이 작품은 NIH 디렉터의 새로운 혁신상 DP2OD006466(K.C.H.)의 지원을 받았습니다. 저자는 방법의 실질적인 데모와 과학적 토론에 대한 러셀 몬즈 감사.

1. 하룻밤 미디어의 2.5 ml에서 세균 배양을 성장
백 희석 배양 1:100 ~ 250 ml의 신선한 미디어 및 0.7-0.8의 OD600으로 성장합니다. 물에 6 % 나트륨 도데실 황산염 (SDS)의 용액을 준비합니다.
주의: SDS 분말은 위험합니다 - SDS 분말을 흡입하지 마십시오. 코와 입에 마스크를 착용하십시오.
2. 1 일 - 세균 배양은 하루 와 하룻밤 동안 수행됩니다
<ol><li>희석 된 문화가 성장하는 동안, 1 L 비커에 뜨거운 접시에 끓는 물 목욕을 설정합니다. 물이 끓으면 6% SDS6 ml를 50ml 폴리프로필렌 튜브에 넣고, 각 튜브에 작은 교반 바를 추가하고, 튜브 뚜껑을 손가락에 고정하고, 튜브를 수조에 넣고, 뜨거운 접시에 500 rpm으로 저어줍니다.</li>
	<li>실온에서 10분 동안 5,000g의 × 250ml 배양을 수확하고 3ml의 매체 또는 1x 인산완충식식염으로 펠릿을 재보습하십시오. 천천히 파이펫 셀 서스펜션은 6%의 끓는 SDS로 50ml 튜브로 천천히 피펫 을 사용하여 세포를 lyse(최종 농도 4% SDS)하고 튜브는 끓는 물 욕조에 침수되고 뚜껑을 손가락으로 닫습니다. 셀 서스펜션은 다시 중단되면 끓는 SDS로 신속하게 전달되어야 합니다. 이 세포 벽 구조의 잘못된 변경을 일으킬 수 있기 때문에 갑작스런 환경 변화를피해야한다.
</li>
	<li>끓는 수조를 덮고 세포가 3 시간 동안 끓여 서 수위를 주기적으로 확인하고 필요한 경우 수조를 다시 채울 수 있습니다. 3 시간 후, 핫 플레이트의 발열체를 끄고 500 rpm에서 밤새 저어계속합니다.</li>
</ol>3. 2일차 - 효소 소화는 하루 동안 수행됩니다.
<ol><li>SDS가 하룻밤 사이에 50ml 튜브에 침전된 경우 수조를 1-2시간 더 끓이십시오. 60 °C에 열 블록을 켭니다. 10mM Tris-HCl(pH 7.2) + 0.06% w/v NaCl에서 Pronase E의 1 mg/ml 스톡을 준비하고 최소 30분 동안 60°C에서 Pronase E를 활성화시합니다.</li>
	<li>400,00 ×0 g의 초원심분리기를 사용하여 실온에서 20분 동안 샘플을 회전시켜 큰 PG 폴리머를 펠릿하고 다른 세포 성분으로부터 정화합니다. 주체를 조심스럽게 제거한 다음 각 펠릿을 실온 초순수물로 재보펜합니다. 참고: 재서스펜션 볼륨은 사용되는 초원심분리기 튜브의 부피에 따라 달라집니다. 튜브의 최대 부피를 초과하지 는 않지만 튜브를 절반 이상 채우는 부피를 사용합니다. 물이 재서스펜션 중에 거품을 형성하지 않을 때까지 원심분리/세척을 반복하여 SDS가 완전히 제거되었음을 나타냅니다(일반적으로 세 개의 세척). 이는 사쿠리가 함께 뭉쳐 있음을 나타내므로 백색 침전물 형태가 형성되면 펠릿 세척을 중단합니다. 덩어리는 치명적이지는 않지만 덩어리는 플라스틱과 유리 제품에 매우 강하게 결합하여 큰 시료 손실을 초래합니다. 이 경우, 응집된 사쿨리 샘플을 사용하여 프로토콜을 진행한다.</li>
