Questo lavoro è stato supportato dal New Innovator Award DP2OD006466 (a K.C.H.). Gli autori ringraziano Russell Monds per una dimostrazione pratica del metodo e per le discussioni scientifiche.

1. Coltivare colture batteriche in 2,5 ml di media durante la notte
Diluire le colture 1:100 in 250 ml di mezzi freschi e crescere fino a600 OD di 0,7-0,8. Preparare una soluzione di dodecil solfato di sodio al 6% (SDS) in acqua.
ATTENZIONE: la polvere SDS è pericolosa - evitare di inalare polvere di SDS; indossare una maschera sul naso e sulla bocca.
2. Giorno 1 - Le colture batteriche di lysing vengono eseguite nel corso di un giorno e durante la notte
<ol><li>Mentre le colture diluite crescono, impostare un bagno d'acqua bollente su una piastra calda in un becher da 1 L. Una volta che l'acqua è bollente, aliquota 6 ml di SDS 6% in tubi in polipropilene da 50 ml, aggiungere una piccola barra di agitazione a ciascun tubo, fissare i coperchi del tubo a tenuta di dita, posizionare i tubi nel bagnomaria e accendere mescolando a 500 giri/min sulla piastra calda.</li>
	<li>Raccogliere le colture da 250 ml a 5.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente e rimossare pellet in 3 ml di mezzi o 1 soluzione salina tamponata con fosfato. Le sospensioni a celle a pipetta lenta si trasformano in tubi da 50 ml con SDS bollente al 6% per liscire le cellule (concentrazione finale 4% SDS) mentre i tubi sono immersi nel bagno d'acqua bollente e richiudere i coperchi a tenuta di dita. Le sospensioni cellulari devono essere trasferite rapidamente in SDS bollente una volta rimontesi. Dovrebbero essere evitati bruschi cambiamenti ambientali, in quanto ciò potrebbe causare un'alterazione errata della struttura della parete cellulare.
</li>
	<li>Coprire il bagno d'acqua bollente e lasciare bollire le cellule per 3 ore, controllando periodicamente il livello dell'acqua e riempiendo il bagnomaria quando necessario. Dopo 3 ore, spegnere l'elemento riscaldante della piastra calda e continuare a mescolare durante la notte a 500 giri/min.</li>
</ol>3. Giorno 2 - Le digestione enzimatica vengono eseguite nel corso di un giorno
<ol><li>Se sds è precipitato nei tubi da 50 ml durante la notte, impostare il bagnomaria a bollire per ulteriori 1-2 ore. Accendere un blocco termico a 60 °C. Preparare uno stock di 1 mg/ml di Pronasi E in Tris-HCl da 10 mM (pH 7,2) + 0,06% con NaCl e attivare la Pronasi E a 60 °C per almeno 30 min.</li>
	<li>Utilizzare un set di ultracentrifugo a 400.000 × g per far girare campioni per 20 minuti a temperatura ambiente al fine di pellettizzare i grandi polimeri PG e quindi purificarli da altri componenti cellulari. Rimuovere con cura il supernatante, quindi rimescolare ogni pellet in acqua ultrapura a temperatura ambiente. NOTA: Il volume di resuspensione dipende dal volume dei tubi ultracentrifugo utilizzati; utilizzare un volume che riempia i tubi almeno a metà strada ma non superi il volume massimo dei tubi. Ripetere la centrifugazione/lavaggio fino a quando l'acqua non forma bolle durante la resuspensione, indicando che l'SDS è stato completamente rimosso (in genere tre lavaggi). Interrompere il lavaggio del pellet se si forma un precipitato bianco, in quanto ciò indica che i sacculi si stanno raggruppando insieme. Il raggruppamento non è catastrofico, ma i grumi si legano molto fortemente alla plastica e alla vetreria causando una grande perdita di campioni. In questo caso, procedere con il protocollo utilizzando il campione di sacculi raggruppato.</li>
	<li>Nell'ultima fase di centrifugazione/lavaggio, rimescolare i campioni in 900 μl di 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% con NaCl e trasferire a 2 ml tubi precedentemente infilati con fori nelle cime con un piccolo ago. Aggiungere 100 μl di 1 mg/ml di Pronasi E attivata (concentrazione finale di 100 μg/ml) a ciascun campione e incubare a 60 °C per 2 ore. Impostare un blocco di calore diverso su 100 °C.</li>
