La nostra comprensione della morfogenesi oculare deriva da precedenti studi sui tessuti fissi. Tuttavia, questi studi mancavano di dinamica cellulare e tissutale. Utilizzando l'imaging time-lapse, siamo in grado di catturare l'intero processo per la visualizzazione e l'analisi.
Il nostro metodo che sfrutta lo sviluppo esterno nella chiarezza ottica degli embrioni di zebrafish, che facilita l'imaging dal vivo, e utilizza la microscopia confocale a scansione laser che è prontamente disponibile nella maggior parte dei campus di ricerca. I ricercatori nuovi a questo metodo dovrebbero aspettarsi alcuni tentativi ed errori prima di ottenere un set di dati utilizzabile. Molti passaggi, in particolare le iniezioni e l'incorporamento, devono andare bene per avere successo, quindi abbiate pazienza.
Una volta che il pesce zebra inizia a riprodursi, mentre attende da 15 a 20 minuti per assicurarsi che le uova si fecondino, utilizzare una pipetta P10 e punte di microlitri P10 per ricaricare un micro ago per iniezione capillare di vetro tirato con 2,5 a 5 microlitri della diluizione dell'RNA di interesse. Quando le uova sono pronte, utilizzare una pipetta di trasferimento e un microscopio di dissezione per caricare con cura le uova nello stampo a iniezione, usando una pinna per far rotolare gli embrioni in modo tale che la singola cellula sia visibile se necessario. Quindi iniettare tutti gli embrioni allo stadio unicellulare, prendendo di mira la cellula e non il tuorlo per garantire un'etichettatura uniforme dell'embrione in via di sviluppo.
A circa 11 ore dopo la fecondazione, posizionare un'aliquota da uno a cinque millilitri di acarosio a bassa fusione dell'1,6% nel mezzo E3 in un blocco di calore a 42 gradi Celsius e utilizzare un microscopio a fluorescenza per lo screening di embrioni iniettati con successo con una luminosità complessiva di fioritura. Contare i somiti per mettere in scena correttamente gli embrioni. A 11 ore dopo la fecondazione, si dovrebbero osservare tre somiti.
Un campione ideale avrà forti segnali EGFP e mCherry e sarà nella fase di sviluppo corretta. Prima di montare, posizionare gli embrioni in un piatto rivestito di agar e utilizzare una pinna per rimuovere il corion da ciascun embrione. Quando tutti gli embrioni sono stati denudati, utilizzare una pipetta a rulli di vetro per aspirare un embrione.
Espellere il più possibile E3 in modo che l'embrione si trovi sulla punta della pipetta di vetro Pasteur e lasci cadere l'embrione nel tubo di agarose dal blocco di calore. Lasciate che gli embrioni affondino nell'agarose per alcuni secondi prima di aspirare un piccolo volume di agarose insieme all'embrione, facendo attenzione che l'embrione rimanga sulla punta della pipetta. Espellere l'embrione e l'agarose in una goccia di agarose in un piatto di fondo di vetro e utilizzare rapidamente ma con attenzione una pinna per orientare il lato dorsale dell'embrione verso il basso prima che la goccia di agarose si indurisca.
Dopo aver montato da 10 a 12 embrioni nello stesso modo, aggiungere abbastanza agarose per coprire completamente il fondo del piatto racchiudendo tutte le goccioline in un singolo disco di agarose. Quando l'agarose si è indurito, strato E3 sopra l'agarose per mantenere i campioni idratati. Dopo aver impostato il microscopio confocale a scansione laser sui parametri appropriati per l'imaging time-lapse, rivestire liberamente la parte inferiore del piatto con fondo di vetro con un mezzo di immersione corrispondente all'indice di rifrazione dell'acqua, avendo cura di evitare bolle d'aria e applicare una piccola goccia di mezzo di immersione all'obiettivo dell'acqua 40X.
Fissare il piatto con fondo di vetro nell'inserto del palco e aggiungere un ulteriore mezzo E3 per mantenere gli embrioni umidi durante la notte. Utilizzare l'argilla modellante per sigillare il coperchio di plastica sopra il piatto e sollevare l'obiettivo per prendere contatto con il piatto. Sotto l'intestazione delle posizioni del software del microscopio, fare clic su Aggiungi per salvare le informazioni XYZ del primo campione da depare e selezionare un campione con una forte fluorescenza e un montaggio ottimale.
Nella scheda Individua cercare l'esempio successivo e fare clic su Posizione e Aggiungi per selezionare l'esempio come illustrato. Quando tutti i campioni sono stati selezionati, evidenziare la prima posizione e fare clic su Sposta in. Durante la scansione continua, allineare la vescicola ottica all'interno del telaio, lasciando ampio spazio nelle regioni anteriore e distale rispetto alla vescicola ottica e al cervello.
Per assegnare la prima e l'ultima fetta Z, selezionare imposta prima e imposta per ultima mentre ci si muove attraverso la direzione Z con la manopola di messa a fuoco fine, mantenendo un numero totale di fette di circa 63 per adattarsi alla crescita della tazza ottica. Includere spazio extra sul lato ventrale della vescicola ottica per consentire spazio per la crescita. Una volta impostate la prima e l'ultima fetta Z, fare clic su C per spostarsi al centro dello Z-stack e regolare la potenza e il guadagno del laser per entrambi i laser.
Quando la potenza e il guadagno del laser sono stati impostati, interrompere la scansione e fare clic su Aggiorna per aggiornare le informazioni sulla posizione. Per passare alla posizione successiva, fare clic sulla posizione due. Una volta che sia la prima che l'ultima fetta Z sono state definite come dimostrato, aprire l'intestazione della serie temporale e impostare il numero di cicli su 300 e l'intervallo di tempo su 2,5 minuti.
Dopo aver esaminato le impostazioni per assicurarsi che tutto sia finalizzato, fare clic su Start per iniziare il time-lapse e verificare che il primo ciclo di imaging sia stato acquisito correttamente prima di consentire l'esecuzione del time-lapse durante la notte. L'iniezione diretta nella singola cellula è necessaria per un'etichettatura uniforme e una fluorescenza robusta. Al momento della loro immersione nell'agarose, gli embrioni dovrebbero essere distanziati uniformemente in tutto il piatto.
Se gli embrioni sono messi in scena correttamente, sufficientemente fluorescenti e adeguatamente montati, rimarranno nel frame di imaging durante il time-lapse, consentendo l'immagine dell'intero organo. I campioni che non sono orientati lungo l'asse dorsale, come quelli orizzontali o diagonali, cresceranno fuori dal fotogramma di imaging man mano che il time-lapse procede e non potranno essere utilizzati per ulteriori analisi. Un embrione che è sovra-ruotato si tradurrà in un time-lapse più posteriore.
Un embrione sotto-ruotato permetterà di osservare solo il tessuto più anteriore. Inoltre, i campioni montati rispetto all'orientamento del telaio hanno maggiori probabilità di produrre un time-lapse di successo. Questa inclinazione verso il lato ventrale fornisce spazio extra per la crescita dei tessuti nella direzione ventrale con conseguente time-lapse ottimale.
Quando questi criteri non sono soddisfatti, il time-lapse non catturerà più l'intero volume 3D del tessuto mentre si sviluppa e non può essere utilizzato per ulteriori analisi. Questi set di dati ricchi di informazioni possono essere analizzati in molti modi, tra cui il tracciamento delle cellule 4D con quantificazioni della velocità e della traiettoria cellulare, le misurazioni del volume cellulare e tissutale e le visualizzazioni 3 e 4D.
