1. Dish Preparazione <ol><li> I piatti utilizzati per la cultura slice sono il fondo di vetro (con un coprioggetto come base) (piatti WillCo). Questi sono posizionati sul tessuto lente in un piatto tessuto 6 centimetri cultura per mantenere il fondo di vetro pulito. </li><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, si aggiungono 2 ml 0,1% di poli-L-lisina soluzione al fondo piatto di vetro e incubare per 5 min a temperatura ambiente per permettere la poli-L-lisina per rivestire il fondo di vetro. </li><li> Rimuovere poli-L-lisina soluzione e sciacquare tre volte in acqua deionizzata, e poi una volta in 70% etanolo. </li><li> Lasciare asciugare per una notte. I piatti possono anche essere asciugati con blando riscaldamento in un forno a microonde a bassa potenza per 30-45 secondi. </li></ol> 2. Embryo Elettroporazione <ol><li> Incubare le uova a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) stage 10 (circa 36 ore) (o altro livello a scelta). </li><li> Prima di iniziare la preparazione aghi di vetro (usiamo un Flaming / modello di Brown p87 puller microcapillare) e rompere la punta del needle utilizzando una pinza sottile sotto un microscopio da dissezione. La fine dell&#39;ago dovrebbe essere abbastanza sottili da perforare l&#39;embrione, pur non essendo così stretta che impedisce l&#39;iniezione della soluzione di DNA. </li><li> Uova finestra ed elettrodi (5mm posto a parte) su entrambi i lati dell&#39;embrione </li><li> Iniettare DNA (~ 0,025-0,5 pg / pl in acqua deionizzata colorato con una piccola quantità di verde veloce) nel tubo neurale. </li><li> Applicare corrente - 12-17 V tre volte, lunghezza di impulso 50ms con 950 ms tra gli impulsi. </li><li> Usiamo basse concentrazioni di DNA e delle tensioni di elettroporazione basse per ottenere l&#39;espressione del mosaico in modo da poter seguire le singole celle. </li><li> Coprire finestra nel guscio con cellotape e assicurarsi che sia sigillato. </li><li> Lasciare embrioni di recuperare per 3-4 ore o durante la notte a 37 ° C. </li></ol> 3. Il collagene e Cultura Preparazione Slice Media <ol><li> Preparare mix collagene e terreno di coltura fetta circa un&#39;ora prima di affettarlo. </li><li> A 300 t plipo 1 collagene aggiungere 100 microlitri soluzione 0,1% di acido acetico e 100 pl 5 x L15 mezzo. Vortex accuratamente dopo ogni aggiunta. La soluzione dovrebbe diventare gialla. </li><li> Ora aggiungere bicarbonato di 15-20 microlitri di sodio 7,5% e completamente vortice. La soluzione dovrebbe diventare leggermente rosa, e il volume di bicarbonato di sodio richiesti per questo può variare. Tenere su ghiaccio e portare fresca ogni volta. </li><li> Per aggiungere 10 ml di terreno neurobasal B-27 e integratore Glutamax, ad una concentrazione finale di 1 x soluzione di Gentamicina e 10 pl. </li><li> Luogo in media a 37 ° C incubatore tamponata con il 5% di CO 2. Lasciare la parte superiore del contenitore allentata per consentire equilibrare con la CO 2. </li></ol> 4. Slice Cultura <ol><li> Rimuovere gli embrioni da uovo e lavare in media L15. </li><li> In un piatto di coltura tissutale con uno strato di Sylgard sul fondo e perno fuori attraverso i circostanti extra-embrionali membrane in modo che siano ben teso. </li><li> Utilizzo di un microfonoroknife, embrione fetta più diritta possibile attraverso la regione di interesse. Per il midollo spinale, fette dovrebbe essere compreso tra 1-2 somiti spessore. Lasciare collegati a fette embrione mentre si affettare altri embrioni in modo da non perderli. </li><li> Preparare una punta di 200 microlitri micropipetta tagliando ~ 1 mm della punta e allegando ad un p2 o p10. Questa punta verrà utilizzato per trasferire le fette midollo spinale al fondo piatto di vetro. A 10 microlitri punta non è sufficientemente ampio per raccogliere fette. </li><li> Rivestire l&#39;interno della punta con il collagene pipettando 1 mix ul collagene preparato in precedenza. Lasciare agire per 1-2 minuti e poi risciacquare con L15 