	<li>마지막 원심분리/세척 단계에서는 10mM Tris-HCl(pH 7.2) + 0.06% w/v NaCl의 900 μl에서 샘플을 재연하고 이전에 작은 바늘로 상판에 구멍을 뚫은 2ml 튜브로 옮긴다. 각 샘플에 1 mg/ml 활성 Pronase E(100 μg/ml 최종 농도)의 100 μl을 넣고 2시간 동안 60°C에서 배양합니다. 다른 열 블록을 100°C로 설정합니다.</li>
	<li>각 샘플에 6% SDS의 200 μl을 추가하여 Pronase E 소화를 중지하고 30 분 동안 100 °C 열 블록에서 샘플을 끓입니다. 다른 열 블록을 37°C로 설정하고 50mM 인산염 버퍼(pH 4.9)에서 무라아마다아제(mutanolysin)의 1 mg/ml 스톡을 만듭니다.</li>
	<li>3.2 단계에서와 마찬가지로, 400,00 ×0 g에서 설정된 초원심분리기를 사용하여 실온에서 20분 동안 시료를 회전시키고 SDS가 완전히 제거될 때까지 실온 초순수수로 세척합니다(일반적으로 3개의 세척). 재서스펜션 부피는 사용되는 초원심분리기 튜브의 부피에 따라 달라집니다. 튜브의 최대 부피를 초과하지 는 않지만 튜브를 절반 이상 채우는 부피를 사용합니다.</li>
	<li>마지막 원심분리/세척 단계에서는 50mM 나트륨 인산염 버퍼(pH 4.9)의 200μl에서 시료를 재중단합니다. 이 부피는 시료에서 펩티도글리칸의 양에 따라 조절될 수 있으며 종 의존적일 수 있다. 관심있는 종에 대한 HPLC 분석의 이전에 발표 된 보고서가있는 경우,이 볼륨은 이러한 수량에 따라 추정 될 수있다 (HPLC PG 연구의 편집은 참조의 보충 정보에서 찾을 수 있습니다7). 다른 종의 경우, 타큘러스 준비는 이 단계까지 실행될 수 있고, PG가 용액에 남아 있을 수 있는 최소 볼륨을 결정하기 위해 샘플을 복제하기 위해 다양한 양의 재서스펜션 볼륨을 추가할 수 있습니다(추가 추정을 위한 토론 참조). 시료에 펩티도글리칸이 더 많이 함유되어 있는 경우, 리서스펜션 부피를 증가시키는 행위; 시료에 펩티도글리칸이 거의 없는 경우, 재서스펜션 부피를 최소 50μl로 줄입니다.</li>
	<li>샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 무라아마다아제 1mg/ml를 추가하여 최종 농도를 40 μg/ml로 제공합니다. 37 °C에서 6-8 시간 또는 하룻밤을 배양하십시오.</li>
</ol>4. 3 일 - UPLC 샘플 준비는 마지막 날에 수행됩니다.
<ol><li>열 블록을 100°C로 켭니다. 무라메다아제 소화를 막기 위해 SDS없이 샘플을 5 분 동안 끓입니다. 원심분리기 샘플은 실온에서 16,000 g에서 10분 동안 ×, 수퍼나티(muropeptides는 이제 용해성)에서 13mm x 100mm 유리 튜브로 이송합니다. 가능한 한 많은 상체를 복구하려고, 그것을 방해하지 않고 펠릿에 매우 가까이 점점.</li>
