 7: Risultati Rappresentante <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Preparazione di oro rivestite nano-elettrospray capillari. A. Fissare due su due lati strisce adesive di una capsula di Petri, 2 cm di distanza. Per supportare la preparazione capillari, posto una bacchetta di vetro (8 cm x 5 mm) al centro di una delle pastiglie. B. Stick l&#39;estremità piatta del preparato capillari al pad adesivo, e appoggiarsi sulla punta sulla bacchetta di vetro. C. Una volta che la piastra di Petri è riempito con il preparato capillari, cappotto d&#39;oro fino a un sottile strato di oro è depositato in modo uniforme sulla superficie esterna dei capillari. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Calibrazione di massa ad alta utilizzando ioni ioduro di cesio. I cluster di grandi dimensioni e monisotopic di CSI hanno reso il composto di scelta per la calibrazione di spettrometri di massa per l&#39;analisi di massa elevata. La serie di picchi equidistanti si estendono su una vasta gamma, da m / z 393 a ben oltre 10.000. Sono ASSIGned singolarmente a carico cluster sale della composizione generale (CSI) n Cs +. Segnali supplementari tra le cime principali sono causati da specie a doppia e tripla carica della serie, [(CSI) n CS2] 2 + e [(CSI) n Cs3] 3 +, rispettivamente. Aumentando la pressione nella fase di vuoto iniziale è essenziale per rilevare il cluster di massa elevata. L&#39;effetto della pressione sui picchi di massa elevata è dimostrato in pannelli A. e B. con readback pressione di 1,2 e 5,3, rispettivamente. C. Espansione dello spettro di massa mostrato in B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Nanoflussi elettrospray spettri di massa di una lectina pentamerica. A. Spettrometria di massa di una complessa variante lectina (derivato da Lib1-B7 dall&#39;evoluzione diretto 18) dà luogo a distribuzioni stato una carica tra 3.000 e 5.000 m / z, tuttavia, a causa di desolvatazione inadeguata degli ioni, i picchi sono ampie. Confronto di gruppo A. e B. mostrare l&#39;effetto di aumentare la tensione di polarizzazione da 4V (A). A 15 V (B). Sulla larghezza del picco. Questo aumento in condizioni di accelerazione provoca la rimozione dei residui di acqua e componenti di buffer, producendo uno spettro estremamente risolto. La massa misurata (60.240 ± 38 Da) corrisponde ad un complesso pentamerica. C. Il 15 dello stato di carica è stato poi selezionato per il tandem MS (in grigio nel pannello B). D. L&#39;aumento di energia di collisione provoca il rilascio di un monomero altamente carica, centrata a 1.664 m / z, e un complesso spogliato tetramerica, nella gamma di 5.000 - 8.000 m / z. Tutti gli spettri sono stati ottenuti da un campione contenente 20 mM di soluzione in acetato di ammonio 0,5 M.

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M. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates.">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring.">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li><li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per acquisire gli spettri di alta qualità l&#39;attenzione dovrebbe essere data alle fasi di preparazione del campione, tra cui la concentrazione del campione e lo scambio di buffer. Oltre campioni diluiti darà un segnale basso, mentre i campioni ad alta concentrazione può essere piuttosto viscoso, e bloccare l&#39;ago elettrospray. Inoltre, additivi soluzione come sali, glicerina, detergenti, ioni metallici, e agenti riducenti (DTT o β-mercaptoetanolo), tendono ad aderire alla superficie esterna delle proteine, e la causa allargamento dei picchi. Pertanto, al fine di raggiungere picchi ben risolti, questi componenti dovrebbe essere aggiunto al minor concentrazione possibile. Un altro parametro chiave è la posizione del nanoflussi capillare, rispetto al foro spettrometro di massa. Trovare il &quot;sweet spot&quot; potrebbe essere difficile per gli utenti meno esperti, tuttavia, influenza in modo significativo la qualità degli spettri. E &#39;anche importante esaminare la nanoflussi capillare prima di iniziare a spruzzo. La dimensione delle gocce è una funzione del diametro della punta, che dovrebbe essere ~ 1μm. Piccole gocce portare a ionizzazione più efficiente, e sarebbe quindi vantaggioso. E &#39;anche importante per verificare che non vi siano bolle d&#39;aria all&#39;interno del capillare che potrebbero bloccare il flusso, e che il rivestimento d&#39;oro non è spogliato dal capillare durante l&#39;acquisizione, in caso affermativo, ulteriormente tagliare la punta. Tenete presente che una eccessiva quantità di campione aumenta la possibilità di ottimizzare le condizioni di SM come la tensione capillare, tensioni di accelerazione, pressione, e l&#39;energia di collisione. Nel complesso, le procedure spiegate nel protocollo sono stati utilizzati per determinare la composizione, stechiometria e l&#39;architettura di complessi proteici diversi (vedi recensioni 2,3,4). Analisi dei grandi complessi MDA come il ribosoma 19 e capsidi virus altamente ordinato 20-22, nella definizione del substrato legame con macchine molecolari 23-25, o la caratterizzazione delle reti di interazione subunità 26,17,16,17,27,28 servire come solo alcuni esempi del valore di questo approccio.