	<li>Interrompere la digestione della Pronasi E aggiungendo 200 μl di 6% di SDS a ciascun campione e far bollire i campioni nel blocco termico di 100 °C per 30 minuti. Impostare un blocco termico diverso a 37 °C e fare uno stock di muramidasi (mutanolisina) da 1 mg/ml in tampone fosfato da 50 mM (pH 4.9).</li>
	<li>Come nel passaggio 3.2, utilizzare un set di ultracentrifugo a 400.000 × g per far girare campioni per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare con acqua ultrapura a temperatura ambiente fino a quando L'SDS non viene completamente rimosso (in genere tre lavaggi). Il volume di resuspensione dipende dal volume dei tubi ultracentrifugo utilizzati; utilizzare un volume che riempia i tubi almeno a metà strada ma non superi il volume massimo dei tubi.</li>
	<li>Nell'ultima fase di centrifugazione/lavaggio, resuspend campioni in 200 μl di tampone di fosfato di sodio da 50 mM (pH 4.9). Questo volume può essere regolato in base alla quantità di peptidoglycan nel campione e può essere dipendente dalle specie. Se in precedenza sono pubblicati rapporti di analisi HPLC per le specie di interesse, questo volume può essere stimato sulla base di queste quantificazioni (una compilazione di studi HPLC PG può essere trovata nelle informazioni supplementari di riferimento7). Per altre specie, la preparazione sacculus può essere eseguita fino a questo passaggio e quindi è possibile aggiungere diverse quantità di volumi di resuspensione per replicare i campioni al fine di determinare il volume minimo che consente al PG di rimanere in soluzione (vedi Discussione per ulteriori stime). Se il campione contiene più peptidoglycan, aumentare il volume di resuspensione; se il campione ha poco peptidoglycan, ridurre il volume di resuspensione ad un minimo di 50 μl.</li>
	<li>Trasferire campioni in tubi da 1,5 ml e aggiungere 1 mg/ml di muramidasi per ottenere una concentrazione finale di 40 μg/ml. Incubare 6-8 ore o durante la notte a 37 °C.</li>
</ol>4. Giorno 3 - La preparazione dei campioni per UPLC viene eseguita l'ultimo giorno
<ol><li>Accendere un blocco termico a 100 °C. Far bollire i campioni senza SDS per 5 minuti per fermare la digestione della muramisasi. Centrifugare i campioni per 10 min a 16.000 × g a temperatura ambiente, quindi trasferire il supernatante (i muropeptidi sono ora solubili) a tubi di vetro da 13 mm x 100 mm. Cerca di recuperare il più supernatante possibile, avvicinandoti molto al pellet senza disturbarlo.</li>
	<li>Regolare il pH aggiungendo 500 mM di tampone di borato (pH 9) al campione per una concentrazione finale di tampone di borato da 100 mM. Il tampone di borato è compatibile con l'agente riducente boroidro di sodio. Aggiungere 1-2 granelli di boroidro di sodio per ridurre ogni campione e lasciare che la reazione proceda per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Il boroidro di sodio è altamente reattivo e pericoloso da maneggiare - evitare il contatto con la pelle (indossare guanti) ed evitare il contatto con gli occhi (indossare occhiali di sicurezza).</li>
	<li>Regolare i campioni in pH 3-4 (il punto isoelettrico muropeptide è ~3,5) con acido ortofosforico 50% v/v utilizzando incrementi di 20 μl fino a pH 6, come misurato con carta indicatore di pH, quindi utilizzando incrementi di 2 μl. ATTENZIONE: L'acido ortofosforico è corrosivo e pericoloso da maneggiare - evitare il contatto con la pelle (indossare guanti) ed evitare il contatto con gli occhi (indossare occhiali di sicurezza). Il campione deve bollicine in risposta all'aggiunta di acido ortofosforico; quando il campione smette di gorgogliare, questo indica in genere che è stato raggiunto un pH di 6. Se nel campione non si verifica alcun gorgogliamento, ciò può indicare che la quantità di boroidro di sodio aggiunta era troppo piccola. In questo caso, interrompere l'abbassamento del pH, aggiungere con cura uno o due granelli di boroidro di sodio, lasciare reagire per 5-10 minuti, quindi riprendere la regolazione del pH.</li>
