Gli autori riconoscono finanziamento dal NINDS / NIH, R00-NS064197 e NINDS / NIH, R01NS083897 (sia per DLS).

1. Preparazione dei supporti (figura 1, Punto 1) <ol><li> Fetta Cultura Media <ol><li> 25 ml di fetta di terreno di coltura è sufficiente per preparare piatti peggiori 5 in vetro con 2 fette per bene. </li><li> In una provetta da 50 ml, aggiungere 250 ml di una soluzione di N2 100x e 500 microlitri di una soluzione 50x B27 senza vitamina A. Aggiungere DMEM/F12 ad un volume di 22,5 ml. </li><li> Filtro sterilizzare soluzione e successivamente aggiungere 1,25 ml di siero di cavallo inattivato calore e 1,25 ml di siero fetale bovino. </li><li> Incubare soluzione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per tutta la durata della preparazione delle fette. </li><li> Aggiungere fattori di crescita (EGF, FGF e concentrazione finale di 10 ng / ml e 20 ng / ml, rispettivamente) immediatamente prima dell&#39;inizio della coltura. La composizione di questo mezzo è stato ottimizzato per promuovere la sopravvivenza delle cellule in coltura e per aumentare il tasso di proliferazione dei progenitori neurali. Ciò quindi massimizzare la probabilità diosservare cellule in mitosi nella fetta. </li></ol></li><li> HBSS completa dissezione Solution <ol><li> Preparare 500 ml di piena HBSS aggiungendo 50 ml di 10x HBSS, 1,25 ml di 1 M Hepes (pH 7.4, FC 2,5 mm), 6 ml di 2,5 M D-glucosio (FC 30 mm), 2,2 ml di 0,9 M NaHCO 3 (FC 4 mm) e autoclavato diH 2 O al volume finale di 500 ml. </li><li> Soluzione Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C fino alla raccolta delle corna uterine dal mouse incinta. Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per settimane. </li><li> Mantenere HBSS in ghiaccio durante l&#39;intera procedura di dissezione. </li></ol></li><li> Incorporare soluzione <ol><li> Per l&#39;inclusione di quattro cervelli embrionali, preparare 30 ml di 3% agarosio low melting nella soluzione completa HBSS. In una provetta da 50 ml conica, aggiungere 0,9 g di agarosio low melting e pieno HBSS a 30 ml. </li><li> Mescolare la soluzione con un vortex e fondere in un forno a microonde con il tubo in piedi e il tappo aperto. </li><li> Mentre nel microonde, monitorare la soluzione di pOverflow revent a causa di eccessiva ebollizione. Quando bolle si avvia, interrompere il forno a microonde e agitare la soluzione. </li><li> Ripetere queste operazioni fino a quando tutta l&#39;agarosio si è sciolto. </li><li> Conservare la provetta in un bagno d&#39;acqua a 42 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Dissezione degli embrioni (figura 1, punto 2) <ol><li> Dopo un&#39;attenta eutanasia del mouse in stato di gravidanza, raccogliere le corna uterine e trasferirli in un piatto di 10 centimetri 2 Petri contenente freddo pieno 1x HBSS. L&#39;età dell&#39;embrione può variare a seconda dello studio. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per la coltura di fette di cervello da giorni embrionali E12.5 a E17.5. A causa delle loro dimensioni, i cervelli più giovani tendono ad essere più difficile da lavorare. </li><li> Raccogliere gli embrioni e sezionare i cervelli embrionali come descritto precedentemente nel ratto e topo 26,27, fino ad ottenere un cervello embrionale completo compreso hindbrain e proencefalo con i due emisferi cerebrali. Questi possono essereconservato a temperatura ambiente finché non sono stati sezionati tutti i cervelli. </li><li> Raccogliere gli embrioni e sezionare i cervelli embrionali come descritto precedentemente nel ratto e topo 26,27, fino ad ottenere un cervello embrionale completo compreso hindbrain e proencefalo con i due emisferi cerebrali. Questi possono essere conservati a temperatura ambiente finché non sono stati sezionati tutti i cervelli. </li></ol> 3. Embedding dei cervelli embrionali (Figura 1, punto 3) <ol><li> In un recipiente contenente ghiaccio, creare un buco nel ghiaccio per inserire gli stampi incorporamento in. </li><li> Versare il terreno agarosio 3% in uno stampo di plastica e posizionare che stampo nel foro preparato nel ghiaccio. </li><li> Mescolare il mezzo agarosio con la punta di un termometro digitale finché la temperatura raggiunge i 35 ° C. </li><li> Prontamente trasferire il cervello nel mezzo di inclusione. </li><li> Punto Critico: Per rimuovere l&#39;eccesso HBSS all&#39;interfaccia tra il cervello e l&#39;agarosio, con cura e asciugare delicatamente / ruotare il cervello voltenella soluzione incasso con le pinze. </li><li> Un cuscino di agarosio gelificata formerà sul fondo dello stampo a contatto con il ghiaccio. Una volta che il cuscino può essere sentito con la punta della pinza agitando il cervello, posizionare il cervello con la dorsale verso l&#39;alto. Il cervello non dovrebbe sprofondare fino al fondo dello stampo. </li></ol> 4. Preparazione di agarosio Block (Figura 1, punto 4) <ol><li> Lasciate che il agarosio indurire nel ghiaccio per almeno 5 min. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, sezione angoli dello stampo. </li><li> Ritagliarsi cautela un blocco di agarosio intorno al cervello con una lama di rasoio. Cercare di ridurre al minimo il numero di tagli per evitare perturbando il cervello incorporato. </li><li> Assicurarsi che il blocco ha una superficie più ampia nella regione caudale del cervello (contro la regione rostrale, vedi Figura 1, punto 4) per aumentare la stabilità del blocco sul piedistallo sezionamento. </li><li> L&#39;ultimo taglio dovrebbe essere quello sul lato caudale del cervello;questo taglio definirà il piano di sezione corretta con il vibratome. </li><li> Farlo allineando la lama perpendicolare all&#39;asse rostro-caudale del cervello e il blocco di agarosio. Far scorrere verso il basso la lama caudalmente lungo l&#39;asse rostro-caudale e fare il taglio finale di circa 5 mm dalla regione più caudale del cervello. </li><li> Impostare il blocco di agarosio / cervello da parte e ripetere l&#39;incorporamento di altri cervelli. </li></ol> 5. Trasferimento dei cervelli incorporati nel vassoio della Vibratome (Figura 1, punto 5) <ol><li> Aggiungere una goccia di colla sul fondo del vassoio vibratome. Posizionare colla in modo che i blocchi di agarosio saranno posizionati all&#39;interno dell&#39;estensione della lama vibrante. </li><li> Posizionare il lato del blocco di agarosio / cervello caudale sul bordo della spatola, con circa il 50% del ribaltamento blocco oltre il bordo della spatola. </li><li> Applicare la faccia caudale del blocco di agarosio per la colla e far scorrere la spatola di distanza, mantenendo il blocco di agarosio al fondo del vassoio con la shoulder di un paio di pinzette. Non lasciate che la spatola contattare direttamente la colla. </li><li> Sia la colla solidificare a temperatura ambiente per 5 min. </li></ol> 6. Sezionamento del Brains embedded (Figura 1, punto 6) <ol><li> Riempire il vassoio vibratome con HBSS. </li><li> Definire le posizioni di partenza e di arrivo della lama vibratome. </li><li> Genera 200-250 micron fette. Con il vibratome VT1000S, utilizzare i seguenti parametri: velocità 2-4, frequenza 8. </li><li> Rimuovere con attenzione le fette dal vibratome quando vengono tagliate. Trasferire le fette con una spatola e il back-end di pinzette in 12 piatti e pieni di piena HBSS. In alternativa, alcuni ricercatori hanno usato un pennello al posto di pinzette Punto chiave:. Durante il trasferimento, fare attenzione che le fette di cervello rimangono attaccati al agarosio circostante. </li></ol> 7. Syto11 colorazione delle fette (Figura 1, punto 7) <ol><li> Diluire Syto11 ad una concentrazione finale di0,5-1 mM nel terreno di coltura fetta integrati con fattori di crescita. </li><li> Nel pozzetto di una piastra 12 pozzetti, incubare fette da un cervello in 2,5 ml di soluzione colorante per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare le fette in 2,5 ml di mezzo di coltura fetta senza macchiare soluzione per 20 min. </li></ol> 8. Montaggio fette in un piatto fondo di vetro (Figura 1, punti 8, 9) <ol><li> Preparare 15 ml di incorporamento soluzione di collagene per fetta. Preparare una soluzione di 1,5 mg / ml di collagene miscelando 375 ml di 3 mg / ml di soluzione di collagene di tipo I con 75 ml di DMEM 10x, 9,4 ml di NaOH 1 M, e 290 ml di H 2 O. Memorizzare sul ghiaccio. </li><li> Una goccia 15 ml della soluzione di collagene nella parte inferiore di un fondo 35 millimetri vetro micropozzetti piatto. Stendere con una punta di pipetta in base alle dimensioni della fetta. </li><li> Trasferire la fetta nella goccia di collagene con una spatola e un paio di pinzette Punto chiave:. Montaggio più