TLW stato supportato da una Marie Curie internazionale Incoming Fellowship. Questo lavoro è stato finanziato anche dal finanziamento istituzionale di base, Bundesministerium für Bildung e Forschung (BMBF) finanziamento e in parte con il sostegno prioritario Research Program (SFB) 655 a Gk. Gli autori desiderano ringraziare Anne Karasinsky per la cura e la manutenzione di tutti gli animali utilizzati in questo studio e Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Boehme, e Richard Wetzel per la coltura cellulare e assistenza microscopia.

1. Impostazioni di base e preparazione della Cultura Media <ol><li> Almeno due giorni prima di iniziare l&#39;esperimento, preparare Poly-D-lisina (PDL) / laminina rivestito piastre per colture monostrato aderenti. Per preparare pozzetti / boccette voglio abbastanza PDL (10 mg / ml in dH 2 O) per rivestire la superficie e incubare una notte a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione dal piatto e lavare il piatto tre volte con dH 2 O. Lasciare asciugare all&#39;aria. Aggiungere laminina (5 mg / ml in DMEM freddo: F12) e incubare a 37 ° C per una notte. Rimuovere la laminina e utilizzare le piastre immediatamente o conservare con la laminina a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Preparare fuoco pipette lucido con &quot;medium&quot; e &quot;piccoli&quot; fori da pipette Pasteur in vetro rotante in una fiamma finché i bordi si arrotondano. Autoclave per sterilizzare. </li><li> Il giorno della dissezione, preparare la giusta quantità di terreno di coltura miscelando Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml di eparina, 50 unità / ml di penicillina / streptomicina, 20 ng / ml purificato topo fattore di crescita epidermico-grade (EGF), e 20 ng / ml di fattore di crescita dei fibroblasti ricombinante bovina (FGF-2). Riscaldare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Per la dissociazione SVZ, preparare 0,05% tripsina-EDTA e 0,125 mg / ml inibitore della tripsina contenente 0,01 mg / ml DNaseI. Equilibrare queste soluzioni a 37 ° C. </li><li> Impostare un microscopio dissezione e preparare gli strumenti necessari per rimuovere il cervello (forbici e piccola spatola) e SVZ e DG dissezioni (bisturi, 27 ago G attaccato alla siringa da 1 ml, 1 x # 7 pinze, 1 x # 5/45 forcipe) per immersione in etanolo al 70%. </li></ol> 2. La raccolta dei cervelli di topo adulto e SVZ / DG Microdissections <ol><li> Anestetizzare (8 settimane di età) topi adulti non sposati secondo le linee guida istituzionali appropriati. Eseguire dislocazione cervicale. </li><li> Spruzzare la testa con etanolo al 70% per sterilizzare l&#39;area e di minimizzare la quantità di pelo che undHères le forbici e il cervello. Utilizzando forbici affilate decapitano l&#39;animale alla base del tronco cerebrale. </li><li> Tenendo la testa alla base del cranio, tagliare il cranio tra le due bulbi olfattivi mettendo una lama di un piccolo paio di forbici in ciascuna cavità occhio e taglio coronale. Quindi, fare due tagli laterali alla base del cranio, seguito da un taglio longitudinale attraverso il cranio lungo la sutura sagittale Attenzione:. Garantiscano l&#39;angolo delle forbici è profonda possibile per evitare di danneggiare il cervello sottostante. </li><li> Esporre il cervello peeling indietro il cranio sia con la lama delle forbici o un paio di pinze curve. Liberare il cervello dal cranio con una piccola spatola e il luogo in PBS freddo. </li><li> Risciacquare cervelli con PBS per rimuovere il sangue e la pelliccia. </li><li> Trasferire cervello per una piastra di Petri 10 centimetri di plastica contenente PBS </li><li> Porre capsula di Petri contenente il cervello sotto un microscopio da dissezione a basso ingrandimento e posizionare il brain sulla sua superficie ventrale. Utilizzando pinze curve sottili togliere i bulbi olfattivi mentre si tiene il cervello in posizione dal cervelletto. </li><li> Ruotare il cervello sul dorso e con un bisturi fare un taglio coronale attraverso il cervello a livello del chiasma ottico </li><li> Per microdissect SVZ (per informazioni più dettagliate, si veda