	<li>Filtrare il campione attraverso un filtro siringa da 0,22 μm direttamente in un flaconcino UPLC. Se si è formato un precipitato, riscaldare il tubo con più passaggi attraverso una fiamma prima di filtrare. Se il campione non verrà iniettato nello strumento UPLC entro il giorno, congelare a -20 °C durante la notte. I campioni possono essere conservati fino a un anno a -80 °C. Il campione può essere scongelato passando attraverso una fiamma più volte.</li>
	<li>Iniettare 10 μl di ogni campione su uno strumento UPLC dotato di una colonna in fase invertita C18 da 1,7 μm e di un rilevatore di assorbanza impostato per monitorare 202-208 nm. Gli esempi vengono inseriti in sequenza, ma le funzionalità di campionamento automatico consentono di elaborare fino a 96 campioni in batch. Utilizzare 50 mM di fosfato di sodio (pH 4,35) + 0,4% v/v azide di sodio per il solvente A e 75 mM fosfato di sodio (pH 4,95) + 15% v/v metanolo per solvente B. NOTA: L'azide di sodio viene aggiunto per compensare l'assorbimento di metanolo di 205 nm per evitare la deriva di base. Impostare il flusso su 0,25 ml/min e utilizzare un gradiente lineare superiore a 25 min per ottenere il 100% di solvente B e l'eluizione sequenziale dei muropeptidi entro 30 min. Se la spettrometria di massa verrà utilizzata per caratterizzare i muropeptidi dopo UPLC, raccogliere frazioni del picco di interesse in un raccoglitore di frazioni e asciugare le frazioni utilizzando un evaporatore centrifugo.</li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+composition+of+the+cell+walls+of+Bacillus+stearothermophilus.">Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus.</a> J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).</li><li>Wang, W. S., Lundgren, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+of+a+chemolithotrophic+bacterium,+Ferrobacillus+ferrooxidans.">Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans.</a> J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).</li><li>de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penicillin+binding+proteins:+role+in+initiation+of+murein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).</li><li>Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Streptococcus+faecalis+Andrewes+and+Horder+and+Streptococcus+faecium+Orla-Jensen+based+on+the+amino+acid+composition+of+their+murein.">Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein.</a> J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).</li><li>Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+a+preeminent+technique+in+pharmaceutical+analysis.">UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis.</a> Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).</li><li>Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+&amp;#34;ultra+performance&amp;#34;+liquid+chromatography+coupled+to+oa-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies.">High resolution &amp;#34;ultra performance&amp;#34; liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).</li><li>Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+in+microbiological+diagnostics-identification+of+microorganisms+and+beyond+(mini+review).">MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review).</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).</li></ol>