sezioni in diversipiatti ORL aumenta la probabilità di acquisire fette adatti per l&#39;imaging. Schermo attraverso diverse sezioni e selezionare quelli che meglio soddisfano i criteri descritti di seguito nella sezione &quot;Rappresentante dei risultati&quot;. </li><li> Lasciate le fette incubare a temperatura ambiente per 10 min prima di trasferirli in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Dopo 20 minuti, aggiungere 1,2 ml di fetta di terreno di coltura nel fondo di vetro micropozzetti Dish. Aggiungere 600 pl di mezzo alla volta e stendere con un puntale. </li><li> Catturare un&#39;immagine basso ingrandimento della fetta cervello per registrare il livello anatomico e l&#39;integrità della fetta. </li></ol> 9. Imaging Live della Slices (Figura 1, i passaggi 10, 11) <ol><li> Lasciate le fette recuperare nell&#39;incubatrice per almeno 1 ora e 30 min a 37 ° C con 5% di CO 2 prima di imaging in tempo reale. </li><li> Immagine le fette con il microscopio della scelta, tenendo presente che Syto11 è molto incline a photobleaching. Qui un inverted disk spinning microscopio confocale viene utilizzato (Andor XD rivoluzione filatura microscopio confocale disco). In alternativa un microscopio confocale a scansione laser può essere usato. I seguenti parametri sono per il microscopio disco rotante set-up. </li><li> Durante l&#39;intera sessione di imaging in tempo reale, fette mantenere a 37 ° C, 5% CO 2 in una camera di incubazione umidificata collegata al microscopio. </li><li> Celle di immagine con un obiettivo 60X olio siliconico con una distanza di lavoro di 300 micron, e una apertura numerica di 1,3 (per esempio vedere figure 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Un obiettivo olio 100X con una distanza di lavoro di 130 micron e una apertura numerica di 1,4 (per esempio vedere Figura 4C) può anche essere usato. La risoluzione della fotocamera è di 512 x 512. </li><li> Fotografia le celle di un 30 um z-stack, con il centro della z-stack situata a circa 40 micron sotto la superficie della fetta. Cercando di immagine più in profondità nel tessuto può causare l&#39;obiettivo di aggiungerepressione meccanica sulla fetta. Ciò può compromettere l&#39;integrità della fetta cervello. Se si intende effettuare ricostruzioni 3D delle cellule, utilizzare un z-intervallo di non più di 2 pm. </li><li> Regolare la potenza del laser e tempi di esposizione per limitare photobleaching. Utilizzare tempi di esposizione che vanno da 30 a 200 msec, a seconda dell&#39;intensità del segnale Syto11. </li><li> Con un palco motorizzato, immagine più posizioni in più sezioni montate in 1 piatto. Ad esempio, l&#39;immagine fino a 20 posizioni sparse 4 fette differenti in 1 piatto unico. </li><li> Per l&#39;imaging in tempo reale, utilizzare una risoluzione temporale inferiore a 5 minuti per consentire l&#39;individuazione delle diverse fasi della mitosi. Utilizzando Syto11 e / o istone H2B-EGFP, 4-5 ore di immagini dal vivo sono sufficienti per osservare un numero significativo di cellule mitotiche. Tuttavia, se l&#39;imaging scarsamente etichettati cellule in mitosi (come quelli raggiunti da elettroporazione in utero), quindi un parametro di imaging più lungo (durante la notte) è appropriato e lavora noill. Nota: Usando questo protocollo, di solito osserviamo in media 10 cellule in mitosi per posizione. Come detto sopra, l&#39;imaging aerei montato fette aumenta la probabilità di avere un esperimento riuscito. Con questo approccio tipicamente identificare le cellule mitotiche in quasi tutti gli esperimenti eseguiti con Syto11 o istone H2B-EGFP. </li></ol> 10. Post-acquisizione Analisi della mitosi (figura 2) Tutte le procedure descritte in questa sezione sono stati ottimizzati in Fiji (ImageJ), che è vantaggioso perché si tratta di un software open source gratuito. Sono a disposizione per eseguire le stesse operazioni, ad esempio Metamorph, Imaris, e Amira altre soluzioni software. <ol><li> Identificazione dei Mitotic Figure in Fiji <ol><li> Dopo aver aperto il set di dati per una posizione di &quot;HyperStack&quot;, selezionare un piano z (vedere la Figura 2A per la posizione della barra di scorrimento) dove il tessuto e le cellule aspetto sano (vedi criteri nella sezione discussione).Scorrere attraverso la dimensione temporale per identificare