L'obiettivo centrale per lo sviluppo della tecnica csBN-MS era ottenere un accesso completo all'organizzazione e all'assemblaggio di complessi proteici che sono alla base della trasduzione del segnale su e attraverso la membrana plasmatica di vari tipi di tessuti e organi. csBN-MS offre attualmente la massima versatilità di risoluzione per l'analisi del complesso proteico nativo e della loro composizione di subunità, in particolare per quanto riguarda le proteine di membrana. Sebbene la tecnica csBN-MS sia stata sviluppata per analizzare miscele complesse di gruppi proteici di membrana nel cervello dei roditori, può essere facilmente adattata all'analisi di qualsiasi tipo di campione biologico.
Uno dei passaggi chiave del nostro metodo è l'incorporamento del pezzo di gel e il suo corretto allineamento al piano di taglio prima dell'affettamento. Fare attenzione a non strappare o comprimere il gel e assicurarsi che non sia inclinato sul piano di taglio poiché ciò ridurrebbe la risoluzione dell'analisi. La nostra tecnica csBN-MS ha diversi passaggi pratici che sono cruciali per buoni risultati.
È più facile mostrare come eseguire questi passaggi in dettaglio piuttosto che semplicemente descriverli. Per iniziare questa procedura utilizzare un miscelatore di gradiente a due camere agitato guidato da una pompa per lanciare un gel gradiente lineare o iperbolico dei pori. Preparare soluzioni per la camera di miscelazione anteriore e la camera del serbatoio come delineato nel protocollo di testo.
Avviare l'agitatore e aggiungere 30 microlitri di APS e 2,5 microlitri di TEMED alla soluzione nella camera frontale. Quindi, avviare la pompa e aprire la valvola anteriore. Dopo circa un minuto, aggiungere 90 microlitri di APS e cinque microlitri di TEMED alla camera del serbatoio e aprire la connessione della camera.
Lasciare che il gel polimerizzi lentamente e accuratamente per almeno 24 ore a temperatura ambiente per generare un gradiente omogeneo delle dimensioni dei pori. Se mantenuto umido, il gel polimerizzato può essere conservato in posizione verticale a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Successivamente, preparare le fessure di carico inserendo gli spazi appropriati tra le piastre di vetro per separare tra 0,5 e 2,0 milligrammi di proteine.
Le fessure dovrebbero essere larghe almeno tre centimetri. Per l'esecuzione di tamponi, preparare un tampone catodo permanente composto da 50 millimolare tricina, 50 millimolare Bis-Tris e 0,01%Coomassie G-250. Preparare un tampone anodo standard composto da Bis-Tris da 50 millimolare.
Solubilizzare circa 2,5 milligrammi di membrana e due millilitri di tampone di solubilizzazione contenenti 1% di detersivo non denaturante sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi ultracentrifugo a 130.000 volte G per 11 minuti. Concentrare il solubilisato su un breve gradiente di gradino di saccarosio del 50%20% mediante ultracentrifugazione a 400.000 volte G per un'ora.
Successivamente, raccogliere il gradiente di saccarosio dal fondo del tubo, aggiungere lo 0,05%Coomassie G-250 al solubilisato e caricare il campione sul gel. Eseguire un BN-PAGE preparatore a 10 gradi Celsius durante la notte utilizzando un protocollo di tensione in tre step, come delineato nel protocollo di testo. Dopo che il gel è stato eseguito, scansionare i gel a scopo di documentazione mantenendoli tra le lastre di vetro.
Ispezionare la qualità della separazione del gel. Quindi, disperi le targhe e accisa i tratti di corsia di interesse. Fissare le corsie due volte con il 30% di etanolo e il 15% di acido acetico per almeno 30 minuti.
Trasferire il campione di mezzo di incorporamento e permettergli di immergersi ed equilibrare per almeno due ore mantenendo la lastra di gel al rallentatore su uno shaker orbitale. Quindi, tagliare le corsie di gel fisse in sezioni esattamente parallele al fronte di migrazione proteica o al modello di banda. Posizionare ogni sezione su un supporto per pellicole di plastica con dimensioni uguali per una manipolazione più semplice.