I costi di produzione per questo articolo sono stati sponsorizzati da Waters Corporation.

Un passaggio critico di questa procedura è il passaggio 3.1 del secondo giorno di preparazione del campione. Se l'SDS è precipitato durante la notte o se i campioni sono stati conservati in SDS al 4% per diverse settimane a temperatura ambiente, i campioni devono essere riboiled per almeno 1 ora per riassolvere l'SDS. Una causa comune per la precipitazione dell'SDS è l'uso di mezzi con sali di potassio, quindi il potassio dovrebbe essere evitato nei mezzi se possibile. Come accennato nella sezione Risultati rappresent...

L'obiettivo del metodo descritto nel presente documento è quello di isolare le pareti cellulari batteriche intatte (sacculi) e di digerire il peptidoglycan (PG) in modo tale che la cromatografia liquida ultra-performance (UPLC) possa essere utilizzata per fornire informazioni come l'identità dei componenti muropeptidi e le loro concentrazioni, la lunghezza media dei filamenti di glicano e la frazione di materiale coinvolto nei collegamenti incrociati tra i trefoli. Per una discussione dettagliata della biochimica PG e delle specie di muropeptidi, ci sono diverse eccellenti recensioni che descrivono la struttura PG e il suo ruolo in infezione, resistenza, morfogenesi e crescita1-6. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per l'analisi PG è stata inizialmente sviluppata da Glauner e Schwarz negli anni '80, e più recentemente è stata migliorata e applicata ampiamente nei laboratori di Miguel de Pedro e Waldemar Vollmer. I metodi precedenti utilizzavano l'analisi degli amminoacidi o la cromatografia su carta, tecniche dispendiose in termini di tempo e noiose che non producono valutazioni accurate o complete dei componenti della parete cellulare.
L'analisi UPLC può essere facilmente implementata in qualsiasi laboratorio di ricerca di base che abbia accesso a un ultracentrifugo e UPLC. Il metodo UPLC che presentiamo di seguito isola i sacculi completi, fornendo così informazioni complete e quantitative su tutte le specie chimiche in esso contenute. Questo metodo produce una quantificazione precisa di tutti i muropeptidi in una popolazione di batteri, il tutto entro una corsa UPLC di 20 minuti. L'implementazione di questo metodo comporta solo competenze di laboratorio di base, senza significativi investimenti finanziari nei materiali. Per eseguire i passaggi di questo metodo, i ricercatori devono solo essere esperti nella pipettazione, nella preparazione di tamponi ed enzimi e nella regolazione del pH, rendendolo accessibile a una vasta gamma di discipline scientifiche. La scelta degli enzimi utilizzati in questo protocollo dipende dalle specie di batterio analizzate; il protocollo qui descritto è utile per Escherichia coli, ed è stato generalmente trovato adeguato per isolare i sacculi da altri organismi Gram-negativi. La consultazione con la letteratura è raccomandata quando si applica questo metodo ai batteri Gram-positivi; in queste specie, la purificazione del sacculo è stata tradizionalmente più difficile. In particolare, questo metodo potrebbe essere necessario alterare in termini di scelta enzimatica e lunghezza dei tempi di digestione per adattarsi alle pareti più spesse e ai polimeri accessori come gli acidi teichoici dei batteri Gram-positivi. Il primo enzima in questo protocollo scide la lipoproteina della membrana esterna (come la lipoproteina di Braun, o Lpp) attacca al peptidogicano, rilasciando così tutto tranne il peptide C-terminale di- (o tri-) del Lpp dalla parete cellulare. Questo passaggio è necessario quando si esaminano enterobatteri, ma molti altri batteri Gram-negativi non hanno equivalenti Lpp, e quindi questo passaggio può essere saltato. Un secondo enzima si stacca specificamente dopo il componente dell'acido muramico del peptidoglycan, solubilizzando la subunità disaccaride che forma la specie muropeptide. Per fornire una valutazione accurata dell'architettura del PG, è necessario prestare attenzione a digerire i sacculi per evitare la scissione delle passerelle o di qualsiasi altra parte del gambo peptidico.
Sebbene le composizioni chimiche di peptidoglycan di oltre 100 ceppi di ~40 specie batteriche siano state analizzate dall'HPLC, non sono state eseguite analisi con la tecnologia UPLC. Inoltre, il lavoro precedente ha caratterizzato il peptidoglycan solo da una piccola frazione del dominio batterico, in parte limitato dalla produttività dell'HPLC. Pertanto, la diffusione di questo metodo al maggior numero possibile di ricercatori e l'implementazione su piattaforme UPLC saranno fondamentali per guidare studi fisiologici della grande frazione di specie batteriche il cui peptidoglycan deve ancora essere classificato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Pronase E</td>
			<td style="width:115px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">E629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mutanolysin from Streptomyces</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium borohydride (NaBH4)&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">452882</td>
			<td>Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orthophosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">79607</td>
			<td>Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td>Sodium azide is a poison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex 0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH strips (pH range 0-6)</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M95863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene Falcon tubes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13 mm x 100 mm glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:119px;">60CM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial</td>
			<td style="width:115px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000327C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:115px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9820</td>
			<td>SDS powder is hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Instrumentation</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Waters Acquity UPLC H-Class system, including:</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#181;m column</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC PDA Detector</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waters Fraction Collector III</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
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		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler</td>
			<td style="width:119px;"></td>
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isolation and preparation of bacterial cell walls for compositional analysis by ultra performance liquid chromatography