media. Ciò impedirà il tessuto si attacchi all&#39;interno della punta. </li><li> Staccare fetta dall&#39;embrione utilizzando una microknife e togliere dal piatto con un p2 p10 o munito di una punta 200 pl e impostare a 1 microlitri. Prova di prendere come mezzo meno possibile. </li><li> Il collagene mix e goccia Vortex 5-8 pl di questa al poli-L-lisina piatto rivestito. </li><li> Immediatamente messo fetta embrione in collagene e la posizione in posizione con un paio di pinze sottili. Fette devono essere posizionati in modo che il lato di essere ripreso è a filo con il coprioggetto. Il tessuto deve aderire al poli-L-lisina rivestimento sul vetrino. </li><li> Ripetere questa operazione finché non avrete fette più sul vetrino. Di solito possiamo mettere 6-9 fette su un piatto. </li><li> Una volta che tutte le fette sono in posizione, coprire il piatto e permettono di impostare il collagene per 20 minuti. Alcuni dei primi collagene posto potrebbe essere già iniziato ad asciugarsi. Per evitare questo aggiungere una piccola quantità di L15 a questi prima copertura. </li><li> Una volta impostata, aggiungere cautamente 2ml terreno di coltura fetta che è stata equilibrata in 5% CO 2 a 37 ° C per almeno un&#39;ora. Bisogna fare attenzione a non staccare il collagene dal vetrino. </li><li> Posto a 37 ° / 5% CO 2 incubatore e consentire fette di recuperare per almeno 3 ore prima di imaging. Se non c&#39;è, piatto di umidità posto in uno spirito box perspexha bit di carta velina umida in un angolo. </li></ol> 5. Imaging embrioni Slices <ol><li> Usiamo un Core DeltaVision ampio campo ottico dotato di una camera Weatherstation ambientale fette di immagine. La camera è mantenuta costantemente a 37 ° C, con CO 2 apparato perfusione di mantenere la fase microscopio al 5% CO 2/95% aria. </li><li> Imaging viene normalmente eseguita con un 40 x / NA 1,30 Olio per lenti ad immersione e le immagini vengono catturate con un HQ2 CoolSnap raffreddato camera CCD. </li><li> Z sezioni vengono catturati ogni 1,5 um a 45 um tessuto. Il tempo di esposizione deve essere mantenuto il più basso possibile. Di solito esporre per 5-50 ms per ogni Z-sezione. Le immagini vengono catturate ogni 7 minuti e fino a 9 sezioni può essere visitata utilizzando il punto preciso del sistema DeltaVision di visita funzione. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Un time-lapse sequenza di esempio di una cellula progenitrice midollo spinale èmostrato nella fig. 2a e Movie corrispondente 1. Imaging è stato avviato su una fetta del midollo spinale da una due-giorni di età (HH stage 12) dell&#39;embrione. Questa cella è stata transfettata con un costrutto che esprime GFP-αTubulin. Durante questa prima fase, le cellule progenitrici neurali subiscono prevalentemente progenitrice progenitrici divisioni-mode durante il quale le cellule si dividono per generare due cellule progenitrici ulteriori ciclismo. Fig. Film 2b e corrispondente 2 mostra una cellula trasfettata con GFP-GPI (ancorata a GPI GFP), segna la membrana cellulare. Questa cellula subisce una divisione durante il quale il processo basale si divide in due ed è ugualmente ereditato dalle cellule figlie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Figura 1. Slice protocollo di cultura per time-lapse imaging. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Figura 2. Cellule Behavior durante il normale sviluppo del midollo spinale. (a) i fotogrammi selezionati da Movie 1. Cellulari esprimenti GFP-tubulina divide con un piano di clivaggio che è perpendicolare alla superficie apicale (2 h 20 min), generando due cellule figlie che dividono ancora una volta (24 h 23 min e 25 h 54 min). (B) i fotogrammi selezionati da Movie 2. Cellule trasfettate con GFP-GPI subisce divisione cellulare in cui è suddiviso il processo basale (frecce bianche) e ugualmente ereditato dalle cellule figlie. Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film</a> . Movie 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film</a> .

