Name: analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning
Uploaded: 2016-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning at JoVE.com

Ringraziamo Thomas Bates per la lettura e migliorare il manoscritto in modo critico. Ringraziamo anche Christina Ebert e Sabrina Stötzer per la manutenzione del pesce.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono state eseguite secondo i &quot;principi della cura degli animali da laboratorio&quot;, nonché alla versione corrente della legge tedesca sulla protezione degli animali. 1. Preparazione di antisenso morfolino (MO) <ol><li> Per preparare una soluzione madre 3 mM MO, aggiungere 100 ml di sterili, acqua ultrapura al MO liofilizzato (300 nmol in flaconcino di vetro). Per completa dissoluzione, riscaldare la soluzione madre a 65 ° C per 5 min. Sigillare la fiala con Parafilm e conservare la soluzione di riserva MO a temperatura ambiente (RT). Non raffreddare la soluzione madre MO perché questo potrebbe causare una associazione del MO con le pareti della fiala. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro 1 mM MO diluendo la soluzione madre MO con sterile, acqua ultrapura e aggiungere la soluzione rossa 0,5% di fenolo ad una concentrazione finale di 0,05%. <ol><li> Per ottenere 10 ml di una soluzione di lavoro MO, aggiungere 3,3 ml di soluzione MO e 1 ml di soluzione di fenolo-rosso dello 0,5% a 5,7 ml di acqua. Esserefore preparazione di un nuovo lotto di soluzione di lavoro riscaldare la soluzione MO magazzino a 65 ° C per 5 min. </li></ol></li><li> Prima dell&#39;uso, centrifugare la soluzione di lavoro MO per prevenire ago intasamento. Ad esempio, girare 10 ml di soluzione madre MO a 15.000 xg per 5 min (RT) e rimuovere 8 ml di surnatante per l&#39;iniezione. NOTA: La perdita di attività può verificarsi in soluzioni morpholino nel tempo 11. Per escludere questo, si può testare le soluzioni per spettrofotometria UV seguendo il protocollo fornito dal produttore. Nel caso dei wt1a utilizzati morfolino un&#39;efficacia ridotta non è stato osservato per un lungo periodo di stoccaggio (3 soluzione di lavoro mM è stato immagazzinato per più di uno anno). </li></ol> 2. Configurazione di coppie di accoppiamento e la raccolta di uova fecondate <ol><li> Il pomeriggio precedente microiniezione, impostare cinque coppie del Tg (wt1b: GFP) di linea, ciascuna in un contenitore dotato di allevamento un setaccio rimovibile per separaremaschi e femmine durante la notte. NOTA: per garantire che abbastanza uova sono disponibili per un esperimento di iniezione di successo, pesce utilizzato come coppie di accoppiamento avrebbe dovuto essere pre-screening e valutati come buoni &quot;produttori&quot;. </li><li> La mattina seguente, dopo le luci si accendono, mettere il maschio e la femmina insieme sopra il setaccio che impedisce il pesce da mangiare le loro uova. </li><li> Vedere la deposizione delle uova. Una volta che una quantità di uova vengono deposte che possono essere iniettati prima della fase 4 celle viene raggiunta (circa 50), maschio separato dal femminile di nuovo. Trasferire le uova con una pipetta Pasteur in una capsula di Petri riempita con acqua di embrioni per un primo giro di iniezione. Per ottenere ulteriori cicli di uova, posizionare una coppia di accoppiamento insieme e separati più volte. </li></ol> 3. Il lavoro preparatorio per microiniezione NOTA: Eseguire i punti 3.1 e 3.2 in anticipo. <ol><li> Per preparare un piatto che contiene gli embrioni in posizione durante l&#39;iniezione (piatto microiniezione) inserire un glass scivolo a un angolo di 40-45 ° in un piatto 94 millimetri Petri riempita di liquido, trasparente, puro, silicio di grado alimentare. Rimuovere la diapositiva quando il silicio è indurito. Ciò produce una scanalatura nello strato di silicio. NOTA: In alternativa, utilizzare 1.5-3% agarosio al posto del silicio e memorizzare il piatto a 4 ° C. </li><li> Generare aghi da iniezione da capillari di vetro con un estrattore ago. <ol><li> Utilizzare capillari che contengono filamenti interni. NOTA: Il filamento contribuirà a trasportare la soluzione MO verso la punta dell&#39;ago dopo il riempimento (vedi 3.3). </li><li> Stabilire impostazioni appropriate sul estrattore ago. Buone aghi per l&#39;iniezione in zebrafish dovrebbero avere punte lunghe e sottili 12. Generare punte con una lunghezza di circa 10 mm e un diametro di 1,5-2 micron al loro fine. Ad esempio, utilizzare un estrattore ago orizzontale con le seguenti impostazioni: Calore = 330, Pull = 0, velocità = 40, Tempo = 100. </li><li> Esaminare la qualità degli aghi sottodissezione microscopio e risolvere quelli con punte corto o troppo lungo. NOTA: Aghi con brevi punte tendono a danneggiare l&#39;embrione, mentre tale con molto lunghi e sottili punte curva quando si tocca il corion e non penetrano esso. </li></ol></li><li> Backfill l&#39;ago con 2 ml di soluzione di lavoro MO utilizzando una punta microloader e inserirla nel supporto dell&#39;ago dell&#39;apparato microiniezione. </li><li> Poiché gli aghi sono chiusi alla fine della punta, generare un&#39;apertura pizzicando indietro alla fine dell&#39;ago con le pinzette taglienti al microscopio di dissezione. In alternativa, utilizzare l&#39;apparato microiniezione per spingere delicatamente la punta di una superficie rigida (ad es. Blocco piccolo metallo o sul retro di una pinzetta). </li><li> Calibrare il volume di iniezione per iniettare la soluzione di lavoro MO in una goccia di olio minerale collocato su un reticolo. Regolare la durata di iniezione per la produzione di un diametro goccia di 75 micron per ottenere un volume di iniezione di circa 200 pl. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. procedura microiniezione <ol><li> Disporre gli embrioni fase 1-cell lungo la scanalatura del piatto microiniezione con il polo vegetale verso la direzione da cui l&#39;ago venga (verso l&#39;angolo di 45 ° della scanalatura). </li><li> Perforare il corion e il tuorlo con l&#39;ago e iniettare 200 pl della soluzione 1 di lavoro mm MO (0,2 pmol) nel tuorlo di 1 a 2 embrioni di cellule. </li><li> Usando una pipetta Pasteur con un&#39;ampia apertura, raccogliere tutti gli embrioni iniettati in una capsula di Petri riempita con acqua embrione e incubare a 28,5 ° C. </li><li> Nel pomeriggio, rimuovere gli embrioni morti utilizzando una pipetta Pasteur con un&#39;ampia apertura e sostituire l&#39;acqua dell&#39;embrione. </li></ol> 5. Preparazione di embrioni per imaging in vivo <ol><li> La mattina seguente, sostituire l&#39;acqua embrione con acqua embrione contenente 0,003% N-feniltiourea (PTU) per inibire melanizzazione. Non applicare PTU prima della fine del gastrulazione perché INTERFeres con sviluppo embrionale precoce. ATTENZIONE: PTU è tossico e teratogeno. Indossare guanti in ogni momento e evitare l&#39;inalazione e il contatto con la pelle. </li><li> Dechorionate gli embrioni con pinzette taglienti sotto un microscopio dissezione allo stadio di sviluppo desiderato. Afferrare il corion con una coppia di pinzette e cercare di afferrare l&#39;altro lato del corion con una seconda coppia di pinzette. Estrarre con cautela le pinzette in direzioni opposte senza interrompere l&#39;embrione. </li><li> Anestetizzare l&#39;embrione sostituendo l&#39;acqua embrione contenente PTU (0,003%) con acqua embrione contenente PTU (0,003%) e 0,02% di etile metanosolfonato 3 aminobenzoate (Tricaine). </li><li> Incorpora l&#39;embrione a basso punto di fusione agarosio su un μ-piatto coverglass a fondo con una griglia di trasferimento di 50 micron. Una corretta inclusione richiede una certa pratica. <ol><li> Preparare 1 ml aliquote di 0,7% agarosio in provette da 1,5 ml e metterli su un blocco di calore impostato a 36 ° C. Utilizzare una pipetta Pasteur con ampia apertura a Trànsfer l&#39;embrione per la μ-piatto. Rimuovere l&#39;acqua di embrioni in eccesso con una pipetta Pasteur con punta ultra-sottile e sovrapporre l&#39;embrione con agarosio temperato. </li><li> Mentre l&#39;agarosio è ancora liquido, orientare l&#39;embrione con due punte gel caricatore nella posizione desiderata, per quanto riguarda la struttura di interesse e la distanza dalla griglia di trasferimento. Posizionare la struttura di interesse (qui i pronephros) il più vicino possibile al fondo di vetro (qui: dorsale giù) e nelle immediate vicinanze della griglia. </li><li> Per una qualità di immagine ottimale minimizzare lo strato di agarosio tra l&#39;embrione e il fondo di vetro posizionando la struttura di interesse dell&#39;embrione il più vicino possibile al fondo. Oltre a ciò, individuare l&#39;embrione nelle immediate vicinanze della griglia, ma fare attenzione che la griglia non si sovrapporrà con la struttura di interesse. Incorpora 3-4 embrioni in diverse μ-piatti ciascuno e utilizzare quello che è nella posizione migliore. </li><li> Quando l&#39;agarosio è difficile sufficiente per contenere l&#39;embrione attesa per 2-3 Min e sovrapporre l&#39;embrione embedded con acqua embrione contenente 0,003% PTU e 0,02% Tricaine. Decantare l&#39;acqua in eccesso dell&#39;embrione o rimuoverlo utilizzando una pipetta Pasteur con punta ultra-sottile. Chiudere il coperchio del μ-piatto nella posizione di bloccaggio per evitare l&#39;evaporazione. NOTA: evitare il verificarsi di bolle d&#39;aria nel μ-piatto, come sarebbero