le cellule che passano attraverso anaphase, in quanto è il più facile fase mitotico da identificare. </li><li> Scorrere indietro nel tempo per identificare il punto di tempo in cui la cellula entra mitosi (condensazione del DNA). La cella può muoversi attraverso z-aerei, ma la risoluzione temporale e parametri z-stack descritti in precedenza sono stati ottimizzati per attivare questo processo. </li><li> In un foglio di calcolo, registrare il 4D coordinate della cella nella HyperStack (X, Y, Z e tempo, vedere la Figura 2A per visualizzare la posizione di questi dati nell&#39;interfaccia Fiji), che entra mitosi. Conoscendo queste coordinate impedirà contare la stessa cella più volte. </li><li> Scorrere in avanti nel tempo e registrare il tempo quando la cella passa da una fase all&#39;altra. Documentare la durata di ciascuna fase mitotica per una data cella. </li><li> Procedere con altre cellule, attraverso l&#39;intero set di dati (più celle all&#39;interno e tra posizioni). </li></ol></li><li> 3D Ricostruireione delle cellule e quantitativa di rotazione durante la metafase (Adattato da Haydar et al, 2003) (Figura 2B). <ol><li> Dopo aver identificato più celle mitotiche, utilizzare le coordinate di una cella e scorrere in avanti nel tempo fino all&#39;inizio di metafase. </li><li> Ruotare l&#39;intero &quot;HyperStack&quot; in modo che il bordo ventricolare è planare (usando il &quot;Immagine / Trasforma / Ruota ...&quot; il comando). Utilizzare lo strumento &quot;angolo&quot; per determinare l&#39;angolo di applicare per questa rotazione. </li><li> Identificare il piano z dove la cella di interesse è più visibile. In quel piano, utilizzare lo strumento &quot;rettangolo di selezione&quot; per disegnare una selezione che comprende tutta la cella. </li><li> Identificare le z-piani che includono la cella di interesse. Utilizzare il comando &quot;Immagine / Duplica&quot; per creare un &quot;sub-stack&quot;. Nella finestra di dialogo, lasciare &quot;HyperStack Duplica&quot; selezionata. Il &quot;Slices (z)&quot; parametro corrisponde alle z piani, tra cui l&#39;intero cell, e le &quot;Frames (t)&quot; parametro corrisponde al punto di tempo corrente. </li><li> Se la risoluzione è scarsa, aumentare la dimensione della &quot;sub-stack&quot; utilizzando il &quot;Immagine / Regola / Taglia ...&quot; il comando. </li><li> Generare una ricostruzione in 3D della cella al punto di tempo corrente utilizzando il &quot;progetto Image/Stacks/3D ...&quot; il comando. I parametri per questo comando vengono visualizzati nella figura 2B. La &quot;spaziatura fetta&quot; corrisponde all&#39;intervallo tra ciascuna delle immagini piano z (micron). Importante: assicurarsi che la dimensione fisica (micron), del sub-stack è stato conservato. In caso contrario, l&#39;interpolazione dei pixel nella dimensione z sarà errato, e la ricostruzione 3D sarà imprecisa. </li><li> Utilizzando la barra di scorrimento, ruotare la conseguente ricostruzione 3D in modo che il bordo della piastra di metafase è visibile. Il numero di telaio corrisponde all&#39;angolo beta descritto in Figura 3B, registrare questo numero. Utilizzoil tool &quot;angolo&quot; e la &quot;Analyze / Measure ...&quot; il comando, misurare l&#39;angolo tra l&#39;orizzontale e una linea che attraversa il piatto di metafase perpendicolarmente (Figura 2B). Questo è l&#39;angolo alfa. </li><li> Registrare questi angoli per tutti i punti temporali metafase della cella di interesse. L&#39;angolo di rotazione tra i punti di tempo (t) e (t-1) è uguale al valore assoluto della differenza tra un angolo a (t) e tale angolo a (t-1). </li></ol></li><li> Misurare l&#39;orientamento della fenditura Piano <ol><li> 3D ricostruire una cella di interesse a un certo punto durante l&#39;anafase seguendo le istruzioni descritte per la ricostruzione 3D di piastre in metafase. </li><li> Ruotare la ricostruzione fino ai bordi delle due lastre formate dai cromosomi segreganti sono visibili. </li><li> Utilizzare lo strumento angolo per misurare l&#39;angolo tra l&#39;orizzontale (bordo ventricolare) e una linea parallela alle due piastre formate dai cromosomi segreganti. Questo è l&#39;angolo del piano di clivaggio (Figura 2C). </li></ol></li><li> Generazione di Film <ol><li> Come le cellule si muovono spesso in diversi Z-aerei, identificare i z piani occupati dalla cellula durante la sessione di imaging dal vivo. Generare una &quot;proiezione massima intensità&quot; di questi z-piani utilizzando il comando &quot;Immagine / Pile / Z progetto ...