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	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).</li><li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii:+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy.">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Vi presentiamo qui un nuovo time-lapse test di imaging per monitorare il comportamento delle cellule in coltura fetta di pollo embrionale. Questo test permette l&#39;imaging ad alta risoluzione di tessuti viventi per un massimo di 70 ore, anche se le scadenze tra 24-48 ore sono più facili da catturare. L&#39;uso di un olio ad alta obiettivo NA e intervalli relativamente brevi tra i punti temporali consente l&#39;acquisizione di immagini ad alta risoluzione, oltre a permettere di monitorare il comportamento cellulare che si verifica spesso rapidamente, e può essere facilmente perso durante convenzionale time-lapse imaging mediante confocale microscopia. Il vantaggio principale di questo saggio è la capacità di celle di immagine per lunghi periodi di tempo. L&#39;uso di ampio campo 6 invece di scansione laser confocale 7 microscopia è critico per questo. Microscopia confocale ha tradizionalmente offerto numerosi vantaggi rispetto ad ampio campo di microscopia, compresa la capacità di prendere sezioni ottiche ed eliminare di informazioni messa a fuoco direttamente <sup&gt; 7, ma l&#39;uso di un foro porta ad una perdita di luce al rivelatore 8, escludendo una quantità significativa di informazioni, e che richiede tempi di esposizione più lunghi. Wide-microscopia a campo, invece, utilizza illuminazione pieno campo e tutta la luce che passa attraverso l&#39;obiettivo viene inviato al rivelatore. Questa accoppiata con uno ad alta efficienza quantica raffreddato Coupled Device (CCD) telecamera garantisce immagini con un elevato rapporto segnale-rumore rispetto alla microscopia confocale 9, con tempi di esposizione molto veloci. Nella nostra applicazione, dobbiamo immagine per lunghi periodi, record stack 3D e in ultima analisi, risolvere piccoli-vicino-diffrazione di strutture limitate. Sebbene microscopia confocale impedisce fuori-fuoco luce raggiunga il rivelatore e quindi riduce significativamente fondo in spessore, densamente-etichettati campioni 7, 8, si realizza solo utilizzabile segnale-rumore di ingresso luce molto più grande di ampio microscopia a campo 10. Per sparsel molto sensibile alla lucecampioni y-etichettati come i nostri fette elettroporate del midollo spinale, quindi, ampio microscopia a campo si comporta meglio di microscopia confocale. In combinazione con il ripristino dell&#39;immagine deconvoluzione, che rimuove le informazioni fuoco e migliora il contrasto, a grande campo è quindi particolarmente indicato per il rilevamento di oggetti piccoli, dim 11. Anche se non è appropriato per ogni esperimento imaging dei tessuti, questo approccio è stato molto efficace per la nostra applicazione dal vivo imaging cellulare. La scelta della proteina fluorescente è un importante fattore che può influenzare la sopravvivenza cellulare. Abbiamo trovato che i migliori risultati sono ottenuti dai costrutti che utilizzano la proteina fluorescente verde (GFP) 12 come marcatore. Stiamo valutando una serie di rossi proteine ​​fluorescenti che possono essere efficacemente impiegati in combinazione con GFP per doppio canale time-decade. Ci sono una varietà di tali proteine ​​disponibile 13. Sebbene molte proteine ​​sono stabili come fusioni con una proteina fluorescente, Alcune proteine ​​possono essere reso instabile per fusione, con conseguente riduzione della vitalità cellulare. In tali casi, l&#39;uso di costrutti contenenti un sito interno di entrata del ribosoma (IRES) è utile per separare la proteina di interesse dalla proteina fluorescente. Quando le fette di imaging del midollo spinale, la cura deve essere adottate per minimizzare l&#39;esposizione alla luce fluorescente. Gli oculari del microscopio deve essere utilizzato solo a luce trasmessa (campo chiaro) per individuare e posizionare le fette. Immagini fluorescenti devono sempre essere acquisito utilizzando il software microscopio usando tempi di esposizione minimi. Questi dovrebbero essere mantenuto nella gamma di 5-50 ms e l&#39;uso di filtri di densità neutri deve essere sperimentato. Anche se i tempi di esposizione più lunghi può inizialmente produrre immagini più nitide, gli effetti fototossiche di esposizione alla luce fluorescente può portare alla morte cellulare. I primi 5-10 um di tessuto che è più vicino al vetrino non deve essere immaginato come questa regione contiene tessuto che potrebbero essere danneggiati duranteaffettare. Sebbene gli esempi presentati qui sono di embrioni in stadio elettroporata HH 10 e ripreso 6-7 ore dopo, questo metodo può essere usato per embrioni fino a SS stadio 18. Nelle fasi successive, il tessuto del midollo spinale è molto più grande ed è così difficile da tagliare a mano. In questi casi, gli embrioni incorporamento in agarosio a basso punto di fusione e sezionamento con un vibratomo possono ottenere risultati migliori. Anche se presentiamo questo test come metodo di imaging per le cellule del midollo spinale di sviluppo, questo approccio è stato modificato ad altri tessuti embrionali di immagini, compreso il sensoriale placodes 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> WillCo Dish </td><td> WillCo Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% in Tris </td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari </td><td> Harvard Instruments </td><td> GC100-10 </td><td> 1,0 millimetri di diametro esterno, 0,58 millimetri di diametro interno </td></tr><tr><td> Elettrodi (Genetrodes, in ovo, a forma di L </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5 millimetri placcato in oro </td></tr><tr><td> ECM 830 quadrato generatore di impulsi </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> per l&#39;ovo in electroopration </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Collagene di tipo I ratti </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 (polvere) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / L in acqua distillata per soluzione 5x </td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> 7,5% soluzione </td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> senza rosso fenolo </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> Soluzione 100x </td></tr><tr><td> B-27 supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 media (liquido 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 gradi di pendenza </td></tr><tr><td> Perni in acciaio inox senza testa </td><td> Watkins e Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Formato A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 elastomero </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision cuore del sistema microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 telecamera CCD </td><td> Fotometrici </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

