Ringraziamo Melissa Griffin e Jenna Rozacky per la loro esperta cura dei pesci. PDM grazie EGN per la scrittura di assistenza, generosità e pazienza. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCR R01DE020884 a JKE.

1. Zootecnia e mutante alleli <ol><li> Sollevare e razza zebrafish come descritto 21. </li><li> Zebrafish alleli mutanti utilizzati in questo studio sono stati PDGFRA b1059 16, B1100 smad5 22, e SMO B577 23. Fonti per questi ceppi di zebrafish sono Zirc. </li></ol> 2. Preparazione di soluzioni e attrezzi Nota: Tutte le soluzioni e gli strumenti possono essere fatte in anticipo e conservati per uso futuro. <ol><li> Rendere i media embrione (EM), come descritto in precedenza 21. </li><li> Fai 4 g / L MS-222 (Tricaine). Sciogliere 4 g di fosfato di sodio (Na 2 HPO 4) in 450 ml di acqua sterile. Aggiungere 2 g MS-222 alla soluzione. Regolare il pH entro 7,0-7,2. Aggiungere acqua sterile fino ad un volume totale di 500 ml. </li><li> Optional: Marca 4 g / L di olio di chiodi di garofano. Pesare 0,2 g di olio di chiodi di garofano puro in una provetta da 50 ml. Aggiungere EM ad un volume totale di 50 ml. Conservare a 4 ° C. </li><li> Fai 3% methylcelluloSE. Portare a 50 ml di EM + 0,1 M HEPES a ebollizione. Togliere dal fuoco. Mescolare in 1,5 g di metilcellulosa ottenere una soluzione omogenea. Conservare a 4 ° C. </li><li> Fai 0,2% agarosio. Aggiungere 0,1 g di agarosio a 50 ml EM. Portare EM ad ebollizione nel forno a microonde o su una piastra e verificare che l&#39;agarosio si è dissolto. Aliquota in 500 volumi microlitri in tubi microcentrifuga e conservare a 4 ° C. Nota: I volumi possono essere regolati in base alle esigenze. </li><li> Fai mazze capillari. Mettere una goccia di colla super all&#39;interno di un tubo capillare 0,9 millimetri ID. Inserire una lunghezza 4-5 cm del 6 Prova Lb monofilamento lenza all&#39;interno del tubo capillare tale che circa 3-4 mm di linea si estende oltre l&#39;estremità del tubo. </li><li> Fare due lamelle a ponte per campione. Super-colla 22 x 22-1 vetro di copertura su ogni estremità di una copertura in vetro 24 x 60-1 lasciando il centro libero. Fai single (1 piccolo vetro di copertura per fine) per gli embrioni di meno di un giorno di vita, raddoppia (2 piccoli bicchieri di copertura sulla parte superiore di ogni altro per estremità) per gli embrioni 03:59 days vecchi, o triple (3 bicchierini di copertura sulla parte superiore di ogni altro per estremità) per gli embrioni cinque giorni o più. </li><li> Riempire una siringa da 10 ml con grasso alto vuoto. Nota: grasso per vuoto serve come sigillante per prevenire la disidratazione dei campioni per lunghi periodi di tempo ed ha un basso potenziale di tossicità rispetto ai sigillanti più volatili. </li></ol> 3. Montaggio embrioni di zebrafish per Microscopia confocale (vedi figura 1) <ol><li> Preparare mezzo anestetico. Sciogliere un&#39;aliquota dello 0,2% agarosio da forno a microonde in intervalli di 20 secondi fino a completo liquido. Mescolare 8 ml di MS-222 in 192 ml di 0,2% agarosio o 5 ml di 4 g / L di olio di chiodi di garofano in 195 ml di 0,2% agarosio. Mantenere in un blocco di riscaldamento 42 ° C. Nota: Lunga esposizione a MS-222 provoca ritardi nello sviluppo forte di olio di chiodi di garofano fa in zebrafish embrionale 24. </li><li> Se necessario: dechorionate manualmente gli embrioni transgenici non schiuse da analizzare solo prima dell&#39;analisi. Utilizzando pinze, lentamente tear il corion aperta fino l&#39;embrione viene liberato. </li><li> Anestetizzare gli embrioni di zebrafish. Aggiungere 1 ml di 4 g / L stock di MS-222-24 ml di mezzi di embrioni. In alternativa, aggiungere 390 ml di 4 g / L di olio di chiodi di garofano per 24 ml di acqua di pesce 24. Nota: gli atti di chiodi di garofano lentamente in modo da eseguire questo passaggio, almeno 15-20 minuti prima di microscopia time-lapse. </li><li> Mettere una goccia di grasso per vuoto attorno allo spazio centrale di un vetrino ponte rivolta verso l&#39;alto. Lentamente spingere il grasso per vuoto dalla siringa, rendendo un liscio, cordone continuo che è adiacente e all&#39;interno dei ponti e il bordo del vetrino. </li><li> Diffondere un cerchio di 4% di metilcellulosa al centro del vetrino a ponte con un applicatore di legno. </li><li> Trasferire l&#39;embrione deve essere ripreso. Quando l&#39;embrione è anestetizzato tirarla fino in una pipetta di vetro. Tenere la pipetta verticalmente per permettere l&#39;embrione a depositarsi sul fondo del liquido nella pipetta. Spostare la pipetta nella soluzione di agarosio e consentire l&#39;embrione a gocciain agarosio. Non espellere il liquido. </li><li> Posizionare il provino. Disegnare qualche soluzione di agarosio e l&#39;embrione nella pipetta. Espellere l&#39;embrione in una goccia di soluzione di agarosio in cima alla metilcellulosa. Utilizzare un poker capillare per spingere l&#39;embrione verso il basso sul metilcellulosa e orientare l&#39;embrione come desiderato per l&#39;imaging. </li><li> Sigillare il campione. <ol><li> Posizionare un vetrino ponte sopra l&#39;montati uno, rivolto verso il basso. Applicare una pressione uniforme su entrambi i lati i coprioggetti sandwich fino a quando i ponti in contatto diretto e le guarnizioni goccia di agarosio ad entrambe le lamelle. Verificare che l&#39;embrione sia orientata correttamente. </li><li> Strofinare un applicatore di legno lungo il vetro per appianare le crepe e lacune nella tallone grasso per vuoto. Eliminare il grasso in eccesso dai bordi. </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse confocale Imaging di transgenici embrioni di zebrafish (Questo protocollo è stato ottimizzato per un microscopio confocale Zeiss LSM 710 cizione software di imaging ZEN, e possono essere modificati per essere utilizzati con altri sistemi.) <ol><li> Attiva attrezzature. Accendere il microscopio confocale e tutti i dispositivi laser esterni. Accendere il computer collegato al microscopio confocale. Software di imaging Aprire confocale e selezionare &quot;Start System&quot; per attivare i comandi di acquisizione di immagini. </li><li> Preparare palco riscaldato. Abbassare la piattaforma messa in scena del microscopio confocale e spostare le lenti dell&#39;obiettivo fuori posizione. Sostituire il palco di default con uno stadio elettronico riscaldata. Accendere il controller per la fase riscaldato e impostare la temperatura di 29,5 ° C. </li><li> Posizionare il campione nel campo visivo. Porre il campione montati sul palco. Spostare la lente obiettivo 20X in posizione e sollevare la piattaforma messa in scena. Attivare l&#39;emettitore di luce visibile e guardare attraverso gli oculari. Centro della testa dell&#39;embrione nel campo visivo. </li><li> Definire le impostazioni dell&#39;esperimento. <ol><li> Attivare canali di fluorescenza selezionandola lunghezza d&#39;onda fluorescente per essere rilevato e scegli tabelle di colore lookup (LUT) per ogni canale. Se necessario, utilizzare i controlli manuali del software per accendere i laser necessarie (ad esempio 561 nm per RFP). Per ogni canale di fluorescenza, impostare l&#39;intensità del laser a 10.0 e la tensione fotomoltiplicatore (HV o guadagno) tra 600-700. Impostare la media a 4 e la profondità di bit a 16 bit. </li><li> Attivare i moduli della serie Z-stack e di tempo. Impostare la pinhole di Z-risoluzione 5 micron o più piccolo, e impostare l&#39;intervallo Z alla distanza ottimale suggerito. Nota: Generalmente, 5 micron Z-risoluzione