&quot;. Salvare lo stack risultante come file &quot;. TIF&quot;. </li><li> Aprire questo file nella versione 1.45 di ImageJ come Fiji non include un plugin stabile per la generazione di &quot;. Mov&quot; o file &quot;. Avi&quot;. </li><li> Usare il &quot;File / Salva con nome / ...&quot; il comando di ImageJ per generare un filmato in un formato compatibile con le applicazioni a valle. </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5rap2+exposes+the+centrosomal+root+of+microcephaly+syndromes.">Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes.</a> Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).</li><li>Bond, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+mechanism+involving+CDK5RAP2+and+CENPJ+controls+brain+size.">A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size.</a> Nat Genet. 37, 353-355 (2005).</li><li>Shu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doublecortin-like+kinase+controls+neurogenesis+by+regulating+mitotic+spindles+and+M+phase+progression.">Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression.</a> Neuron. 49, 25-39 (2006).</li><li>Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Interactions+between+Intermediate+Neurogenic+Progenitors+and+Radial+Glia+in+Embryonic+Mouse+Neocortex:+Potential+Role+in+Dll1-Notch+Signaling.">Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).</li><li>Hu, D. J. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+recruitment+to+nuclear+pores+activates+apical+nuclear+migration+and+mitotic+entry+in+brain+progenitor+cells.">Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells.</a> Cell. 154, 1300-1313 (2013).</li><li>Noctor, S. C., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).</li><li>Tyler, W. A., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genetic+Fate+Mapping+Reveals+a+Novel+Route+of+Neocortical+Neurogenesis,+Which+Is+Altered+in+the+Ts65Dn+Mouse+Model+of+Down+Syndrome.">Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).</li><li>Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Fluorescently+Labeled+Live+Cells+in+the+Embryonic+Mammalian+Forebrain.">Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain.</a> CSH Protoc. , (2011).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains.">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li><li>Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oblique+radial+glial+divisions+in+the+developing+mouse+neocortex+induce+self-renewing+progenitors+outside+the+germinal+zone+that+resemble+primate+outer+subventricular+zone+progenitors.">Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors.</a> Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).</li><li>Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vivo+imaging+and+cell+tracking+using+a+histone+fluorescent+protein+fusion+in+mice.">Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice.</a> BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).</li><li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells.">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK7+interacts+with+TACC3+to+regulate+interkinetic+nuclear+migration+and+cortical+neurogenesis.">DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis.</a> Nat Neurosci. 15, (2012).</li><li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation.">Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139, 597-609 (2009).</li><li>Schenk, J., Wilsch-Br&#228;uninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+is+required+for+interkinetic+nuclear+migration+of+neural+progenitors.">Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il principale vantaggio del protocollo abbiamo descritto è che fornisce una risoluzione temporale dinamica della mitosi di progenitori neurali. In genere, saggi di visualizzare mitosi nel cervello in via di sviluppo vengono eseguite utilizzando immunofluorescenza di sezioni di tessuto fissate. Ma questo approccio fornisce solo un&#39;istantanea di mitosi a un certo punto volta. Ci sono diversi passaggi che sono più critici per l&#39;imaging mitosi in fettine di cervello: 1) Le fette di cer...

L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere come eseguire l&#39;imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi in fettine di cervello embrionali. Utilizzo di immagini dal vivo di fette di cervello nella cultura, questo protocollo fornisce un metodo semplice per saggiare molteplici aspetti della mitosi nei progenitori neurali in un ambiente altamente simile ad un ambiente in vivo. Esso può essere applicato a cervello di animali e / o cervelli mutanti che sono state manipolate con elettroporazione in utero) 1-5. Questa tecnica è ideale anche per testare l&#39;effetto di agenti farmacologici su mitosi precursori neurali, semplicemente aggiungendo un agente al mezzo di coltura. In sintesi, questo articolo farà un protocollo tecnicamente impegnativo accessibile a coloro che studiano la neurogenesi. Durante la neurogenesi, distinte popolazioni progenitrici neurali subiscono divisioni precise per generare neuroni che alla fine contribuiscono a sei strati corticali dell&#39;adulto neocorteccia 6-8. All&#39;inizio dello sviluppo corticale, la piscina precursore neurale si espande come neuroepiteliale (NE) le cellule si dividono simmetricamente di auto-rinnovarsi. Cellule NE poi convertono in cellule gliali radiali (RGCs). Inizialmente RGCs dividono simmetricamente per produrre due nuovi RGC, tuttavia durante la maggior parte della neurogenesi, la modalità principale RGC &#39;di divisione è asimmetrica. In divisione asimmetrica, 1 RGC dà luogo ad una nuova RGC e di un neurone post-mitotico, o un progenitore più specializzato (sia per un breve precursore neurale (SNP), un glia radiale esterna (ORG), o un progenitore intermedio (INP) 2,3,7,9. INP, SNP, e ORG possono generare neuroni alla sub-ventricolare, e regioni basali della corteccia, rispettivamente. Quindi, la divisione cellulare dei progenitori è un processo fondamentale per generare neuroni del neocorteccia. Numerosi studi indicano una correlazione tra specifici tratti mitotici di RGCs e il destino delle cellule figlie. Haydar et al. Ed Takahashi et al.hanno dimostrato che la durata mitotico RGC e ciclo cellulare aumento di lunghezza come procede neurogenesi, un reperto eco nel follow-up di studi 10-13. Un certo numero di studi hanno suggerito che fuso mitotico orientamento rispetto al ventricolo influenza aspetti della neurogenesi e corticogenesi, compresi i tipi di neuroni generati e posizione della progenie nel cervello, rispettivamente 3,10,14-16. Sia orientamento del piano di clivaggio influenza direttamente il destino della cellula è controversa, ma la conclusione resta che questo mitotico impatti parametri neurogenesi. Ulteriori sottolineando l&#39;importanza della mitosi è l&#39;osservazione che molti geni coinvolti nei meccanismi di mitosi sono cruciali per la neurogenesi e per il corretto sviluppo del cervello 17-20. La mitosi è un processo dinamico, ma fino ad oggi la maggior parte degli studi che descrivono neurali progenitrici mitosi utilizzare l&#39;analisi di sezioni di tessuto fissi o immagini di progenitori neurali tramite coltura cellulare in vitro. Così, i metodi tradizionali per valutare la mitosi forniscono solo un&#39;istantanea di questo processo e non riescono a scoprire come le cellule si comportano in un tessuto. Vivo imaging progenitrici neurali mitosi è diventato sempre più uno strumento fondamentale per comprendere la funzione dei progenitori neurali. Per esempi vedere questi riferimenti 4,8,10,21-25. Diversi protocolli in essere sono stati pubblicati per la preparazione e l&#39;imaging di fette di cervello 26,27. Tuttavia ad oggi, un protocollo completo per l&#39;imaging e analisi di mitosi non è stata descritta né dimostrato in video. Questa tecnica offre diversi vantaggi significativi rispetto analisi fisso di sezioni cerebrali. Analisi Time-lapse di fette di cervello consente la generazione di un numero significativamente maggiore punti di dati che possono essere analizzati in modo flessibile. In primo luogo, i dati vengono raccolti presso i singoli punti di tempo nel corso di alcuni minuti a diverse ore. Si può analizzare punti temporali individuali (per creare un montaggio statico) opuò combinare diversi momenti in film. In secondo luogo, confocale di fette consente la generazione di dati in diverse sezioni Z in fettine cerebrali. Come risultato, le singole sezioni possono essere analizzati. In alternativa, pile di singole sezioni possono essere combinati in una proiezione massima intensità. Terzo, analisi viene fatta nel contesto di un tessuto, rivelando come cellule si dividono rispetto alle cellule e strutture vicine. Quarto, è ideale per l&#39;analisi di mutanti che mostrano alcune prove di difetti mitotici. Insieme, questo protocollo aiuterà a chiarire passaggi critici per aiutare gli investigatori che intendono effettuare l&#39;imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi nei propri laboratori.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="738">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:261px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X N2</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50X B27 without vitamin A</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated horse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1138-500ml</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat-inactivated calf serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>R&#38;D Sytems</td>