anche Azari et al. 10), posizionare la porzione rostrale del cervello in modo che la superficie coronale tagliata rivolta verso l&#39;alto e mettere a fuoco il microscopio su un ingrandimento maggiore. Rimuovere e gettare il setto con pinze curve sottili. </li><li> Sezionare il SVZ (il sottile strato di tessuto circostante ventricolo) posizionando immediatamente la punta di una lama di una coppia di pinze curve sottili nell&#39;angolo laterale del ventricolo laterale immediatamente sotto il corpo calloso e le altre di circa 1 mm nel tessuto adiacente al ventricolo. Premere la pinza verso la base del piatto e verso l&#39;aspetto ventrale del VentRicolo per rimuovere un piccolo pezzo triangolare di tessuto. Posizionare la SVZ sezionato in una capsula di Petri sul ghiaccio. </li><li> Per microdissect DG (per informazioni più dettagliate, si veda anche Hagihara et al. 11), posizionare la porzione caudale del cervello nella scatola di Petri e tagliare lungo la fessura longitudinale con un bisturi. </li><li> Sotto un microscopio dissezione, rimuovere il cervelletto e il diencefalo con pinze. </li><li> Ridefinire il microscopio in modo che i bordi intorno DG sono ora visibili. Per rimuovere il giro dentato, inserire la punta di un ago 27 G e scorrono lungo il confine tra la DG e corno di Ammon. Utilizzando le belle pinze, liberare il DG dal tessuto circostante. </li></ol> 3. SVZ Tissue Dissociazione <ol><li> Tritare il tessuto con una lama da bisturi per circa 1 minuto fino a quando non rimangono pezzi di grandi dimensioni. </li><li> Trasferire il tessuto tritato in una provetta da 15 ml usando 1 ml di preriscaldata 0,05% tripsina-EDTA e incubare per 7 min inbagnomaria a 37 ° C. </li><li> Per fermare la reazione enzimatica, aggiungere 1 ml di inibitore della tripsina contenenti DNaseI e mescolare il contenuto muovendo il tubo. </li><li> Pellet la sospensione per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti e scartare il surnatante </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di mezzo di crescita e di dissociare pipettando gentilmente su e giù per circa 7-10x con una pipetta P1000. Attenzione: nel corso di triturazione può portare ad un aumento della morte cellulare e avrà un impatto negativo sulla crescita delle cellule successive. </li><li> Aggiungere mezzo di crescita per un volume totale di 5 ml e passare la sospensione cellulare attraverso un setaccio da 40 mm a rimuovere i detriti e grumi di tessuto indissociate. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet con conseguente 200 ml mezzo di crescita. </li></ol> 4. DG Tissue Dissociazione <ol><li> Tritare il tessuto con una lama da bisturi per circa 1 minuto fino a quando non pezzi di grandi dimensioni rimangono e trasferimentoin preriscaldata PDD enzima papaina mix (2,5 U / ml, dispasi 1 U / ml, DNaseI 250 U / ml). Incubare per 20 min a 37 ° C, mescolando per inversione ogni 3-5 minuti. </li><li> Dissociare il tessuto meccanicamente con un foro medio, fuoco lucido, pipetta Pasteur pipettando su e giù delicatamente 10x. </li><li> Incubare per altri 10 min a 37 ° C, mescolando per inversione ogni 3-5 minuti. </li><li> Ulteriori dissociare il tessuto meccanicamente con un piccolo foro, incendio lucidato pipetta Pasteur pipettando su e giù delicatamente 10x. </li><li> Centrifugare a 130 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di soluzione tampone (1x HBSS, glucosio 30 mM, 2 HEPES mM (pH 7.4), 26 NaHCO mm 3). Portare a 10 ml con soluzione tampone. </li><li> Centrifugare a 130 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di 20% Percoll. (Per preparare Percoll 90%, aggiungere 4,5 ml di 100% Percoll a 0,5 ml di PBS 10x diluire ulteriormente questo al 20%aggiungendo 1,1 ml di Percoll 90% a 3,9 ml 1x PBS). </li><li> Centrifugare a 450 xg per 15 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di tampone. </li><li> Centrifugare a 130 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet in 200 microlitri mezzo di crescita. </li></ol> 5. Generazione di culture Aderente monostrato <ol><li> Piatto SVZ dissociato o DG tessuto in un unico PDL / laminina