consente ogni immagine Z-stack da raccogliere abbastanza rapidamente per un &#39;&quot;istantanea&quot; dell&#39;embrione in un punto particolare tempo, mentre anche la risoluzione singole celle. Abbassando la media riduce anche la quantità di tempo per immagine. </li><li> Definire l&#39;intervallo desiderato di tempo tra le immagini (di solito 10-20 min) e la lunghezza totale dell&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Impostare posizionaleinformazioni. <ol><li> Accendere la fotocamera in modalità live. Regolare la messa a fuoco e aumentare l&#39;intensità del laser, se necessario vedere fluorescenza. Impostare lo zoom digitale a 0.6 per una visione più ampia, se lo si desidera. </li><li> Posizionare la fase così che tutte le strutture di interesse siano visibili e c&#39;è spazio nel campo di vista per dorsalmente escrescenza ed anteriormente. Concentrarsi attraverso l&#39;embrione ai limiti superiore e inferiore della fluorescenza. Impostare la prima e l&#39;ultima fetta Z-stack almeno 100 micron o più al di là di questi limiti. </li></ol></li><li> Ottimizzare intensità di fluorescenza. <ol><li> Impostare la LUT visualizzazione di spaziare indicatore. Strutture fluorescenti dovrebbero ora appaiono bianche, e il resto del campo visivo dovrebbe essere blu (nessun rilevamento) o nero. </li><li> Aumenta HV / guadagno a un livello appena al di sotto dove saturo (rosso) pixel visualizzati. Se necessario, regolare compensare così la maggior parte dello sfondo non viene rilevato (blu). Nota: Più piccolo diametro pinhole e una maggiore intensità del laser sia per migliorare l&#39;immagine definizione, ma l&#39;intensità del laser deve essere mantenuta bassa per conservare tessuti viventi. Aumento HV / guadagno e del diametro pinhole (&lt;5 micron) sono generalmente preferibile una maggiore intensità del laser. </li><li> Tenere il diametro del foro abbastanza largo per raccogliere le immagini in modo tempestivo, con una media set a 4. La Z-intervallo deve essere sempre impostato sulla distanza ottimale suggerito per il diametro pinhole. Eseguire scansioni brevi (media = 1) con diverse impostazioni, e utilizzare l&#39;intensità minima laser che raggiunge la risoluzione desiderata. </li></ol></li><li> Esegui l&#39;esperimento per il tempo desiderato. In seguito, rimuovere embrione dal palco riscaldato e lentamente separare le lamelle. Immergere il vetrino ed embrione in EM in una capsula di Petri 30 millimetri. Usando una pipetta di vetro lavare delicatamente l&#39;embrione fuori del vetrino e rimuovere il vetrino dalla piastra di Petri. Posizionare l&#39;embrione in un incubatore 28,5 ° C di continuare a sviluppare. </li><li> Confronta crescita. Alla fine dell&#39;esperimento, prendere individuale Zsimmagini virata di embrioni fratelli montato agarosio che analogamente sono stati in scena al provino all&#39;inizio dell&#39;esperimento, ma sono state sollevate in EM in un incubatore 28,5 ° C. </li><li> Misurare archi faringei, se necessario. Le misurazioni possono essere eseguite in alcune suite software confocale. Misure trovati qui sono stati eseguiti utilizzando Fiji25 importando e Z-proiezione di file. LSM di singoli fotogrammi. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Time-lapse microscopia confocale è un potente strumento per l&#39;analisi dello sviluppo. Qui, dimostriamo l&#39;utilità del metodo nello studio della faringe arco morfogenesi in zebrafish che sono mutante per vie di segnalazione importanti utilizzando un transgenici che le etichette cellule della cresta neurale. Oltre al livello del tessuto analisi, analisi lasso di tempo sono applicabili ad analisi su scala cellulare 28 anche. Molti metodi di zebrafish ampiamente utilizzati possono anche essere incorporat...