			<td>3139-FB-025</td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14065-056</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes Free Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;H4034</td>
			<td style="width:261px;">dilute to 1M (pH7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5M D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.9M NaHC03</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:261px;">for the dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-melting agarose</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td style="width:261px;">for generating slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 404 glue</td>
			<td>Loctite 404</td>
			<td>46551</td>
			<td style="width:261px;">keep at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syto11</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>S7573</td>
			<td style="width:261px;">Make 5&#181;l aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mg/ml collagen type I&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A1048301</td>
			<td style="width:261px;">for culturing slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td style="width:261px;">for culturing slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">for dissection of the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">digital thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">to measure the temperature of the agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">to transfer brains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">alternative to transfer brains</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td style="width:261px;">for generating slices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">dissecting out embryos</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">imaging microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:261px;">A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex

Anche se di breve durata, mitosi è un processo multi-step complesso e dinamico fondamentale per lo sviluppo di organi compreso il cervello. Nella corteccia cerebrale di sviluppo, mitosi anormale di progenitori neurali può causare difetti di dimensioni e funzione cerebrale. Quindi, vi è una necessità critica per strumenti per comprendere i meccanismi di neurale progenitore mitosi. Sviluppo corticale nei roditori è un modello eccezionale per lo studio di questo processo. Progenitrici neurali mitosi è comunemente esaminati nelle sezioni di cervello fissi. Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio per l&#39;imaging dal vivo della mitosi in ex vivo fettine di cervello embrionali. Noi descrivere i passaggi critici per questa procedura, che includono: l&#39;estrazione del cervello, l&#39;incorporamento del cervello, vibratome sezionamento di fette di cervello, colorazione e coltura di fette, e time-lapse imaging. Abbiamo poi dimostrare e descrivere in dettaglio come eseguire un&#39;analisi post-acquisizione della mitosi. Includiamo risultati rappresentativi from questo test utilizzando il colorante vitale Syto11, topi transgenici (istone H2B-EGFP e centrin-EGFP), e in utero elettroporazione (mCherry-α-tubulina). Discuteremo di come questa procedura può essere meglio ottimizzato e come può essere modificato per lo studio della regolazione genetica della mitosi. Vivo imaging di mitosi in fettine cerebrali è un approccio flessibile per valutare l&#39;impatto dell&#39;età, anatomia, e perturbazione genetica in un ambiente controllato, e per generare una grande quantità di dati ad alta risoluzione temporale e spaziale. Quindi questo protocollo integrerà gli strumenti esistenti per l&#39;analisi dei neurali progenitrici mitosi.

Il successo di questo test e l&#39;osservazione di più celle mitotiche durante una sessione di imaging in tempo reale dipendono in gran parte sia l&#39;integrità e livello anatomico della fetta in cui sono fatti acquisizioni. Come discusso in seguito, il livello anatomico di una fetta è un fattore importante. Figura 3A mostra rostro-caudale e medio-laterale località dove abbiamo avuto più successo. Per ulteriori discussioni di questo tema si veda Noctor 26. L&#39;integrità della fetta p...

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Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull&#39;analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

live-imaging-of-mitosis-in-the-developing-mouse-embryonic-cortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Views.  Duke University Medical Center.  Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato. 

Video: Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Modulazione non invasiva e mappatura robotica della Corteccia motoria nel cervello in via di sviluppo

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...