compromettere la registrazione dell&#39;immagine. </li></ol></li></ol> 6. Microscopia NOTA: utilizzare un microscopio dotato di sezionamento ottico tramite l&#39;illuminazione strutturata. Registrazione di immagini con un software che contiene i seguenti moduli: multicanale, Z-Stack, serie temporali, Software autofocus e messa a fuoco estesa. <ol><li> Acquisizione di Z-stack <ol><li> Invertire la μ-piatto. Il fondo di vetro ora rivolta verso l&#39;obiettivo e l&#39;μ-piatto serve da camera di imaging. </li><li> Spostare il cursore nella posizione di rete e attivare la modalità di illuminazione strutturata nei controlli software. </li><li> Calibrarela messa a fuoco della griglia per il canale (s) di scelta con il campione da esaminare (embrione incorporato) seguendo le istruzioni della procedura guidata di calibrazione di messa a fuoco. </li><li> Attivare la modalità di acquisizione z-stack e impostarlo in modalità centro. Mettere a fuoco in mezzo al provino e impostarlo come il piano centrale della pila Z cliccando Center. Impostare la dimensione del z-stack definendo l&#39;intervallo intorno alla posizione centrale. NOTA: strutture oggetto non deve essere visto nettamente fuori il primo e l&#39;ultimo piano della z-stack. </li><li> Regolare la spaziatura tra sezioni ottiche. Per la migliore z-risoluzione clic sul pulsante ottimale. Sulla base della profondità obiettivi di campo del software impostare una distanza raccomandata seguendo il criterio di Nyquist (50% di sovrapposizione). NOTA: Se l&#39;obiettivo per il file di dimensioni più piccole e dei permessi di struttura, impostare manualmente una dimensione più grande distanza. Impostazione passi più piccoli di quanto raccomandato si limiterà a portare a file di grandi dimensioni senza aumentare in seguitoinformazioni al. </li></ol></li><li> Time-lapse imaging <ol><li> Aprire lo strumento Time Series e impostare l&#39;intervallo dell&#39;esperimento serie storiche. Per esempio registrare le immagini z-stack ogni 30 min per un periodo di 5 ore. </li><li> Per correggere la deriva focale nel corso del tempo, impostare una strategia di messa a fuoco automatica. Selezionare la casella di dialogo strategia di messa a fuoco, selezionare Software messa a fuoco automatica dall&#39;elenco a discesa e scegliere il canale TL-Brightfield come canale di riferimento. </li><li> Iniziare ogni punto del tempo con la messa a fuoco automatica. Al fine di garantire un intervallo di ricerca affidabile all&#39;interno di un periodo di tempo ottimale, impostare un 200 micron relativo campo di ricerca fisso. Questa gamma è completamente scansionato (parametro raggio di copertura) con qualità di base (parametro di qualità) in una (parametro di campionamento) dimensione massima step. </li><li> Per aumentare la precisione della messa a fuoco automatica, attivare la misurazione all&#39;interno di una regione centro dell&#39;interesse (messa a fuoco ROI) e la posizione di messa a fuoco, ha detto il ROI nella finestra di visualizzazione dal vivo intorno alla struttura di interesse. NOTA: Seil sistema manca il modulo software Autofocus che aggiorna il centro z-posizione automaticamente durante la registrazione time-lapse, mettere in pausa l&#39;esperimento in un dato momento e regolare la messa a fuoco manualmente e continuare l&#39;esperimento. </li><li> Per compensare un potenziale XY-deriva durante la registrazione di serie temporali, posizionare un particolare punto della griglia impressa (della camera di imaging) in mirino del software e salvare il posizionamento facendo uno screenshot. </li><li> Avviare l&#39;esperimento serie storiche. Prima l&#39;intervallo di serie temporale è finito, sospendere l&#39;esperimento e, se necessario, ri-regolare il posizionamento in base alla schermata. Continuare con l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol> Processing 7. Immagine <ol><li> Passare alla scheda di elaborazione e selezionare la profondità estesa di messa a fuoco (FES) nella finestra di dialogo Method. Poiché sezioni ottiche vengono acquisiti, applicare l&#39;algoritmo Maximum proiezione alla serie di immagini. NOTA: Qui l&#39;algoritmo proietterà il brightest o più scura pixel dalla pila a un&#39;immagine composita 2D in una prima fase e poi utilizzare quello con la massima varianza immagine un risultato per ogni punto. </li><li> Utilizzare il metodo Film Export per creare un lasso di film di tempo (ad esempio avi o spostare file) fuori dalla serie di immagini FES. </li></ol>

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L&#39;autore Michael Graf è un dipendente di Carl Zeiss Microscopia GmbH che produce strumenti utilizzati in questo articolo.