Trasferire le corsie in un tubo aperto con tappi chiusi sul fondo e perforati centralmente sulla parte superiore, entrambi allineati con precisione con le estremità superiore e inferiore della sezione gel. Immergere brevemente il cilindro nell'azoto liquido per avviare rapidamente la solidificazione. Il supporto di incorporamento trasparente si solidifica in pochi secondi e diventa di colore bianco.
Riempire la cavità con il mezzo di incorporamento, immergere brevemente il cilindro in azoto liquido e quindi lasciarlo congelare accuratamente a meno 20 gradi Celsius per diverse ore. Dopo lo smontaggio, rimuovere la pellicola di plastica e trasferire il blocco con la sezione di gel incorporata in un cilindro metallico raffreddato. Il cilindro ha un diametro maggiore e sigillato all'esterno con mezzo di incorporamento.
È posto su un supporto piatto. Riempire il cilindro con un supporto di incorporamento e congelare accuratamente come accennato in precedenza. Ripetete questa procedura con l'altro lato del cilindro per ottenere un blocco solido con una superficie inferiore complanare.
Quindi, rimuovere il blocco dal cilindro e utilizzare il mezzo di incorporamento per incollarlo a un supporto metallico pre-raffreddato. Inserire il supporto metallico nella criosciettatrice. Il supporto deve essere accuratamente allineato rispetto al piano di affezione.
Lasciare che il blocco equilibra alla temperatura ottimale per il processo di affezione. Dopo questo raccolto il gel taglia uno dopo l'altro con uno spessore finale desiderato di 0,25 millimetri e li trasferisce singolarmente in tubi di reazione con basse proprietà di legame proteico. Quindi, le fette vengono sottoposte a digestione triptica e analisi spettrometrica di massa.
Questo protocollo estende l'applicazione della profilazione del complexoma ad alta risoluzione alle membrane non mitocondriali che esprimono proteine a bassa abbondanza. La separazione complessa mostra bande proteiche fortemente macchiate con pochissimi artefatti di migrazione. Le deviazioni dei segnali peptidici in massa e nel tempo di ritenzione indicano un tasso molto basso per l'assegnazione del volume di picco falso positivo.
Le varianti run-to-run vengono facilmente eliminate ridimensionando i set di dati del volume di picco. Le informazioni sull'intensità peptidica risultanti vengono quindi utilizzate per ricostruire 2545 profili proteici di abbondanza relativa. La pertinenza della dimensione del passo di campionamento del gel per la risoluzione dei complessi proteici è stata valutata unendo set di dati di fette adiacenti.
A 0,25 millimetri, la separazione delle dimensioni delle popolazioni complesse associate al TPC1 è ben in accordo con i risultati dell'analisi western blot. L'adesione di più di due fette abolisce la discriminazione delle sottopopolazioni complesse di TPC1. Infine, l'analisi fornisce informazioni su complessi ben caratterizzati e dimostra l'esistenza di nuove subunità e assiemi complessi.
Per la ferritina, i profili delle subunità regolati per la loro abbondanza relativa suggeriscono l'esistenza di almeno tre isoforme complesse con distinte stechiometrie a catena pesante/leggera. Al contrario, i complessi nicalin-nomo1, il complesso del nucleo gamma-secretasi e i macchinari GPI-transamidasi mostrano rapporti di abbondanza fissi delle loro subunità principali nell'intera gamma di dimensioni e indipendenti dall'associazione con proteine aggiuntive. Il parametro chiave dell'analisi csBN-MS è la risoluzione efficace dei complessi, che è determinata dalla biochimica del campione, dalla qualità del gel BN, dal corretto allineamento durante l'incorporamento e l'affettamento e dalla qualità dei dati MS acquisiti.
La pettinatura del csBN-MS con l'etichettatura isotopica di proteine e campioni consentirà il confronto diretto di complessi in diversi stati fisiopatologici, biologici o dello sviluppo. csBN-MS eseguito su membrane dal cervello dei roditori ha rivelato l'enorme diversità di recettori, canali ionici e trasportatori rispetto alla loro composizione di subunità e alla loro funzione, e sarà strumentale per analizzare la struttura 3D nei preparati nativi.
