Questo lavoro è stato sostenuto dal Career Award Burroughs Wellcome nel Scienze Biomediche (AKM), The Whitehall Research Foundation Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM), e un NEI finanziato, Vision Training Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Per visualizzare i neuroni nel cervello intatto utilizzando la microscopia a due fotoni, una preparazione in cui i neuroni sono etichettati con marcatori fluorescenti viene utilizzato. Negli esperimenti qui presentati usiamo la GFP-M linea di topi transgenici che le etichette strato di 5 cellule piramidali 1. Layer 5 cellule piramidali progetto processi dendritiche in strati superficiali, permettendo la visualizzazione dei dendriti e spine dendritiche fino ad una profondità di 300 micron al di sotto del livello della pia. Un approccio alternativo è quello di cellule etichetta utilizzando marcatori virali (vedi Lowery et al. Sottoposti a Giove). </li><li> Sterilizzare l&#39;area di lavoro utilizzando etanolo al 70% e gli strumenti in autoclave per la chirurgia asettica. Coprire le superficie con medicazione pulita. </li><li> Anestetizzare topi con un cocktail di fentanyl (fentanil 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) seguita da una dose quarto di Avertin (0,0075 mg / ml) utilizzando IACUC procedure approvate. Pretrattare i topi con l&#39;analgesico, buprenorfina (0,5 mg / kg) somministrato per via sottocutanea (SQ). Monitorare il livello del piano anestetico per reazione test di coda / tep pizzico. </li><li> Mantenere animale a 37,5 ° C con coperta termica con annesso termometro rettale. </li><li> Applicare una pomata oftalmica per gli occhi per evitare che gli occhi si secchi. Cappuccio con gli occhi piccolo foglio di carta per proteggere gli occhi dalla fonte di luce durante l&#39;intervento. </li><li> Utilizzando le forbici, eliminare i peli dalla parte posteriore della testa (dietro le orecchie) per gli occhi. </li><li> Pulire la parte superiore della testa dell&#39;animale con l&#39;applicazione sequenziale del 70% di etanolo, seguito da macchia betadine e Betadine soluzione. </li><li> Fare un L-cut incisione dietro le orecchie e lungo sia il lato destro o sinistro della linea mediana (a seconda di quale emisfero sarà ripreso) per gli occhi. Piegare la pelle sopra e lontano dal sito chirurgico. Non rimuovere la pelle come la pelle sarà suturato dopo la sessione di imaging. </li><li> Utilizzando una pinza sottile estrarre delicatamente la pelle in alto e lontano dalla propria area di interesse. </li><li> Raschiare delicatamente via il periostio dalla zona esposta del cranio con una pinza pulita o lama microchirurgica. Utilizzando tampone di cotone, applicare una piccola quantità del 10% di cloruro ferrico al cranio per asciugare completamente la membrana periostio e assicurarsi che sia stato completamente rimosso. E &#39;importante che il teschio sia completamente asciutta per garantire la corretta adesione del collante (vedi 11). Uso di pinze o lama di microchirurgia, raschiare delicatamente via periostio membrana secca. </li><li> Applicare uno strato sottile di collante cianoacrilato attorno alla finestra di imaging della piastra in acciaio inox testa (vedi Figura 1) e apporre la targa al cranio. </li><li> Utilizzando la fine di legno di un bastoncino di cotone-tampone, applicare la colla per le cuciture all&#39;interno della finestra di imaging, avendo cura di riempire tutti gli spazi vuoti tra la piastra di imaging e la curvatura del cranio. </li><li> Mettere una goccia di colla acceleratore nella finestra. Rapidamente togliere acceleratore colla in eccesso con un batuffolo di cotone o di kim pulire. La colla deve essere completamente solidificato prima foratura. </li><li> Inizia a fluidificare il cranio nella finestra immagine che utilizzano un trapano dentistico munito di un 0,7 millimetri in acciaio inox bava. Foratura si alternano con l&#39;applicazione occasionale dello 0,9% soluzione salina sterile per evitare di generare troppo calore sul cranio. </li><li> Sottile una finestra 4x4 mm sul cranio con piccoli colpi su tutta la superficie del cranio con il trapano odontoiatrico. Provare la magrezza del cranio con una pinza punta smussata. La superficie del cranio trattino leggermente con una leggera pressione. Lo spessore cranio ottimale per l&#39;imaging è compresa tra 10 e 30 micron. </li><li> Quando il cranio è sottile e la finestra pulita di tutti i detriti, luogo salina sul cranio. Fotografare la finestra di imaging con una fotocamera digitale montata su un campo di applicazione dissezione. La fotografia e l&#39;uso del sistema vascolare cerebrale aiuterà a localizzare la posizione per posizionare il piatto di imaging per le sessioni di imaging successive. </li><li> Trasporto l&#39;animale al 2-fotone rig. L&#39;animale deve rimanere sulla coperta di riscaldamento (con sonda rettale) durante l&#39;intera sessione di imaging. Nota: mentre sotto sedazione, dell&#39;animale temperatura corporea sarà soggetto a forti fluttuazioni in assenza di una unità di riscaldamento con conseguente danno corticale o forse la morte. </li><li> Un microscopio a due fotoni con un laser Mai Tai, una pompa da 10 W a stato solido per la massima potenza e una modificata Olympus Fluoview unità confocale viene utilizzato. Il sistema è ottimizzato per l&#39;imaging dei tessuti profondi e rilevatori esterni sono installati il ​​più vicino all&#39;obiettivo possibile per consentire il rilevamento massimo di fluorescenza dal cervello. Un Olympus LUMPlan fl / IR lente dell&#39;obiettivo 20X/0.95NA viene utilizzato. 