Il pesce zebra è diventato un organismo modello popolare per gli studi di sviluppo dei vertebrati e modellizzazione di malattie umane. Perché zebrafish embrioni rimangono trasparenti, in via di sviluppo organi come il cervello e il cuore può essere osservato con un microscopio di preparazione standard. Approfittando di linee transgeniche con organo fluorescenza specifica consente valutazioni di organogenesi tutto diversi stadi di sviluppo all&#39;interno di embrioni che vivono al microscopio a fluorescenza. Una limitazione per l&#39;imaging dettagli strutturali di organi interi con epifluorescenza standard è l&#39;impatto di segnali da oggetti sopra e sotto il piano focale. Questa luce out-of-focus non solo i risultati in contrasto diminuito e la risoluzione, ma anche può oscurare importanti strutture di interesse 13,14. Diverse tecniche quali la scansione laser confocal-, filatura confocal- disco o microscopia multiphoton sono state sviluppate per minimizzare le informazioni fuori fuoco e con ciò increascontrasto dell&#39;immagine e così come risoluzione assiale. Un metodo alternativo per ottenere sezioni ottiche è la libera microscopia illuminazione strutturata al laser e scansione, un&#39;ampia tecnica di illuminazione campo base, che è e semplice da implementare su un microscopio regolare 15. I risultati qui presentati illustrano che sezionamento ottico, raggiunto da illuminazione strutturata, implementato su un microscopio da dissezione e combinato con la ricostruzione di immagini messa a fuoco estesa, consente la visualizzazione dei dettagli strutturali del normale e disturbato lo sviluppo dei reni in zebrafish. In particolare, le cellule GFP-positive in morphants wt1a sono disperse a varie profondità focali, e le immagini di un solo piano con out-of-fuoco sfocatura sottostimerebbero tre complessità dimensionale del fenotipo. Per seguire le dinamiche di organo organizzazione, riassetto o interruzione, time-lapse microscopia a fluorescenza è una potente seppur tecnica complessa. Durante il time-lapseimmagini lievi vibrazioni o variazioni di temperatura minori provocano derive in direzione X, Y o Z. Ciò richiede dispositivi aggiuntivi (camera ambientale, tavolo antivibrante) al fine di ottenere risultati stabili. Il metodo presentato utilizza la capacità di un microscopio da dissezione con un drive fuoco motorizzata per la registrazione di immagini in tempo-lapse senza dispositivi aggiuntivi. Per mantenere un focus stabile, una strategia autofocus è stato stabilito e una griglia trasferimento impresso sul fondo della camera di imaging è stato utilizzato per la correzione di x, y instabilità. La corretta incorporamento dell&#39;embrione è un passo fondamentale all&#39;interno del protocollo. Alcuni pratica è necessaria per posizionare la struttura di interesse più vicino possibile al fondo di vetro e nelle immediate vicinanze alla rete senza sovrapposizione con esso. Il principale vantaggio del metodo è che è uno strumento economico e semplice per l&#39;osservazione diretta dei processi di sviluppo come la crescita e la migrazione nel soggiornoembrioni per diverse ore. Inoltre, la dissezione specifici microscopio vantaggi quali grande campo di vista e la distanza di lavoro estesa facilitare l&#39;esame dei campioni più grandi, tra cui interi organi. Tuttavia, alcune limitazioni devono essere tenuti in considerazione. Pausa dell&#39;esperimento per controllare e regolare la posizione rende la procedura richiede tempo e l&#39;assenza di un controllo di temperatura robusta cambia il tempo di sviluppo &quot;standard&quot;, che è definito come hr dopo la fecondazione a 28,5 ° C per 16 zebrafish. Un altro potenziale problema è la profondità ristretta di imaging nella animale, in particolare quando la struttura di interesse si trova all&#39;interno del embrione o larve. Tale struttura è il glomerulo pronephric zebrafish, che si trova tra le somiti e il sacco vitellino. La profondità limitante per l&#39;imaging del glomerulo è risultata essere di circa 200 micron, una distanza che si raggiunge dopo 5 giorni di sviluppo. Al contrario, le strutture fluorescenti che sono lituato vicino alla superficie dell&#39;animale può essere ripreso per un tempo più lungo. Per esempio cellule epatiche sono accessibili per l&#39;imaging almeno fino 9 dpf. Un&#39;ulteriore limitazione è che l&#39;immobilizzazione lungo termine dell&#39;embrione o larve in agarosio e trattamento Tricaine indurre ritardo della crescita e edema cardiaco, rispettivamente. Perché questo può interferire con lo sviluppo normale, si raccomanda di limitare la durata della registrazione time-lapse per un certo periodo di interesse. Per garantire che durante strutture di imaging di interesse sviluppano normalmente è utile confrontare (alla fine) l&#39;aspetto complessivo con quella di un animale tenuto sotto stesse condizioni sperimentali, ma senza incorporare e anestesia. Registrazione di un z-pila di sezioni ottiche ogni 30 minuti per un periodo di 5 ore e il successivo