	<li>100mM 붕산염 버퍼의 최종 농도를 위해 500m borate 버퍼(pH 9)를 샘플에 추가하여 pH를 조정한다. 붕산 완충제는 감소제 인 보하이드라이드 나트륨과 호환됩니다. 각 샘플을 줄이고 실온에서 적어도 30 분 동안 반응을 진행할 수 있도록 1-2 알갱이를 보로 하이드라이드 나트륨을 추가하십시오. 주의: 보하이드라이드 나트륨은 반응성이 매우 높고 취급하기에 위험합니다 - 피부와의 접촉을 피하고 (장갑을 착용)하고 눈과의 접촉을 피하십시오 (안전 안경 착용).</li>
	<li>pH 표시기 종이로 측정된 바와 같이 pH 6까지 20 μl 증분을 사용하여 pH 3-4(무로프타이드 등산지점은 ~3.5)로 샘플을 조정한 다음 2μl 증분을 사용합니다. 주의: 정형외과는 부식성이며 취급이 위험합니다 - 피부와의 접촉을 피하고 (장갑을 착용)하고 눈과의 접촉을 피하십시오 (안전 안경 착용). 시료는 정형 외과 산의 첨가에 대한 응답으로 거품이 있어야합니다; 샘플이 버블링을 중지하면 일반적으로 6의 pH에 도달했음을 나타냅니다. 시료에서 버블링이 발생하지 않으면, 이것은 추가된 borohydride 나트륨의 양이 너무 작다는 것을 나타낼 수 있습니다. 이 경우 pH 를 낮추는 것을 멈추고, 조심스럽게 1~2개의 알갱이를 추가하여 5-10분 동안 반응한 다음 pH 조정을 재개합니다.</li>
	<li>0.22 μm 주사기 필터를 통해 샘플을 UPLC 바이알로 직접 필터링합니다. 침전소가 형성된 경우 튜브를 여러 번 가열하여 필터를 통과합니다. 샘플이 하루 내에 UPLC 기기에 주입되지 않으면 하룻밤 사이에 -20 °C에서 동결하십시오. 샘플은 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 샘플을 여러 번 화염을 통과하여 해동 할 수 있습니다.</li>
	<li>C18 1.7 μm 반전 상 열과 202-208 nm를 모니터링하도록 설정된 흡광도 검출기가 장착된 UPLC 기기에 각 샘플의 10 μl을 주입합니다. 샘플은 순차적으로 주입되지만 자동 샘플러 기능을 통해 최대 96개의 샘플을 일괄 처리할 수 있습니다. 50mM 나트륨 인산염(pH 4.35) + 0.4% v/v 나트륨 아지드용매A용, 75mM 나트륨 인산염(pH 4.95) + 15% v/v 메탄올용 용매 B. 참고: 아지드 나트륨을 사용하여 205nm의 나단흡수를 방지한다. 흐름을 0.25 ml/min으로 설정하고 25분 이상 선형 그라데이션을 사용하여 100% 용매 B및 30분 이내에 무로프타이드의 순차적 용출을 달성합니다. 질량 분광법이 UPLC 후 무로프프티드를 특성화하는 데 사용되는 경우, 분수 수집기에 대한 관심피크의 일부를 수집하고 원심 증발기를 사용하여 분수를 건조시.</li>
</ol>