0,9% soluzione salina viene utilizzato durante l&#39;imaging per immersione obiettivo. </li><li> Utilizzando questo microscopio, e bassa zoom digitale (x1) identificano un&#39;area contenente i neuroni vivaci etichettati. </li><li> Utilizzando una fotocamera digitale apposta sul oculare microscopio, scatta una fotografia della zona di imaging. In alternativa, delineare il modello di vasi sanguigni. Ciò è necessario per rivolta la posizione di imaging stesso tempo in un punto successivo. </li><li> Ottenere una pila a basso ingrandimento (obiettivo x20, 512x512 pixel, 5 passo micron) attraverso l&#39;intera estensione visibile del cervello (di solito si estende ~ 200 micron) che mostra l&#39;entità della ramificazione dendritica. Nota: questa immagine bassi ingrandimenti saranno utilizzati per individuare l&#39;area di esposizione in momenti successivi sia come vasi sanguigni e dendriti mantengono la loro struttura in animali giovani e adulti. </li><li> Utilizzando software di imaging (Fluoview, v. 5.0, FV300), aumentare l&#39;ingrandimento digitale di 8 volte. Regolare l&#39;coordinate X, Y (pan coordinate), se necessario, e raccogliere una pila alta ingrandimento che mostrerà dettagliata morfologia dendritica compresi i luoghi e la struttura delle spine dendritiche. Prendere appunti dettagliate su ogni raccolta di stack, cioè pan coordinate, la gamma della collezione, il z-passo le dimensioni e il numero di passaggi nel vostro stack. Tali schede saranno utilizzate quando tornare in questo dendrite o assone in un punto temporale successivo. </li><li> A seguito di imaging, rimuovere la piastra di testa con delicatezza separando placca dalla superficie del cranio. Utilizzando pinze, rimuovere eventuali residui di colla rimanente sul cranio e pulire superficie cranio con soluzione salina sterile allo 0,9%. Sutura la pelle sopra il cranio insieme usando # 6 filo di sutura. Pulire area con etanolo al 70%. Per alleviare il dolore durante il recupero post-operatorio, somministrare 0,1 mg / kg analgesico buprenorfina, SQ. </li><li> Luogo animale in gabbia pulita sotto una lampada di calore fino a quando non si sveglia ed è mobile. Ritorna animale alla gabbia originale. </li><li> Per animali re-imaging in un punto secondo momento (i nostri punti di imaging in tempo può essere ovunque da 2 giorni a molti mesi di distanza), rimuovere punti di sutura o riaprire la pelle sulla testa utilizzando metodi asettica come sopra. Utilizzare l&#39;immagine digitale del sistema vascolare cerebrale (preso in data primo intervento) per individuare la posizione originale delle immagini. Riapporre acciaio inox headplate (punti 10-12). Utilizzare una lama sottile delicatamente microchirurgico per via qualsiasi osso che potrebbe avere nuovamente cresciuto tra i punti di tempo di imaging. Se necessario, diluire con trapano dentistico. Finestra trasparente immagini di detriti e applicare una goccia di soluzione salina sterile allo 0,9%. </li><li> Trasportare animali a microscopio a due fotoni e individuare campo originale di imaging. Utilizza la fotografia digitali scattate durante la sessione di imaging prima assistenza. </li><li> Aprire il programma Fluoview e aprire l&#39;immagine originale basso ingrandimento. Apporre un foglio trasparente allo schermo del computer e disegnare il principale modello di vaso sanguigno con una penna trasparenza. </li><li> Aprite l&#39;immagine dal vivo e riallineare il sistema vascolare sanguigno al modello delineato sulla pellicola trasparente. </li><li> Per il re-imaging 8x zoom in strutture, aprire lo stack desiderato raccolti dalla sessione di imaging precedente. Disegnare la struttura (cioè assonale, dendritiche, gliali) su pellicola trasparente, apposto allo schermo del computer. </li><li> Zoom 8x dalle immagini live e impostare il pan coordinate per i primi parametri di imaging giorno. A seconda della precisione di allineare la posizione a basso ingrandimento, può essere necessario regolare anche l&#39;angolo delle immagini leggermente. Una volta che la struttura desiderata viene trovato, all&#39;altezza della struttura al modello delineato alto ingrandimento. Raccogliere lo z-stack con il passo identico e il numero di Z-Stack immagini per successive analisi. </li><li> Ripetere i passaggi 29 e 30 fino a quando tutte le immagini ad alto ingrandimento sono ri-raccolta. </li><li> Quando l&#39;imaging è completa, ripetere i passaggi 22-24. Re-imaging può essere ripetuta fino a 2 punti di tempo separati. </li><li> Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Vivarium e Divisione di Medicina degli animali da laboratorio della University of Rochester School of Medicine and Dentistry, nel pieno riconoscimento da parte dell&#39;Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento della cura degli animali da laboratorio, International (AAALAC) e sono in conformità con legge statale, statuto federale e la politica NIH. </li></ol> Rappresentante Risultati In GFP-M topi che esprimono, un sottoinsieme di strato di 5 cellule piramidali e corrispondenti processi dendritiche possono essere facilmente visualizzati utilizzando 2-fotone microscopia a scansione laser (2PLSM) 1. Qui abbiamo dimostrato un assottigliato-teschio di preparazione in cui è assottigliato il cranio sulla posizione desiderata per l&#39;imaging ~ 10-30 micron. Eseguita correttamente, il nostro protocollo ci ha permesso di visualizzare chiaramente dendriti corticale e spine nella corteccia visiva intatta per l&#39;analisi acuta o cronica (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Testa su ordinazione e la piastra di base. (A) Vista dall&#39;alto della testa fatta su misura e la piastra di base utilizzato per la preparazione diluito cranio-chirurgia. (B) Vista laterale della misura della testa e piastra di base. (C, D) schema dettagliato e l&#39;immagine della piastra di testa. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figura 2" /> <strong&gt; Figura 2. Risultati rappresentativi da 2PLSM seguente preparazione sottile cranio. (A) dendriti ripreso in vivo nella corteccia visiva di un transgenici GFP-M mouse usando la microscopia a due fotoni. L&#39;immagine è una proiezione della singola immagine ottenuti ogni 5 micron dal pia ad una profondità finale di 175 micron. L&#39;area in scatola in A rappresenta l&#39;area ingrandita in (B) e (C), ripreso il giorno 0 (D0) e quattro giorni più tardi (D4). (D, E) ingrandimento superiore della filiale dendritiche scatola in B e C dimostrando spine stabile (teste di freccia bianca), persi / spine scomparsa (teste di freccia rossa) e nuove spine (teste di freccia verde). Barre di scala = A. 200 micron, B, C. 20 micron, D, E. 5 micron.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Immagini cronico usando la microscopia a due fotoni sta diventando una tecnica sempre più popolare per studiare i cambiamenti morfologici sono innescate durante 2-5 plasticità. Qui dimostrare un assottigliato-teschio preparazione da seguire identificato spine dendritiche nel cervello di topo intatto nei giorni di imaging diverse. In questo protocollo, il cranio è lasciato intatto, causando danni minimi alla corteccia e conseguente livelli molto bassi di neuroinfiammazione che possono alterare la funzione d...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