calcolo della profondità delle immagini sfocate esteso fornito informazioni spaziali e temporali su eventi precoci del normale e disturbato lo sviluppo del rene che è stato indotto batterramento di wt1a y morfolino-mediata. Esperimenti morpholino atterramento precedentemente svolte hanno già dimostrato che Wt1a svolge un ruolo precoce e essenziale nella formazione pronephros ibridazione in situ con l&#39;indicatore del rene 17,18 e l&#39;occupazione del wt1b transgenico:. Linea GFP per lo sviluppo pronephros di imaging in tempo fisso sottolinea 9,10 rivelato che i risultati carenza wt1a nella morfogenesi glomerulare interrotto e non è riuscito specifica podocyte. In contrasto con questi approcci statici, registrazioni time-lapse visualizzare direttamente le dinamiche di nefrogenesi presto embrioni controllo e la migrazione delle cellule GFP-positive dalla regione pronephric in morphants wt1a. La possibilità di monitorare le cellule pervenute all&#39;indirizzo sbagliato nel tempo permette una più dettagliata analisi del fenotipo. In generale, il metodo che viene qui presentato fornisce un economico e facile da usare alternativa al complesso, e meno accessibili seTups normalmente utilizzati per time-lapse imaging come microscopio a scansione laser (dotato di una camera climatica e tavolo anti-vibrazione) o microscopio foglio di luce. La routine descritta per risolvere i problemi di deriva può essere applicato anche per eseguire time-lapse immagini su configurazioni senza opzioni sezionamento ottico, come microscopi a fluorescenza stereo. La tecnica non è adatto solo per indagare sviluppo renale, ma può essere applicato anche per monitorare morfogenesi normale e difettoso di altri organi come il cuore o il fegato. Inoltre, il metodo può essere usato per osservare i vari processi più dinamici in organismi modello embrionali e adulte, come la guarigione o la rigenerazione delle ferite.

A seguito di gastrulazione, organogenesi è la prossima fase del ciclo di vita di un individuo. Esso comporta il riarrangiamento, interazione e molto spesso la migrazione di cellule a produrre tessuti e organi. Inaccuratezza nei processi alla base dello sviluppo di organi porta spesso a malattie che possono manifestarsi immediatamente o anche più tardi nella vita. Pertanto, la comprensione organogenesi è stato un grande sforzo in biologia dello sviluppo e della ricerca biomedica. Per essere in grado di esaminare lo sviluppo di un particolare organo, deve essere visibile anche attraverso la parete del corpo dell&#39;embrione. Ciò consente la registrazione delle alterazioni spaziali e temporali che si verificano durante lo sviluppo. Inoltre al fine di analizzare l&#39;importanza dei fattori coinvolti nella organogenesi, deve essere suscettibile di manipolazione. Un organismo che è estremamente adatto per l&#39;indagine dell&#39;organogenesi in vivo è zebrafish. La sua trasparenza durante lo sviluppo embrionale in combinazione con l&#39;uso di linee transgeniche fluorescenti permette l&#39;osservazione delle dinamiche di localizzazione proteine ​​e di espressione, così come la visualizzazione degli organi interni 1. Ciò fornisce un vantaggio unico per quanto riguarda la ricerca di sviluppo degli organi in tempo reale rispetto ai modelli di mammiferi i cui organi sono inaccessibili per l&#39;analisi microscopica. Inoltre, diversi strumenti sono disponibili per manipolare lo sviluppo embrionale di zebrafish. Accanto alla generazione di linee mutanti, oligonucleotidi antisenso morfolino (MO) possono essere utilizzati per abbattere l&#39;attività di particolari geni che sono coinvolti nello sviluppo di certi organi. MO sia bersaglio di un sito giunzione o la traslazione codone di inizio (AUG), e quindi interferiscono con splicing del pre-mRNA o la traduzione. Il rene embrionale zebrafish, i pronephros, è un modello anatomicamente semplice ma prezioso per studiare lo sviluppo dei reni e la funzione di generazionees legate a malattie renali 2. Si compone di due sole unità funzionali chiamate nefroni. Ogni nefrone è composto da un glomerulo dove filtrazione del sangue avviene 3. Ulteriori componenti sono regione del collo breve e tubulo segmentato per la secrezione e il riassorbimento di soluti e del condotto, che termina nella cloaca 4. Indipendentemente dalla sua composizione semplice, l&#39;organizzazione ed i diversi tipi cellulari dei pronephros zebrafish sono molto simili al rene mammiferi 5,6. Un fattore, che è criticamente coinvolta nello sviluppo del rene, è codificata dal gene soppressore del tumore di Wilms WT1 7. Zebrafish possiede due paraloghi chiamati wt1a e wt1b essere espresso in un modello identico sovrapposizione, ma non durante lo sviluppo dei pronephros 8. Utilizzando zebrafish transgenico con strutture Pronefro GFP-marcato, è stato dimostrato che la completa knock-down di wt1a &lt;/ em&gt; o di una particolare forma di giunzione porta a malformazioni gravi o lievi del rene embrionale, rispettivamente 9,10. Il metodo descritto qui