Morfogenesi craniofacciale è un complesso processo multi-step che richiede interazioni coordinate tra più tipi di cellule. La maggior parte dello scheletro craniofacciale è derivato da cellule della cresta neurale, molti dei quali devono migrare dal tubo neurale dorsale in strutture transitori chiamati archi faringei 1. Come in molti tessuti, morfogenesi dello scheletro craniofacciale è più complicato che può essere compreso da immagini statiche di embrioni in punti temporali specifici dello sviluppo. Sebbene per funzionare richiede tempo, in vivo microscopia time-lapse fornisce un aspetto continuo a cellule e tessuti di un embrione di sviluppo. Ogni immagine in una serie di time-lapse presta contesto agli altri, e aiuta una mossa investigatore verso dedurre perché si verifica un fenomeno anziché dedurlo ciò che sta avvenendo in quel momento. Imaging in vivo è quindi un potente strumento descrittivo per approcci sperimentalidecostruire i percorsi che guidano la morfogenesi. Il Danio rerio zebrafish è un modello genetico popolare di sviluppo embrionale dei vertebrati, ed è particolarmente adatto per l&#39;imaging in vivo della morfogenesi. Moderno, comodi metodi di transgenesi e la modifica genomica stanno rapidamente avanzando il numero di strumenti a disposizione dei ricercatori di zebrafish. Questi strumenti permettono di migliorare metodi già robuste per la manipolazione genetica e la microscopia. Immagini in vivo di quasi tutti i tessuti in quasi ogni contesto genetico desiderato è più vicino alla realtà di quanto la fantasia. Movimenti morfogenetici degli archi faringei sono guidati da segnalare interazioni tra la cresta neurale e gli epiteli adiacente, sia ectoderma e endoderma. Numerose sono le molecole di segnalazione espresse dal epiteli che sono necessarie per guidare la morfogenesi di elementi scheletrici craniofacciali. Tra queste molecole di segnalazione, Sonic Hedgehog (Shh), è di fondamentale importanza fo sviluppo craniofacciale 2-8. Shh è espresso sia dalla ectoderma cavo orale e faringe endoderma 2,6,9,10. L&#39;espressione di Shh nel endoderma regola i movimenti morfogenetici degli archi 10, patterning di cresta neurale all&#39;interno degli archi 10, e la crescita dello scheletro craniofacciale 11. Segnalazione Bmp è anche di fondamentale importanza per lo sviluppo craniofacciale 12 e può alterare la morfogenesi degli archi faringei. Segnalazione Bmp regola dorsale / ventrale patterning di cresta all&#39;interno degli archi faringei 13,14. Turbativa di smad5 in zebrafish causa gravi difetti palatali e un fallimento della cartilagini del Meckel di fondere in modo appropriato sulla linea mediana 15. Inoltre, i mutanti mostrano anche riduzioni e fusione negli elementi cartilagine ventrale, con il 2 °, 3 °, e talvolta elementi arco 4 ° faringea fusi sulla linea mediana 15. Queste fusioni suggeriscono fortemente che la segnalazione Bmp dirige la morfogenesi di questi elementi faringee. Segnalazione PDGF è necessario per lo sviluppo cranio-facciale, ma ha ruoli sconosciuti in faringeo arch morfogenesi. Sia il mouse e zebrafish mutanti PDGFRA hanno profonda clefting mediofacciale 16-18. Almeno in zebrafish questo clefting mediofacciale è dovuta ad un imperfetto della migrazione delle cellule della cresta neurale 16. Cellule della cresta neurale continuano ad esprimere PDGFRA dopo essere entrati gli archi faringei. Inoltre, leganti PDGF sono espresse da epiteli facciale e all&#39;interno degli archi faringei 16,19,20, così segnalazione PDGF potrebbero anche svolgere un ruolo nella morfogenesi degli archi faringei seguenti migrazione. Tuttavia, le analisi della morfogenesi degli archi faringei in mutanti PDGFRA non sono stati eseguiti. Qui, dimostriamo in vivo microscopia confocale di pharynguluna fase zebrafish transgenico e descrivere la morfogenesi degli archi faringei entro questo periodo. Dimostriamo inoltre i comportamenti dei tessuti che sono affetti da mutazioni che interrompono la Bmp, PDGF, e vie di segnalazione Shh.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">6 lb. test monofilament line</td>
			<td style="width:189px;">Cortland Line Company</td>
			<td style="width:185px;">SLB16</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Agarose I</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:185px;">0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Argon laser</td>