rivestito pozzetto di una piastra a 96 pozzetti ed incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Circa 24 ore dopo la placcatura, una volta che le cellule hanno aderito alla superficie rivestita, scambiare il mezzo di crescita per rimuovere ulteriori detriti in eccesso. </li><li> Ogni successivi 3-4 giorni, scambio metà del terreno di coltura con terreno fresco per reintegrare i fattori di crescita. </li><li> Ripetere finché le cellule raggiungono circa l&#39;80% di confluenza e sono pronti per essere diversi passaggi. Nota: il tempo tra la placcatura e il primo passaggio può richiedere fino a 2-3 settimane. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. Passaging delle Culture Aderente monostrato <ol><li> Quando le colture raggiungono circa l&#39;80% di confluenza rimuovere il mezzo dal pozzo e lavare con PBS. Nota: Non permettere alle cellule di superare il 90% di confluenza in quanto questo può portare al distacco delle cellule e la formazione di neurosfere e, inoltre, un aumento dei livelli di morte cellulare. </li><li> Aggiungere 50 ml Accutase e incubare a 37 ° C per 2-3 minuti (controllare per vedere se le cellule sono arrotondate e distaccato). </li><li> Rimuovere le cellule in una provetta da 15 ml e lavare il bene una volta con PBS e trasferimento al tubo stesso. </li><li> Diluire le cellule a 5 ml con PBS e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> Per il primo passaggio, diluire cellule per 1 ml e piastra in un PDL / laminina rivestite pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. </li><li> Per passaggi successivi, risospendere le cellule in 200 ml di mezzo di crescita e conteggio con un emocitometro. Piastra a 1 x 10 4 cellule / cm 2 nel pozzetto rivestito dimensioni appropriate o matraccio. </l<html> i&gt; </ol> 7. Differenziazione delle Culture Aderente monostrato <ol><li> Per differenziare le colture monostrato aderenti, cellule piastra proliferanti su vetrini rivestiti PDL / laminina ad una densità di 1 x 10 4 cellule / cm 2 in terreno di coltura contenente 20 ng / ml EGF e 10 ng / ml bFGF. </li><li> Quando le cellule raggiungono circa il 80% di confluenza (solitamente 2 giorni), sostituire il mezzo di crescita su terreno contenente 5 ng / ml bFGF e 0 ng / ml EGF. </li><li> A seguito di 2 giorni in 5 ng / ml bFGF, sostituire il mezzo con mezzo di coltura in assenza di entrambi i mitogeni per altri 3 giorni Nota:. Durante questo periodo si verifica una notevole quantità di cellule morte. </li><li> Dopo un totale di 5 giorni, lavare le cellule differenziate con PBS per rimuovere eventuali cellule morte poi fissare con 4% paraformaldeide (PFA) per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare nuovamente con PBS per rimuovere eventuali vetrini PFA e conservare in pozzi in 1 ml di PBS a 4 ° C. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 8. neurosfere Cultura e quantificazione <ol><li> Diluire il SVZ dissociato o DG tessuto da un animale in 20 ml di terreno di coltura e piastra 200 ml / pozzetto in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un multidoser pipetta 10 ml. </li><li> Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 6-7 giorni per neurosfere SVZ-derivati ​​e 10-12 giorni per neurosfere DG-derivati. Nota: crescita per più di questi tempi di incubazione raccomandati comporterà crescita eccessiva e porterà alla morte delle cellule al centro delle neurosfere e / o, attacco spontaneo e differenziazione. </li><li> Contare e misurare il diametro delle neurosfere usando un reticolo oculare montato su un microscopio ottico verticale </li></ol> 9. Passaging le Neurosfere Dopo le neurosfere primarie sono stati contati e la loro dimensione registrate possono essere espanse su diversi passaggi che iniziano con un singolo neurosfere o di una cultura di massa. <ol><li> Bulk espansione cultura neurosfere <ol><li> Per passaggio neurosfere combinati come una cultura di massa, rimuovere il terreno contenente le neurosfere dalla piastra, trasferire in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere le neurosfere in 1 ml di preriscaldata 0,05% tripsina-EDTA e incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Aggiungere un uguale volume di inibitore della tripsina contenente DNaseI e mescolare bene. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 300 xg, rimuovere il supernatante e aggiungere 1 ml di terreno di coltura. </li><li> Triturare su e giù circa 10x con una pipetta P1000 dissociare le neurosfere. </li><li> Rimuovere 10 ml della sospensione di cellule e mescolare con un volume uguale di blu tripano ed eseguire un conteggio di cellule in vivo con un emocitometro. </li><li> Reinizializzare le cellule ad una densità di 1 x 10 4 cellule / cm 2 in coltura appropriato cella dimensioni pozzetto o bottiglia. </li><li> Incubare a 37 ° Ccon il 5% di CO 2 fino a forma neurosfere secondarie. </li></ol></li><li> Espansione neurosfere singolo <ol><li> Per il passaggio singoli neurosfere scegliete pozzetti che contengono un singolo neurosfere e rimuovere con attenzione e scartare circa 160 ml di terreno di coltura di ogni bene senza disturbare il neurosfere. </li><li> Aggiungere 100 ml di 0,05% tripsina-EDTA a ciascun pozzetto per essere diversi passaggi e incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di inibitore della tripsina contenente DNAseI per arrestare la reazione. </li><li> Triturare circa 10 volte su e giù con una pipetta P200 di spezzare il neurosfere. </li><li> Trasferire 200 ml contenenti il ​​neurosfere dissociato in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo di crescita. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 fino a forma neurosfere secondarie. Nota: per determinare il potenziale a lungo termine, una delle proprietà cardinali di un vero s neuralecellula TEM, neurosfere dovrebbe essere diversi passaggi per almeno 5-10 passaggi. Vedere anche la letteratura sulla parte nella controversa interpretazione dei risultati 12-14. </li></ol></li></ol> 10. Differenziazione delle Culture neurosfere Neurosfere primarie o diversi passaggi possono essere differenziati per determinare multipotenzialità. <ol><li> Rimuovere neurosfere in sospensione dalla loro piastra di coltura o di pallone e trasferirli su una piastra di Petri 10 centimetri di plastica. </li><li> Sotto un microscopio dissezione rimuovere circa 15-20 neurosfere dal mezzo con una pipetta P20 e trasferire ad una piastra a 24 pozzetti contenenti il ​​terreno di coltura senza fattori di crescita e un vetrino rivestito PDL / laminina. </li><li> Differenziare per circa 7 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Lavare le neurosfere differenziati con PBS per rimuovere tutte le cellule morte poi fissare con PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare nuovamente con PBS per rTogliete eventuali coprioggetto PFA e conservare in pozzi in 1 ml di PBS a 4 ° C </li></ol> 11. Immunostaining di neurosfere e culture aderenti Nota: Per la colorazione con l&#39;anticorpo O4 omettere il Triton dai gradini di blocco e di colorazione e ricordarsi di utilizzare un anticorpo secondario IgM appropriato. <ol><li> Incubare i vetrini contenenti i neurosfere dissociati o colture monostrato aderenti in soluzione (10% siero normale Donkey in PBS contenente 0,2% Triton X-100) di blocco per 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Incubare in soluzione bloccante fresco contenente primario bIII-tubulina, Map2a + b, gliale fibrillare proteina acida (GFAP) o anticorpi O4 per 60min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3x con PBS. </li><li> Incubare in soluzione bloccante fresco contenente appropriati anticorpi secondari coniugati fluorescenza e 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1/5.000) per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li&gt; lavare tre volte con PBS. </li><li> Montare i coprioggetti su vetrini da microscopio utilizzando il montaggio fluorescenza medie e aria secca nella notte scura </li><li> Vista e immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l&#39;avvio di culture precursori neurali, sia monostrati come aderenti e neurosfere, dalle due grandi regioni neurogena del cervello di topo adulto. Ci sono una serie di punti importanti che devono essere tenuti a mente quando si cerca uno di questi sistemi di coltura in vitro in. In primo luogo, la scelta del metodo di dissociazione è molto importante ed è tessuto dipendente. Nelle nostre mani, 0,05% tripsina-EDTA è molto efficace per la dissociazione di tessuto SVZ, e si traduce in un maggior numero di neurosfere rispetto a quando si utilizza una tecnica basata dissociazione papaina. Per la dissociazione della DG tessuto tuttavia, si consiglia vivamente un approccio dissociazione a base di papaina. Quando si confrontano direttamente i due metodi di dissociazione di DG tessuto, abbiamo osservato un rendimento significativamente inferiore di cellule vitali e circa 10 volte meno neurosfere quando si utilizza tripsina. Questa differenza di dissociazione potrebbe essere dovuto alla differenza di COMPOSIZIO tessuton tra le due regioni. Il tessuto compatta della DG è circondato da un ampio neuropil e può verificarsi danni estesi di processi cellulari durante la dissociazione. Un secondo punto importante da notare è che, mentre il saggio neurosfere può essere utile per rendere dichiarazioni quantitativi sul numero di cellule presenti in un dato campione di tessuto precursori, cautela deve tuttavia essere impiegato nell&#39;interpretazione di questi numeri assoluti. Fusione di neurosfere può essere un importante fattore confondente. Diversi studi hanno dimostrato che i neuroni sono molto mobili e possono fondere, anche in quelle che sono presumibilmente condizioni &quot;cloni&quot; 7,19. La frequenza neurosfere risultante può essere molto dipendente da fattori tra i componenti del mezzo, la procedura di dissezione e il processo di dissociazione. Anche tra i gestori esperti qualche variazione nel numero di neurosfere generati da campioni apparentemente identici è evidente (si veda la Figura 1A.) Più utile, è un confronto diretto della frequenza precursore tra due campioni indicati (cioè il controllo vs trattata o wild-type vs knock-out) gestite dalla stessa persona in un unico esperimento, piuttosto che una dichiarazione quantitativa del totale numero di cellule precursore. Nel decidere quale dei due metodi di coltura è più adatto per un particolare esperimento è importante notare che questi due sistemi di coltura differenziano l&#39;omogeneità dei tipi cellulari generati. Rispetto al proliferare colture cellulari aderenti, che mostrano un pool di cellule precursore abbastanza omogenea (~ 98% delle cellule sono Sox2 +) 20, neurosfere sono più eterogenei e contengono, nonché proliferanti cellule precursori, neuroni differenziati e astrociti 21,22. È importante che le neurosfere non sono coltivate per prolungati periodi tra i passi come maggiore è la neurosfere diventare il più probabile è di trovare tipi di cellule differenziate nel loro nucleo. Abbiamo tradizionalmente Avviamo aderenti monostrato neurali culture precursori della DG tessuto tra 5-8 topi. Pertanto, quando si tenta di stabilire le colture monostrato aderenti dalla DG o SVZ di un singolo mouse, la massima cura deve essere presa durante la procedura di dissociazione dei tessuti al fine di evitare un&#39;eccessiva morte cellulare causata da sopra triturazione del tessuto, o prendendo esteso periodi di tempo tra la dissezione e gradini in coltura finali. Questo protocollo descrive, per la prima volta, la generazione di colture monostrato precursori aderenti sia dalla SVZ e DG di singoli animali. Ci sono molti casi in cui il confronto della proliferazione e differenziazione precursore deve essere effettuato su base singolo animale. Queste includono la possibilità di confrontare direttamente il DG e SVZ di animali individuali basati sulle statistiche appaiati e per associare i dati di cultura con i singoli dati comportamentali e fisiologici 9. Culture di origine animale singole anche albasso l&#39;uso di animali rari transgenici, in cui non è possibile in età corrispondente a un pool di 5-8 donatori per la cultura, così come gli animali unici (ad esempio croci F2 o animali allevati fuori) per studi di associazione genetica.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.
Protocol section 1.1 was changed from:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
to:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 &#181;g/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 &#181;g/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
Protocol section 1.3 was changed from:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 &#181;g/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
to:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
Protocol section 3.6 was changed from:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
to:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 &#181;m sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
Protocol section 3.7 was changed from:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.
to:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 &#181;l growth medium.
Protocol section 6.2 was changed from:
Add 50 ml Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
to:
Add 50 &#181;l Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
Protocol section 6.6 was changed from:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
to:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 &#181;l growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
Protocol section 8.1 was changed from:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
to:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 &#181;l/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
Protocol section 9.1.6 was changed from:
Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
to:
Remove 10 &#181;l of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
Protocol section 9.2.2 was changed from:
Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
to:
Add 100 &#181;l of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
Protocol section 9.2.5 was changed from:
Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
to:
Transfer the 200 &#181;l containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
Figure 1 description was updated from:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.
to:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 &#181;m.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does the Figure 1 description in Results.

Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Il test neurosfere 1,2 e la cultura monostrato aderente 3,4, entrambi sviluppati nei primi anni 1990, rimangono ancora il gold standard in vitro di cellule staminali neurali. In questi saggi, il tessuto primario è micro sezionato da una particolare regione del cervello, dissociato in una sospensione di cellule singole e coltivate in presenza del fattore mitogeni crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF2) per formare sia liberamente fluttuante cluster (neurosfere) o monostrati aderenti. Entrambi i sistemi hanno una serie di vantaggi e svantaggi e attenta deve considerare la questione che deve essere affrontata prima viene scelto uno o l&#39;altro sistema. Neurosfere consentono una semplice lettura di differenze nel numero di cellule precursori e le potenzialità. Inoltre, neurosfere sono anche uno strumento utile per studiare specifica intrinseca delle cellule ritirati dalle loro ambiente esterno normale. Extrinspunti sic possono essere studiate semplicemente aggiungendo il fattore di interesse al mezzo di crescita e quantificare il numero e la dimensione delle neurosfere generati. Il principale inconveniente di neurosfere tuttavia, è che essi formano la propria nicchia, alle cellule al centro delle neurosfere (particolarmente grandi neurosfere) essendo più differenziato rispetto a quelli sulla superficie 5. Neurosfere contengono una miscela di cellule staminali, progenitori commessi, e le cellule differenziate e le interazioni cellula-cellula all&#39;interno delle neurosfere contrastare il mantenimento delle cellule staminali. Questo è il motivo neurospheres contengono solo un piccolo numero di cellule staminali vere 6-8. Colture monostrato aderenti forniscono anche un buon sistema in vitro per modellare nella proliferazione vivo. Colture aderenti, in cui le cellule rimangono più isolato ed omogeneo, in grado di eliminare l&#39;eterogeneità del neurosfere. In queste condizioni di crescita delle cellule precursori proliferano rapiRIT E quasi tutte le cellule si dividono ed esprimono le caratteristiche marcatori precursori neurali Nestin, Sox2, e BLBP. Il principale svantaggio del sistema di coltura monostrato rispetto al saggio neurosfere è che i singoli cloni derivati ​​da precursori sono in grado di monitorare e quantificato. Un inconveniente di molti protocolli per entrambi i tipi di colture è stata la necessità di utilizzare un numero relativamente alto di animali, poiché il rendimento delle strategie di isolamento è stato spesso scarsa. Allo stesso tempo, è diventato chiaro che neurogenesi adulta contribuisce all&#39;individuazione del cervello 9, con la conseguente necessità di ex vivo di modelli individualizzati pure. Queste esigenze possono essere soddisfatte dai protocolli &quot;one-topo-one-cultura&quot;, come descritto nella presente relazione. Il seguente protocollo visivo descrive la generazione simultanea di culture precursori neurali sia dal SVZ e DG di singoli animali sia m come aderenteonolayers o come neurosfere. La generazione delle culture dei singoli animali è particolarmente utile quando è necessario il confronto tra gli animali trattati individualmente o varie transgenico individuali o topi wild-type. Questo protocollo include istruzioni dettagliate per la microdissezione simultanea delle regioni SVZ e DG di topi adulti, la loro dissociazione in una sospensione singola cella, coltura in vitro sia come colture monostrato aderenti o neurosfere e analisi di multipotenzialità e potenziale a lungo termine, i due cardinali proprietà di una cellula staminale fide dell&#39;osso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">laminin</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">glass pastuer pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Volac</td>
			<td style="width:119px;">BS5732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DMEM:F12 (1:1) 1X</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Neural Basal Medium (1X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">B27 supplements (50X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glutamax</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Heparain</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Penacillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">bFGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DNaseI</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Accutase</td>
			<td style="width:179px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Papain</td>
			<td style="width:179px;">Worthington</td>
			<td>LS003120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dispase</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Percoll</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HBSS (with Calcium &#38; Magnesium)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glucose</td>
			<td style="width:179px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K39347429847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1mL syringes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">27 Gauge needles</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scalpels (#22 disposable)</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BA222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont #7 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont 5/45 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scissors</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Iris spatula</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10093-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">flasks/well plates</td>
			<td style="width:179px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PFA (4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:179px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypan blue (0.4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NDS</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse monoclonal bIII-tubulin antibody</td>
			<td style="width:179px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">20334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">O4&#160;</td>
			<td style="width:179px;">R &#38; D systems</td>
			<td style="width:119px;">MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Map2a+b</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">donkey anti-mouse Cy3 antibody&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-505-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-rabbit Alexa488&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Dianova</td>
			<td style="width:119px;">711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Aqua Polymount</td>
			<td style="width:179px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:119px;">18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">10 ml Combi tips</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30089677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">plastic 10ml and 25mL serological pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4488/4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:179px;">Integra biosciences</td>
			<td style="width:119px;">521942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">multidoser pipette</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C waterbath</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C:5%Co2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice

Il saggio neurosfere e il sistema di coltura monostrato aderente sono strumenti utili per determinare il potenziale (proliferazione o differenziazione) di cellule staminali neurali adulte in vitro. Questi saggi possono essere utilizzati per confrontare il potenziale precursore di cellule isolate da animali geneticamente differenti o differenzialmente trattati per determinare gli effetti dei fattori esogeni sulla proliferazione cellulare precursore neurale e la differenziazione e per generare linee cellulari precursori neurali che possono essere dosati sopra continui passaggi. Il saggio neurosfere è tradizionalmente utilizzato per l&#39;identificazione post-hoc di cellule staminali, principalmente a causa della mancanza di marcatori definitivi con cui possono essere isolate dal tessuto primario e ha il grande vantaggio di fornire una rapida stima del numero di cellule precursore nel tessuto cerebrale derivati ​​da singoli animali. Colture monostrato aderenti, al contrario, non sono tradizionalmente utilizzati per confrontare proliferazione tra i singoli animali, Come ogni cultura è generalmente iniziata dal tessuto combinato di tra 5-8 animali. Tuttavia, essi hanno il grosso vantaggio che, a differenza neurosfere, sono costituiti da una popolazione prevalentemente omogenea di cellule precursori e sono utili per seguire il processo di differenziazione in cellule singole. Qui, descriviamo, in particolare, la generazione di colture di neurosfere e, per la prima volta, colture aderenti da singoli animali. Questo ha molte implicazioni importanti compresa l&#39;analisi abbinato della proliferazione e / o potenziale di differenziazione sia nella zona subventricolare (SVZ) e giro dentato (DG) delle linee topo trattato o geneticamente diversi, così come una riduzione significativa dell&#39;uso di animali.

Anche se le due regioni neurogenici del cervello di topo adulto entrambi contengono cellule precursori neurali, queste cellule possono comportarsi in modo diverso quando coltivate in vitro. Le colture monostrato aderenti generati da due regioni appaiono morfologicamente indistinguibili (Figura 1A), tuttavia, le colture aderenti SVZ-derivati ​​proliferano più velocemente e devono essere diversi passaggi, in media, 1-2 giorni prima di quelli derivati ​​dalla DG. Come neurosfere, le cellule precursori SVZ derivate anche proliferano velocemente e formare neurosfere più grandi (Figura 1B) rispetto alle cellule precursori DG-derivati ​​(Figura 1C). Mentre neurosfere SVZ-derivati ​​in genere vengono contati dopo 6-7 giorni di coltura, neurosfere DG-derivati ​​sono di solito quantificati dopo 10-12 giorni. Inoltre, un numero molto maggiore di cellule precursori neurali risiedono nella SVZ rispetto al DG, come dimostra la quasi 10 volte maggiore numero di neurosfere che possono essere generited da questa regione (SVZ: 1.173 ± 74,9 vs DG: 145.3 ± 26.4, p = &lt;0,0001; n = 10 animali per gruppo; Figura 2A). Studi hanno dimostrato che le cellule precursori entro la DG SVZ e rispondono a differenti stimoli. Le cellule precursori del DG sono attivati ​​da tipi specifici di apprendimento spaziale e stimoli come l&#39;arricchimento ambientale e l&#39;attività fisica, mentre le cellule precursori SVZ sono attivati ​​da apprendimento olfattivo e l&#39;arricchimento olfattivo. Coerentemente con questo, uno di noi (TLW) precedentemente dimostrato che la DG contiene una popolazione di cellule staminali latente e cellule progenitrici che può essere attivato da eccitazione neurale 15-18. Al contrario, abbiamo scoperto che le cellule precursori SVZ rispondono in modo diverso a questo stimolo, con una diminuzione del numero neurosfere in risposta a depolarizzazione livelli di KCl 17. Qui, abbiamo ripetuto questo esperimento, placcatura metà delle cellule isolate derivate dalla SVZ e DG di individual animali in depolarizzanti livelli di KCl e l&#39;altra metà in livelli KCl controllo. Abbiamo dimostrato, come in precedenza, che mentre le cellule precursori DG sono attivati ​​da depolarizzazione (101,2 ± 17,4 vs 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 animali), la proliferazione delle cellule SVZ-derivati ​​è infatti significativamente diminuita ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0.02, n = 5 animali; Figura 2B). Per confermare potenziale a lungo termine, una delle caratteristiche cardinali di una cellula staminale vero, singoli neurosfere o colture monostrato aderente deve essere in grado di espansione estesa cioè su almeno 10 passaggi. Ad ogni passaggio, dopo la preparazione di una cella singola sospensione, il numero di cellule viene contato e l&#39;espansione piega viene calcolato. Il totale ipotetica cella viene calcolato moltiplicando l&#39;espansione piega durante tale passaggio dalla totale teorico dal passaggio precedente. Questo è disp<html> posato come un grafico lineare con il numero di passaggio tramato contro il log10 del numero totale di cellule teorica (vedi esempio figura 3). Per confermare multipotenzialità, sia colture monostrato e le neurosfere possono essere differenziati con il ritiro mitogen e verranno mostrate dar luogo a entrambi i neuroni e glia (Figura 4). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1.jpg" /> . Adulti cellule precursori Figura 1 mouse possono essere coltivate in colture monostrato aderenti (A) o come neurosfere (B: SVZ, C: DG).. Bar scala è di 50 millimetri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> load/51225/51225fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Significativamente maggiore di neurosfere sono generati dalla SVZ rispetto al DG di singolo topi (A). Le cellule precursori SVZ e DG rispondono in modo diverso alla depolarizzazione in vitro (B). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3.jpg" /> Figura 3. Per confermare potenziamento a lungo termine, neurosfere sono espanse per oltre 10 passaggi. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4.jpg" /> Figura 4. Neurosfere possono essere differenziati in bIII-Tubulin + neuroni (A: rosso), GFAP + astrociti (A: verde), O4 + oligodendrociti (B: rosso) e Map2ab + neuroni (C: rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

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One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

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JoVE Journal

Neuroscience

37.2K Views.  Technische Universität Dresden.  Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti. 

Video: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neuroscienze

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

L&#39;isolamento e la coltura di cellule staminali neurali Crest di follicoli dei capelli umani

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...