<ol>
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Proteome Res. 4, 591-598 (2005).</li><li>Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+in+microbiological+diagnostics-identification+of+microorganisms+and+beyond+(mini+review).">MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review).</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).</li></ol>

이 기사의 생산 비용은 워터스 코퍼레이션이 후원했습니다.

이 절차의 중요한 단계는 샘플 준비 둘째 날의 3.1 단계입니다. SDS가 하룻밤 사이에 침전되었거나 실온에서 몇 주 동안 4% SDS에 샘플을 저장한 경우 샘플을 SDS를 재해석하려면 최소 1시간 동안 다시 끓여야 합니다. SDS 강수량의 일반적인 원인은 칼륨 염을 가진 매체의 사용입니다, 그래서 칼륨은 가능하면 매체에서 피해야한다. 대표 결과 섹션에서 언급했듯이, 또한 pH를 점동점(~3.5)의 등전점 내에서...

본 명세서에 기재된 방법의 목적은 그대로 세균세포벽(sacculi)을 분리하고, 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피(UPLC)가 점혈구 성분의 정체성과 농도, 글리칸 가닥의 평균 길이 및 가닥 사이의 교차링크와 관련된 물질의 분획과 같은 정보를 제공하는 데 사용될 수 있도록 펩티도글리칸(PG)을 소화하는 것이다. PG 생화학 및 무로프타이드 종에 대한 상세한 논의를 위해, PG 구조와 감염, 저항, 형태 발생 및 성장1-6의역할을 설명하는 몇 가지 우수한 리뷰가 있습니다. PG 분석을 위한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 1980년대에 글라우너와 슈바르츠에 의해 처음 개발되었으며, 최근에는 미겔 드 페드로와 발데마르 볼머의 실험실에서 광범위하게 강화되고 적용되었습니다. 이전 방법은 아미노산 분석 또는 종이 크로마토그래피, 세포벽 성분의 정확하거나 완전한 평가를 산출하지 않는 시간 소모적이고 지루한 기술을 활용했습니다.
UPLC 분석은 초원심분리기 및 UPLC에 접근할 수 있는 모든 기본 실험실에서 쉽게 구현될 수 있습니다. 우리가 아래에 존재하는 UPLC 방법은 완전한 사쿠리를 분리하여 그 안에있는 모든 화학 종에 대한 포괄적이고 정량적 인 정보를 제공합니다. 이 방법은 박테리아의 인구에 걸쳐 모든 muropeptides의 정확한 정량화를 산출, 모두 20 분 UPLC 실행 내에서. 이 방법의 구현은 재료에 상당한 재정적 투자없이, 기본적인 실험실 기술을 포함한다. 이 방법의 단계를 실행하기 위해, 연구원은 파이펫팅, 완충제 및 효소를 준비하고, pH를 조정하는 데만 숙련되어 광범위한 과학적 분야에 접근할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 효소의 선택은 분석되는 박테리아의 종에 따라 달라집니다; 여기에 설명된 프로토콜은 대장균에유용하며 일반적으로 다른 그람 음성 유기체로부터 사쿠리를 분리하기에 적합한 것으로 나타났습니다. 문헌과의 상담은 그램 양성 균에이 방법을 적용 할 때 권장됩니다; 이 종에서, 타분 정화는 전통적으로 더 어려웠다. 특히, 이러한 방법은 그람 양성 균의 테이초크산과 같은 두꺼운 벽 및 부속품 폴리머를 수용하기 위해 효소 선택 및 소화 시간의 길이 측면에서 변경되어야 할 수 있다. 이 프로토콜의 첫 번째 효소는 펩티도글리칸에 부착된 외부 막 지단백(Braun의 지단백질 또는 Lpp)을 갈라서 세포벽으로부터 Lpp의 C-말단 디-(또는 트라이-) 펩타이드를 제외한 모든 것을 방출한다. 이 단계는 Enterobacteria를 검사할 때 필요합니다, 그러나 많은 그밖 그람 음성 박테리아에는 Lpp 등가물이 없습니다, 그러므로 이 단계는 건너뛸 수 있습니다. 두 번째 효소는 특히 펩티도글리칸의 무암산 성분 을 쫓아, 무로프티드 종을 형성하는 불각체 서브유닛을 용해한다. PG의 아키텍처에 대한 정확한 평가를 제공하기 위해, 크로스브릿지 또는 펩티드 줄기의 다른 부분의 분열을 방지하기 위해 사쿠리를 소화하는 데 주의를 기울여야 한다.
100종 이상의 세균성 종의 펩티도글리칸의 화학 조성물은 HPLC에 의해 분석되었지만 UPLC 기술로는 분석이 수행되지 않았습니다. 또한, 이전 작품은 세균 영역의 극히 일부만에서 펩티도글리칸을 특징으로 하며, 일부는 HPLC의 처리량에 의해 제한된다. 따라서, 가능한 한 많은 연구자에 이 방법의 보급, UPLC 플랫폼에 구현, 그의 펩티도글리칸아직 분류되지 않은 세균성 종의 큰 부분의 생리학적 연구를 구동하는 데 중요 할 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Pronase E</td>
			<td style="width:115px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">E629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mutanolysin from Streptomyces</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium borohydride (NaBH4)&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">452882</td>
			<td>Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orthophosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">79607</td>
			<td>Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td>Sodium azide is a poison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex 0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH strips (pH range 0-6)</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M95863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene Falcon tubes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13 mm x 100 mm glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:119px;">60CM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial</td>
			<td style="width:115px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000327C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:115px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9820</td>
			<td>SDS powder is hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Instrumentation</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Waters Acquity UPLC H-Class system, including:</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#181;m column</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC PDA Detector</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waters Fraction Collector III</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and preparation of bacterial cell walls for compositional analysis by ultra performance liquid chromatography