			<td style="width:189px;">LASOS Lasertechnik GmbH</td>
			<td style="width:185px;">LGN 3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td>
			<td style="width:189px;">FHC</td>
			<td style="width:185px;">30-31-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Clove oil</td>
			<td style="width:189px;">Hilltech Canada, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">HB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:189px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:185px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isotemp dry-bath incubator</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">2050FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laser scanning microscope</td>
			<td style="width:189px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:185px;">LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium sulfate hexahydrate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 22x22-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 24x60-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TempController 2000-2</td>
			<td style="width:189px;">PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:189px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

Time-lapse imaging è una tecnica che permette l&#39;osservazione diretta del processo di morfogenesi, o la generazione di forma. Grazie alla loro chiarezza e la riconducibilità alla manipolazione genetica ottica, l&#39;embrione zebrafish è diventato un organismo modello popolare con cui eseguire l&#39;analisi time-lapse della morfogenesi in embrioni viventi. Confocale di un embrione zebrafish vivo richiede che un tessuto di interesse è persistentemente marcata con un marcatore fluorescente, quale un transgene o colorante iniettato. Il processo richiede che l&#39;embrione è anestetizzato e tenuto in posizione in modo tale che lo sviluppo sano procede normalmente. Parametri per l&#39;imaging devono essere impostati per spiegare la crescita tridimensionale e di bilanciare le esigenze di risolvere singole cellule mentre ottenere rapidi snapshot di sviluppo. I nostri risultati dimostrano la capacità di eseguire a lungo termine imaging in vivo di embrioni di zebrafish fluorescenza etichettati e per rilevare vari comportamenti dei tessuti incresta neurale cranica che causano anomalie cranio-facciali. Ritardi nello sviluppo causati da anestesia e montaggio sono minime, e gli embrioni sono illesi dal processo. Embrioni Time-lapse impressi possono essere restituiti a mezzo liquido e successivamente ripreso o fissati ai punti successivi dello sviluppo. Con l&#39;abbondanza crescente di linee di zebrafish transgenici e mappatura destino ben caratterizzato e tecniche di trapianto, l&#39;imaging qualsiasi tessuto desiderato è possibile. Come tale, time-lapse imaging in vivo coniuga potentemente con metodi genetici zebrafish, comprese le analisi di embrioni mutanti e microiniettati.

In wild-type embrioni, seguendo la popolazione cresta neurale, gli archi faringei allungano lungo gli assi ventrali anteriori / posteriori e dorsali / mentre si muove in una direzione rostrale (Movie 1). A 30 ore dopo la fecondazione (HPF), la lunghezza anteriore / posteriore del primo arco faringeo è compreso tra 1,8-1,9 volte la sua dorsale / ventrale altezza. Dorsale / allungamento ventrale procede costantemente, più veloce di estensione anteriore / posteriore fino a 36,5 hpf. Da qui, dorsale / ven...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy at JoVE.com

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging confocale è una tecnica potente utile per caratterizzare sviluppo embrionale. Qui, descriviamo la metodologia e caratterizzare morfogenesi craniofacciale wild-type, così come PDGFRA, smad5, e SMO embrioni mutanti.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  The University of Texas at Austin.  Time-lapse imaging confocale è una tecnica potente utile per caratterizzare sviluppo embrionale. Qui, descriviamo la metodologia e caratterizzare morfogenesi craniofacciale wild-type, così come PDGFRA, smad5, e SMO embrioni mutanti. 

Video: Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Ricerca

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Microscopia 4D del lievito

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...