permette l&#39;analisi time-lapse di nefrogenesi normale e compromessa in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione attrezzata per sezionamento ottico tramite l&#39;illuminazione strutturata. sezioni ottiche in generale consentono l&#39;acquisizione di immagini che contengono solo informazioni di messa a fuoco. Out-of-focus informazioni può essere evitato vari approcci, come algoritmi matematici (ad es. Deconvoluzione), design ottico (ad es confocale a scansione laser microscopia) o una combinazione di entrambi (per esempio illuminazione strutturata). Per indurre difetti di sviluppo del rene abbiamo usato un antisenso MO contro wt1a che è stato iniettato in una linea di zebrafish transgenico (Tg (wt1b: GFP)). Questa linea mostra GFP-fluorescenza nel glomerulo, il collo e la parte anterioreparte del tubulo 9,10. In confronto a configurazioni più complesse per le registrazioni time-lapse con sezionamento ottico come la scansione laser o microscopi foglio di luce, un microscopio zoom è facile da gestire e meno costoso. Inoltre, Attrezzature per illuminazione strutturata può facilmente essere combinato con apparecchiature convenzionali di fluorescenza (ad esempio fluorescenza lampada, filtri) e offerte sezionare vantaggi specifici microscopio ad esempio una distanza di lavoro estesa e ampio campo visivo. I problemi con la deriva sono stati risolti senza l&#39;utilizzo di ulteriori attrezzature (camera ambientale, tavolo anti-vibrazione) di solito necessari per ottenere risultati stabili. Per correggere la deriva focale è stata stabilita una strategia di messa a fuoco automatica e le camere di imaging con griglie di trasferimento impresse sono stati utilizzati per ri-regolare il posizionamento a seguito di una deriva in direzione xoy. Il metodo proposto può essere applicato anche per microscopi senza opzioni sezionamento ottico, come la fluorescenza stereo microscopes e offre un&#39;alternativa ai mezzi più complessa che viene normalmente utilizzato per la registrazione time-lapse di tessuti in via di sviluppo e le dinamiche di organi.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Morpholino</td><td>Gene tools, LLC</td><td>Standard control oligo</td><td>Prepared&amp;nbsp;control&amp;nbsp;oligo</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;wt1a&lt;/em&gt; Morpholinos&amp;nbsp;</td><td>Gene tools, LLC</td><td>customized</td><td>Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. &lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>0.5% Phenol red solution</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Injection tracer</td></tr><tr><td>peqGOLD universal agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td>To prepare microinjection dish</td></tr><tr><td>Glass capillaries&amp;nbsp; (GC100F-10)</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>30-0019</td><td>To generate injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>To load the microinjection needle</td></tr><tr><td>Dumont forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Sience Tools</td><td>91150-20</td><td>To generate an opening at the needle tip&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Embryo water (0.3x Danieaus&amp;acute; solution)</td><td></td><td></td><td>1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;,&amp;nbsp; 0.6 Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue!</td></tr><tr><td>Graticule 5 mm/0.05 mm</td><td>Science Services</td><td>PY68039-02</td><td>For calculation of injection amount</td></tr><tr><td>Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml</td><td>Roth</td><td>E305.1</td><td>To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos</td></tr><tr><td>Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml</td><td>Roth</td><td>E304.1</td><td>To remove excess of water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>For suppression of melanization</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>To anethesize zebrafish</td></tr><tr><td>Low melting agarose</td><td>Biozym</td><td>850111</td><td>For embedding&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;micro;-dish&lt;sup&gt; 35 mm, high&lt;/sup&gt; Glass Bottom Grid-50</td><td>ibidi</td><td>81148</td><td>Imaging chamber</td></tr><tr><td>Gel loader tips</td><td>Hartenstein</td><td>GS05</td><td>To orient the embryo for proper embedding</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller (model P-97)</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>To generate injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Saur Laborbedarf</td><td></td><td>For microinjection</td></tr><tr><td>Thermomixer copact</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermoblock for tempering the low melting agarose</td></tr><tr><td>SZ61 (Stereomicroscope)</td><td>Olympus</td><td></td><td>For injection control</td></tr><tr><td>Axio Zoom. V16</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For embedding and imaging</td></tr><tr><td>ApoTome.2 slider</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For optical sectioning</td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For image acquisition&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZEN 2012</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging software</td></tr></tbody></table>

analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning

Per comprendere organogenesi, le alterazioni spaziali e temporali che si verificano durante lo sviluppo dei tessuti devono essere registrati. Il metodo descritto qui permette l&#39;analisi time-lapse di sviluppo normale e compromessa rene in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione attrezzata per l&#39;illuminazione strutturata e acquisizione z-stack. Per visualizzare nefrogenesi, zebrafish transgenico (Tg (wt1b: GFP)) strutture del rene con fluorescente sono stati utilizzati. Difetti renali sono stati innescati da iniezione di un oligonucleotide antisenso morfolino contro il Wilms gene del tumore wt1a, un fattore noto per essere cruciale per lo sviluppo del rene. Il vantaggio del setup sperimentale è la combinazione di un microscopio dello zoom con strategie semplici per i movimenti ri-regolazione in direzione X, Y o Z senza apparecchiature aggiuntive. Per aggirare drift focale che è indotto da variazioni di temperatura e vibrazioni meccaniche, Una strategia autofocus stata applicata invece di utilizzare una camera ambientale normalmente richiesta. Al fine di ri-regolare i cambiamenti di posizione a causa di una xy-drift, sono state impiegate le camere di imaging con griglie di trasferimento impressa. In confronto a configurazioni più complesse per la registrazione time-lapse con sezionamento ottico come la scansione laser confocale o microscopi foglio di luce, un microscopio zoom è facile da maneggiare. Inoltre, offre dissezione benefici specifici del microscopio come l&#39;elevata profondità di campo e una distanza di lavoro prolungato. Il metodo per studiare organogenesi qui presentata può essere utilizzato anche con microscopi a fluorescenza stereo non in grado di sezionamento ottico. Anche se limitata per high-throughput, questa tecnica offre un&#39;alternativa ai mezzi più complessa che viene normalmente utilizzato per la registrazione time-lapse di tessuti in via di sviluppo e le dinamiche di organi.

Time-lapse microscopia è una tecnica potente per guardare processi biologici dinamici per un periodo di tempo più lungo. Un problema spesso si verificano durante time-lapse imaging è un movimento in direzione x, y oppure z, chiamato deriva, che è indotto dalle variazioni di temperatura e vibrazioni meccaniche. Il metodo presentato qui permette la registrazione di strutture fluorescente negli embrioni di zebrafish o larve su un microscopio da dissezione, senza camera ambientale e tavolo antivibrazione time-lapse. Per la compensazione di xy-drift, il campione è stato incorporato in una camera di imaging con una griglia trasferimento impresso (Figura 1). La posizione di un punto particolare della griglia relative al puntatore del software è stato utilizzato per restituire l&#39;esemplare alla posizione di pre-regolato (Figura 2A). I risultati presentati sono stati ottenuti utilizzando un microscopio zoomcon un cursore integrato per sezionamento ottico con illuminazione strutturata (Figura 2B). Per la correzione focale continua, è stata istituita una strategia di messa a fuoco automatica. In questa strategia, la messa a fuoco automatica software viene utilizzato per trovare la messa a fuoco sulla base di massimo contrasto prima di ogni punto di tempo. Questo piano focale così definito viene successivamente impostato come piano di centro per l&#39;acquisizione z-stack. Per minimizzare fototossicità nel campione, il canale in campo chiaro luce trasmessa viene utilizzato come canale di riferimento in quanto consente tempi di esposizione sufficientemente brevi durante la fase di messa a fuoco automatica (Figura 2C). Il metodo è stato applicato per l&#39;analisi comparativa di sviluppo del rene negli embrioni morphant controllori e wt1a di una linea di zebrafish transgenico (Tg (wt1b: GFP)). Durante nefrogenesi all&#39;inizio di questa linea mostra fluorescenza verde nel mesoderma intermedio, sono stati i progenitori renali derivano da 9,10 e più tardinei tubuli Formatura e nephron primordi (Figura 3). Time-lapse registrazione delle immagini rivela che nefrogenesi nel controllo morpholino iniettato embrioni è inalterato rispetto a quelli uninjected (risultati non mostrati) e segue la procedura descritta di sviluppo iniziale del rene zebrafish 3. Al 20 HPF i tubuli in via di sviluppo pronephric sono visibili e alle loro punte anteriori, accumuli sferiche di cellule, che rappresentano la formazione nefrone primordi possono essere rilevati. Nel corso delle prossime ore, tubuli e primordi nefrone crescono e più tardi i primordi iniziano a fondere alla linea mediana (Figura 4, il video 2). Al contrario, nefrogenesi è gravemente perturbato negli embrioni wt1a morphant. Sebbene strutture tubolari GFP-positive sono visibili a 20 HPF, sembrano essere più diffusa e meno sviluppata. Inoltre, sono state formate non primordi nefrone corretto. La differenza più evidente a tsi controlla embrioni a questo punto di tempo, tuttavia, è la comparsa di un gran numero di cellule fluorescenti fuori delle pronephros sviluppo (Figura 4, video 2). Successivamente, queste cellule lasciano il campo pronephric e migrano ventrale (video 2). Lo sviluppo del rene negli embrioni di controllo e morphants wt1a della linea transgenica wt1b essere stata precedentemente rispetto prendendo immagini in diversi momenti fisso 9,10. In contrasto con questo metodo statico, la registrazione time-lapse consente di seguire la dinamica di nefrogenesi normale e misrouting di cellule progenitrici renali causati dalla deplezione wt1a. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig1.jpg" /> Figura 1: Schema Illustrazione di un embrione integrati in una camera reperibile in commercio con Relocation griglie. Il piatto haquattro griglie, ognuna suddivisa in una distanza di ripetizione di 50 micron, impresso in un fondo di vetro coprioggetto. L&#39;embrione per essere ripreso è incorporato a testa in giù, con la struttura del rene in prossimità di una piazza di osservazione, ma senza sovrapposizione con la rete. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig2.jpg" /> Figura 2:. Rettifiche per di compensazione della deriva in Time-lapse imaging e Grid Proiezione di illuminazione strutturata una posizione distinta della griglia di delocalizzazione è stato portato al centro dell&#39;immagine (contrassegnate da mirino gialle) e serve come punto di riferimento per la successiva XY-allineamento in caso di piccoli spostamenti. Il rettangolo rosso rappresenta la regione di interesse (ROI) utilizzato nella strategia autofocus (A). wa sezionamento otticoS ottenuto dall&#39;illuminazione strutturato. L&#39;immagine mostra una struttura a griglia proiettata nel piano focale dopo corretto calibrazione (B). Il ROI per la strategia messa a fuoco automatica (rettangolo rosso) è impostato per coprire le strutture embrionali distintivi ad alto contenuto di contrasto (qui somiti) che permettono messa a fuoco automatica affidabile nella struttura di interesse (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig3.jpg" /> Figura 3: transgenico wt1b:. GFP embrioni con Green fluorescenza nel rene di sviluppo Sovrapposizioni di dorsale (A) o trasmissione laterale (B) e immagini di fluorescenza sono mostrati con anteriore a sinistra. np, nefrone primordium; pt, tubulo pronephric; così cosìacari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig4.jpg" /> Figura 4: Knockdown di wt1a provoca l&#39;interruzione dello sviluppo embrionale del rene Rappresentante, la profondità estesa di immagini messa a fuoco da registrazioni time-lapse.. Nel controllo morpholino embrioni iniettati, lo sviluppo del rene mostra il progresso normale con tubuli in crescita e nefrone primordi che iniziano a fondere sulla linea mediana. Al contrario, morphants wt1a non riescono a formare una corretta primordi nefrone e una massiccia quantità di cellule GFP positive sono al di fuori del campo pronephric. (np, nefrone primordio, pt, tubulo pronephric). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa fi</a>figura. <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/co-MO.mov" target="_blank">Supplemental Video 1. registrazione Time-lapse di sviluppo renale normale controllo morpholino embrioni iniettati. (Clic destro per il download).</a> Il video mostra come tubuli crescono e primordi nefrone cominciano a fondersi. A partire da 20 HPF, immagini sono state prese in intervalli di 30 min per un periodo di 5 ore. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/wt1a-MO.mov" target="_blank">Supplemental Video registrazione 2. Time-lapse di nefrogenesi disturbato negli embrioni wt1a morphant. (Clic destro per il download).</a> Il video mostra la migrazione di cellule GFP-positive dalla regione pronephric. A partire da 20 HPF, le immagini sono state scattate in 30 min intervalli per un periodo di 5 ore.

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Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Il metodo descritto qui permette l&#39;analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute (FLI).  Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare. 

Video: Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all&#39;Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Un possibile modello Zebrafish della malattia del rene policistico: Knockdown di<em&gt; Wnt5a</em&gt; Provoca cisti in Zebrafish Reni

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Medicina

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

Visualizzazione della morfogenesi oculare mediante microscopia Lightsheet utilizzando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologia

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

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