La parete cellulare batterica è fondamentale per la determinazione della forma cellulare durante la crescita e la divisione e mantiene l'integrità meccanica delle cellule di fronte alle pressioni del turgore diverse atmosfere di grandezza. Attraverso le diverse forme e dimensioni del regno batterico, la parete cellulare è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da brevi peptidi. L'importanza centrale del peptidoglicano per la fisiologia batterica è alla base del suo uso come bersaglio antibiotico e ha motivato studi genetici, strutturali e biologici cellulari su come viene assemblato solidamente durante la crescita e la divisione. Tuttavia, sono ancora necessarie indagini approfondite per caratterizzare pienamente le principali attività enzimatiche nella sintesi del peptidoglycan e nella composizione chimica delle pareti cellulari batteriche. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è un potente metodo analitico per quantificare le differenze nella composizione chimica delle pareti dei batteri coltivati in una varietà di condizioni ambientali e genetiche, ma la sua produttività è spesso limitata. Qui, presentiamo una procedura semplice per l'isolamento e la preparazione delle pareti cellulari batteriche per analisi biologiche del peptidoglycan tramite HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), un'estensione di HPLC che utilizza pompe per fornire pressioni ultra-elevate fino a 15.000 psi, rispetto ai 6.000 psi per HPLC. In combinazione con la preparazione delle pareti cellulari batteriche qui presentate, gli iniettori di campioni a basso volume, i rivelatori con alti tassi di campionamento, volumi di campioni più piccoli e tempi di esecuzione più brevi di UPLC consentiranno un'alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan e della biologia delle cellule batteriche fondamentali nella maggior parte dei laboratori biologici con accesso a un ultracentrifugo e UPLC.

Utilizzando la procedura descritta nella figura 1, il campione finale deve essere costituito da almeno 200 μl di soluzione chiara che è stata filtrata direttamente in un flaconcino UPLC (passaggio 4.4). La separazione UPLC dei vari muropeptidi in un campione batterico si basa sulla loro relativa solubilità tra la fase mobile liquida e la fase stazionaria della colonna. Le colonne C18 in fase inversa forniscono una matrice fortemente idrofobica per separare le specie di muropeptidi in base all'idrofobi...

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Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

La parete cellulare batterica è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da peptidi. La cromatografia liquida ad alte prestazioni fornisce alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan. Presentiamo una procedura per l'isolamento delle pareti cellulari (sacculi) e la loro successiva preparazione per l'analisi tramite UPLC.

Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

16.0K Views.  Stanford University. La parete cellulare batterica è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da peptidi. La cromatografia liquida ad alte prestazioni fornisce alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan. Presentiamo una procedura per l'isolamento delle pareti cellulari (sacculi) e la loro successiva preparazione per l'analisi tramite UPLC.

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Ricerca

Chimica

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

L&#39;uso di gas cromatografia per analizzare compositivo Variazioni degli acidi grassi nel fegato di ratto tessuto durante la gravidanza

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

Sintesi e prestazioni catalitica dell&#39;oro intercalata nelle Mura di mesoporosi silice

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

Un metodo semplice per glucosinolati estrazione e l&#39;analisi con alta pressione cromatografia liquida (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully understood. We have traced the trajectories of individual nanoparticles using liquid-cell transmission electron microscopy (TEM) to investigate the mechanism of the assembly process. Herein, we present the protocols used for liquid-cell TEM studies of the self-assembly mechanism. First, we introduce the detailed synthetic protocols used to produce uniformly sized platinum and lead selenide nanoparticles. Next, we present the microfabrication processes used to produce liquid cells with silicon nitride or silicon windows and then describe the loading and imaging procedures of the liquid-cell TEM technique. Several notes are included to provide helpful tips for the entire process, including how to manage the fragile cell windows. The individual motions of nanoparticles tracked by liquid-cell TEM revealed that changes in the solvent boundaries caused by evaporation affected the self-assembly process of nanoparticles. The solvent boundaries drove nanoparticles to primarily form amorphous aggregates, followed by flattening of the aggregates to produce a 2-dimensional (2D) self-assembled structure. These behaviors are also observed for different nanoparticle types and different liquid-cell compositions.

Here we introduce experimental protocols for the real-time observation of a self-assembly process using liquid-cell transmission electron microscopy.

Microscopia elettronica in trasmissione di liquidi-cellula per l'inseguimento auto-assemblaggio delle nanoparticelle

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...