Il midollo spinale embrionale consiste di bicicletta cellule progenitrici neurali che danno luogo ad una grande percentuale delle cellule neuronali e gliali del sistema nervoso centrale (CNS). Anche se si sa molto sui meccanismi molecolari che motivo il midollo spinale e provocano la differenziazione neuronale 1, 2, ci manca una profonda conoscenza di questi eventi precoci a livello di comportamento cellulare. E &#39;quindi fondamentale per studiare il comportamento dei progenitori neurali in tempo reale in quanto sottoposti a neurogenesi. In passato, imaging in tempo reale del primo tessuto embrionale è stato limitato da cellule / tessuti vitalità nella cultura nonché gli effetti fototossici di imaging fluorescente. Qui presentare un nuovo metodo di analisi per immagini come tessuto per lunghi periodi di tempo, utilizzando un romanzo ex vivo protocollo fetta cultura e ampio campo di microscopia a fluorescenza (Fig. 1). Questo approccio realizza lungo termine time-lapse monitoraggio della chick embrionale sPinal cellule progenitrici del midollo con elevata risoluzione spaziale e temporale. Il test può essere modificato per l&#39;immagine di una vasta gamma di tessuti embrionali 3, 4 Oltre all&#39;osservazione dei comportamenti cellulari e sub-cellulare, lo sviluppo del romanzo e giornalisti molto sensibili per l&#39;attività dei geni (ad esempio, di segnalazione Notch 5) rende questo test un potente strumento con il quale per capire come segnalazione regola il comportamento delle cellule durante lo sviluppo embrionale.

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High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K Views.  University of Dundee, Dundee, UK. Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Video: High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

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High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Ad alta risoluzione magnetica funzionale per immagini Metodi risonanza per mesencefalo umano

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Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

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Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta risoluzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Manuale Protocollo Segmentazione for Human ippocampale Sottocampi Utilizzando 3T Risonanza Magnetica

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Ad alta risoluzione strutturale Risonanza Magnetica del subcortex Umana<I&gt; In Vivo</I&gt; E Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...