Esempio di requisiti: <table border="1"><tr><td> Campione </td><td> Requisito </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 1-2 microlitri </td><td> Per capillare </td></tr><tr><td> Concentrazione </td><td> 1-20μM </td><td> Per complessi </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> Tampone Aquanos volatili come ammonio acetato a pH = 6-8 </td><td> Tipicamente 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Detergente </td><td> Minimo </td><td> Gruppi di molecole detergenti produrre picchi ampio e irrisolto </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Minima (massimo 5%) </td><td> Aderisce non specifico alle proteine ​​e, di conseguenza, vette largo vengono osservati </td></tr><tr><td> Solventi organici </td><td> Fino al 50% </td><td> Potrebbe denaturare le proteine ​​complessi </td></tr><tr><td> Acidi </td><td> Fino al 4% </td><td> Denaturare complessi proteici </td></tr><tr><td> Sali </td><td> Minimo </td><td> Addotti sale portare a picchi di ampio e irrisolto </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Minimo </td><td> MM 1-2 possono essere presenti </td></tr><tr><td> Agenti chelanti </td><td> Minimo </td><td> Superiori a 250 mM portare alla formazione di addotti ampia </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Cellule viventi controllare e regolare i loro processi biologici attraverso l&#39;azione coordinata di un gran numero di proteine ​​che si assemblano in un array di dinamica e multi-proteina complessi 1. Per ottenere una comprensione meccanicistica dei vari processi cellulari, è fondamentale per determinare la struttura di tali complessi proteici, e rivelano come la loro organizzazione strutturale impone la loro funzione. Molti aspetti della multi-proteina complessi, tuttavia, sono difficili da caratterizzare, a causa della loro natura eterogenea, la struttura asimmetrica e dinamica. Pertanto, sono necessari nuovi approcci per lo studio dei livelli di organizzazione terziaria delle proteine. Uno degli strumenti emergenti biologia strutturale per l&#39;analisi di complessi macromolecolari è la spettrometria di massa (MS) 2-5. Questo metodo fornisce informazioni sulla composizione proteica complessa, stechiometria subunità, e la topologia strutturale. Il potere del MS deriva dalla sua elevata sensibilità e, come, requisito campione conseguenza bassa, che consente l&#39;esame di complessi proteici espressi a livelli endogeni. Un altro vantaggio è la velocità di analisi, che permette il monitoraggio delle reazioni in tempo reale. Inoltre, la tecnica può misurare contemporaneamente le caratteristiche di popolazioni separate che coesistono in una miscela. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l&#39;applicazione della strutturali MS per l&#39;analisi di assiemi di grandi dimensioni delle proteine. La procedura inizia con la preparazione di oro rivestite capillari per la ionizzazione elettrospray nanoflussi (NESI). Si prosegue poi con la preparazione del campione, sottolineando le condizioni di buffer che dovrebbe essere compatibile con NESI da un lato, e permettono di mantenere intatta complessi dall&#39;altro. Abbiamo poi spiegare, passo per passo, come ottimizzare le condizioni sperimentali per misure di massa elevata e acquisire MS e MS tandem spettri. Infine, la tabella di elaborazione dati e le analisi che seguono. Piuttosto che tentare di caratterizzare ogni aspetto delle assemblee proteine, questo protocollo introduce le procedure di base di MS, che consente l&#39;esecuzione di esperimenti MS e MS / MS di non covalenti complessi. Nel complesso, il nostro obiettivo è quello di fornire ai ricercatori che non conosce con il campo di MS strutturale, con conoscenza dei principali strumenti sperimentali.

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Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Spettrometria di massa ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per l&#39;analisi dei complessi proteici di grandi dimensioni. Questo metodo consente intuizioni l&#39;architettura composizione, stechiometria e in generale di multi-subunità assemblee. Qui, descriviamo, passo per passo, come effettuare una analisi strutturale spettrometria di massa, e caratterizzare le strutture macromolecolari.

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

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24.0K Views.  Weizmann Institute of Science. Spettrometria di massa ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per l'analisi dei complessi proteici di grandi dimensioni. Questo metodo consente intuizioni l'architettura composizione, stechiometria e in generale di multi-subunità assemblee. Qui, descriviamo, passo per passo, come effettuare una analisi strutturale spettrometria di massa, e caratterizzare le strutture macromolecolari.

Video: Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

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T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-wave mobilità ionica-spettrometria di massa: Basic procedure sperimentali per l&#39;analisi delle proteine ​​complesse

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa