Lo scopo di questo protocollo video è stabilire una fonte e un protocollo efficiente per l'isolamento e la cultura delle cellule staminali neurali del topo embrionale. Ciao, sono Maryam Sadeghi-Zadeh. Sono uno studente magistrale di Biologia Cellulare e Molecolare al Royan Institute.
Oggi io e il mio collega vogliamo mostrarvi come raccogliere cellule staminali neurali da 13 eminenza ganglionica a topo embrionale. Ciao, sono Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Sono uno studente magistrale di Biologia Cellulare e Molecolare presso il Dipartimento di Cellule Staminali del Royan Institute for Biotechnology.
Ciao, sono Reza Dehghani-Varnamkhasti. Inoltre sto studiando Biologia Cellulare e Molecolare al Royan Institute. Le procedure chirurgiche includono la raccolta di ogni 13 embrioni di topo dall'utero.
Taglio della parte anteriore della fontanella dell'embrione con una punta dell'ago piegata che estrae il cervello dal cranio. Micro-dissezione del cervello isolato per raccogliere l'eminenza ganglionica. Dissociazione del tessuto raccolto in un mezzo di cellule staminali neurali per ottenere una singola sospensione cellulare.
E infine, placcare le cellule in una coltura di sospensione per generare cellule nervose. Pulire e disinfettare la pelle dell'area dell'addome spruzzando con il 70% di etanolo. Controllare la pelle verso l'addome e quindi tagliare la pelle e il viso sottolineato con forbici per scoprire cavità addominale e corna uterina.
Rimuovere le corna uterine contenenti gli embrioni con le forbici e trasferirle in un tubo conico da 50 ml contenente tampone HEPES MEM freddo da 25 ml. Posizionare il tubo conico sotto la cappa di flusso laminare. Apri il cappuccio sotto il cofano.
Portare le corna uterine fuori dal tubo e risciacquare tre volte con abbastanza volume del tampone HEPES MEM freddo fresco per eliminare detriti e sangue. Trasferire il tessuto uterino in una piastra di petri da 10 cm contenente tampone HEPES MEM freddo da 7 a 10 ml. Aprire le corna uterine usando forbici fini e trasferire gli embrioni in un nuovo piatto contenente da 7 a 10 ml di tampone FREDDO HEPES MEM.
Ora metti il piatto da 10 cm con embrioni sotto il microscopio sezionato per il funzionamento della microsezione. Piegare la punta di un ago della siringa spingendo la punta su una maniglia della lama di bisturi in acciaio. Piegare la punta dell'ago fino a quando la punta non è piegata con un angolo da 70 a 90 gradi.
Controllare la punta dell'ago sotto il microscopio sezionato per vedere la piega sulla punta dell'ago. Naturalmente gli embrioni hanno una posizione laterale in questo. Senza cambiare la loro posizione, ha tenuto il collo e il corpo dell'embrione con pini fini e quindi inserire la parte piegata dell'ago in profondità nella parte anteriore della fontanella della testa dell'embrione.
Ci sarebbe un piccolo sanguinamento o un coagulo di sangue lì. Spostare la punta dell'ago superficialmente mentre la parte piegata si trova all'interno del rigonfiamento verso la fronte e quindi verso la parte posteriore della testa. Assicurati di tagliare la pelle e il cranio e di non danneggiare il cervello sottostante.
Spingere la pelle con la punta dell'ago lateralmente per scoprire il cervello. Inserire l'ago dal lato laterale della pelle al sotto il telaio dal lato laterale della pelle all'area sotto il cervello. E poi rimuovere il cervello da questo cuoio capelluto spingendolo a uscire dal cranio sezionato.
L'eminenza ganglionica è chiaramente mostrata in video con le sue parti mediali e laterali. Ha tenuto il cervello fermo usando le forceps di cura e quindi usando i microscissori per tagliare la corteccia di ogni emisfero per esporre l'eminenza ganglionica. Ha tenuto il cervello e ha posto l'eminenza ganglionica sezionata nel tubo di centrifuga da 15 ml contenente mezzi di cellule staminali neurali.
Ripetere questa procedura fino a quando tutto il cervello non è stato microsezionato. Tagliare l'eminenza ganglionica sezionata posizionando la punta della pipetta contro il fondo del tubo e pipettare la sospensione su e giù per 2 5 volte per rompere il tessuto per ottenere una sospensione a singola cella. Centrifugare la sospensione a 110 g per 5 minuti.
Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in 1 ml di tubo allo 0,05% in EDTA. Incubare la sospensione cellulare in 37 gradi Celsius per 10 minuti. E poi aggiungere un volume equivalente di inibitore della triptina di soia per fermare l'attività della tripsina.
Pipettare la sospensione cellulare su e giù per assicurarsi che la tripina sia stata completamente inattivata. Centrifugare la sospensione cellulare a 110 g per 5 minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in 1 ml di mezzo completo di cellule staminali neurali e contare il numero di cellule.
Placcare le cellule al mezzo delle cellule staminali neurali nel pallone di coltura tissutale di dimensioni adeguate. Trasferire 5 ml da 2T25, 20 ml a T75 e 40 ml a mastri T175. Le neurosfere appariranno dopo 3 giorni di coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5%CO2.
Per succhiare la coltura le neurosfere, trasferire il mezzo con neurosfere sospese alla centrifuga per centrifugare a 110 g per 5 minuti, quindi scartare il supernatante. A 1 ml di 0,05% di tripside EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi inattivare la tripina usando l'inibitore della tirpsina di soia e pipettare delicatamente le neurosfere su e giù per renderle singole cellule.
Centrifugare la sospensione cellulare a 110 g per 5 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 1 ml di mezzo di cellule staminali neurali. Queste celle sono pronte per la coltura o la coltura del prossimo passo su laminato e superficie completamente rivestita per esperimenti avanzati.
Coltivando un milione di cellule staminali neurali primarie dopo sette giorni il numero di cellule aumenterà fino a tre o quattro milioni. Dopo sei-sette giorni le sfere dovrebbero misurare tra i 150 e i 200 micrometri di diametro e saranno pronte per la sottocoltura su piatti rivestiti in poli ornitina in laminato in assenza di bFGF ed EGF per la differenziazione neuronale. I risultati del saggio di citometria a flusso mostrano che quasi il 95% delle cellule che costituiscono le neurosfere erano positive alla Nestina, che è un marcatore noto per le cellule staminali neurali.
I test che utilizzano anticorpi beta tubulina III e proteina fibrosa ganglio rivelano che coltivando cellule staminali neurali su superficie rivestita circa il 94% ha mostrato fenotipo neuronale e circa il 5% mostra fenotipo gliale. In questo breve video una tecnica di laboratorio per un rapido isolamento delle cellule staminali neurali da 13 eminenza ganglionica dell'embrione di topo. Spero che avrai successo nella tua cultura delle cellule staminali neurali.