세균성 세포벽은 성장과 분열 시 세포 모양의 결정에 중요하며, 강압에 직면하여 세포의 기계적 무결성을 유지합니다. 세균 왕국의 다양한 모양과 크기에 걸쳐, 세포 벽은 펩티도글리칸, 짧은 펩티드에 의해 교차 설탕 가닥의 매크로 분자 네트워크로 구성되어 있습니다. 세균 생리학에 대한 Peptidoglycan의 중앙 중요성은 항생제 표적으로 그것의 사용을 기초하고 성장과 분열 도중 강하게 조립되는 방법의 유전, 구조 및 세포 생물학 연구 결과를 동기를 부여했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 광범위 한 조사 는 여전히 완전히 펩 티도 글리칸 합성및 세균 성 세포 벽의 화학 구성에 주요 효소 활동을 특성화 하는 데 필요한. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 다양한 환경 및 유전적 조건하에서 자란 박테리아의 벽의 화학적 조성에 대한 차이를 정량화하는 강력한 분석 방법이지만, 처리량은 종종 제한적이다. 여기서, 우리는 HPLC및 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 통해 펩티도글리칸의 생물학적 분석을 위한 세균성 세포벽의 격리 및 준비를 위한 간단한 절차를 제시합니다, HPLC에 대한 6,000 psi에 비해 최대 15,000 psi의 초고압을 제공하기 위하여 펌프를 이용하는 HPLC의 확장. 여기에 제시 된 세균성 세포벽의 준비와 함께, 낮은 볼륨 샘플 인젝터, 높은 샘플링 비율을 가진 검출기, 더 작은 샘플 볼륨, UPLC의 짧은 실행 시간은 초음파 심분리기 및 UPLC에 대한 액세스 와 대부분의 생물학적 실험실에서 펩티도글리칸 조성 및 기본 세균 세포 생물학의 새로운 발견을위한 고해상도 및 처리량을 가능하게 할 것이다.

도 1에설명된 절차를 사용하여 최종 샘플은 UPLC 바이알(Step 4.4)으로 직접 필터링된 명확한 용액의 최소 200μl로 구성되어야 합니다. 세균 샘플에서 다양한 무로프티드의 UPLC 분리는 액체 이동 상과 컬럼의 고정 단계 사이의 상대적 용해도에 의존한다. 반전 단계 C18 컬럼은 소수성 및 크기8에기초하여 무로프타이드 종을 분리하기 위해 강하게 소수성 매트릭스를 제공한다. 극성, ...

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Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.

초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

isolation-preparation-bacterial-cell-walls-for-compositional-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

16.0K 조회수.  Stanford University. 세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

연구

화학

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

임신 중 쥐의 간 조직에서 지방산의 작곡 변화를 분석하는 가스 크로마토 그래피의 사용

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

합성과 메조 포러스 실리카의 벽에 금 층상의 촉매 성능

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

고압 액체 크로마토 그래피와 글루코 추출 및 분석을위한 간단한 방법 (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully understood. We have traced the trajectories of individual nanoparticles using liquid-cell transmission electron microscopy (TEM) to investigate the mechanism of the assembly process. Herein, we present the protocols used for liquid-cell TEM studies of the self-assembly mechanism. First, we introduce the detailed synthetic protocols used to produce uniformly sized platinum and lead selenide nanoparticles. Next, we present the microfabrication processes used to produce liquid cells with silicon nitride or silicon windows and then describe the loading and imaging procedures of the liquid-cell TEM technique. Several notes are included to provide helpful tips for the entire process, including how to manage the fragile cell windows. The individual motions of nanoparticles tracked by liquid-cell TEM revealed that changes in the solvent boundaries caused by evaporation affected the self-assembly process of nanoparticles. The solvent boundaries drove nanoparticles to primarily form amorphous aggregates, followed by flattening of the aggregates to produce a 2-dimensional (2D) self-assembled structure. These behaviors are also observed for different nanoparticle types and different liquid-cell compositions.

Here we introduce experimental protocols for the real-time observation of a self-assembly process using liquid-cell transmission electron microscopy.

나노 입자의 자기 조립 추적에 대 한 액체 셀 전송 전자 현미경 검사 법

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...