Imaging in vivo con due fotoni microscopia a scansione laser (2PLSM) permette lo studio delle cellule viventi e dei processi neuronali nel cervello intatto. La tecnica qui presentata permette l&#39;imaging della stessa area del cervello, in momenti diversi (cronica imaging) con risoluzione microscopica che permette il tracciamento delle spine dendritiche, che sono le strutture di piccole dimensioni che rappresentano la maggioranza dei siti post-sinaptici eccitatori nel SNC. La capacità di risolvere in modo chiaro multa strutture corticali sui punti più volte ha molti vantaggi, in particolare nello studio della plasticità del cervello in cui i cambiamenti morfologici a sinapsi e rimodellamento del circuito può contribuire a spiegare i meccanismi sottostanti. In questo materiale video e complementari, mostriamo un protocollo per la cronica imaging in vivo del cervello intatto con un assottigliato-teschio di preparazione. Il diradamento-cranio preparazione è un approccio mini-invasivo che evita potenziali danni per la durata e / o corteccia, riducendo così l&#39;insorgenza di una risposta infiammatoria. Quando questo protocollo è eseguita correttamente, è possibile monitorare in modo chiaro i cambiamenti nelle caratteristiche spine dendritiche nel cervello intatto per un periodo prolungato di tempo.

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In questo materiale video e supplementare, mostriamo un protocollo per la cronica<em&gt; In vivo</emL&#39;imaging&gt; del cervello intatto con un assottigliato-teschio di preparazione.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  University of Rochester. In questo materiale video e supplementare, mostriamo un protocollo per la cronica In vivo

Video: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomografia a coerenza ottica Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imaging funzionale di Auditory Cortex in gatti adulti utilizzando ad alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

Misurare la connettività nella Primaria via visiva in albinismo umano per mezzo del tensore di diffusione Imaging e Trattografia

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Preparazione degli elettrodi di stimolazione nervosa periferica per l'impianto cronico nei ratti

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...