L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di espandersi oltre il limite ottico della maggior parte dei citometri di flusso consentendo a un ricercatore di registrare cinque marcatori aggiuntivi per interrogare popolazioni cellulari complesse. Utilizzando questa tecnica, è possibile ottenere un immunofenotipizzazione profonda quando si lavora con uno strumento con un basso numero di rivelatori o campione con un numero limitato di cellule. Iniziare questa procedura trasferendo accuratamente il sangue prelevato in un tubo conico da 50 millilitri.
Diluire il sangue con una quantità uguale di PBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 15 millilitri di gradiente di densità medio al fondo di un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Sovrapporre con cura il sangue diluito sopra il mezzo gradiente di densità, evitando qualsiasi miscelazione tra il mezzo gradiente di densità e il sangue diluito.
Centrifuga a 400 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente senza freno per evitare interruzioni dell'interfaccia. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per aspirare e scartare attentamente lo strato superiore, prestando attenzione a non rimuovere le cellule all'interfaccia tra il plasma e il mezzo gradiente di densità. Raccogliere il maggior numero possibile di cellule mononucleari del sangue periferico, o PBBC, dall'interfaccia senza toccare il pellet di globuli rossi nella parte inferiore del tubo conico da 50 millilitri e trasferirlo in un nuovo tubo.
Aggiungere PBS per portare il volume finale a 25 millilitri e invertire più volte per mescolare. Quindi, lavare i PBBC due volte come indicato nel testo. Dopo aver rimosso le piastrine e aver contato i PBPC come descritto nel testo, rimescolare le cellule in PBS, 0,1% di azide di sodio a una concentrazione di una volta 10 alla settima cellule per millilitro.
Per preparare i PBBC per la colorazione, trasferire 100 microlitri di ciascun campione su una piastra inferiore a V da 96 porri. Centrifugare la piastra a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
Ad ogni pozzo, aggiungere 100 microlitri di PBS contenenti un colorante fissabile vivo / morto che reagisce con ammina libera sulle proteine e risospendare attentamente la miscela PBMC. Successivamente, lasciare riposare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente per l'etichettatura delle cellule morte. Per ogni campione, preparare 30 microlitri di una miscela contenente tutti e sette gli anticorpi.
In questa fase, possono essere aggiunti anche anticorpi titorati contro diverse molecole bersaglio e in diversi fluorocromi. Centrifugare la piastra di 96 pozzi a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente e aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere il cocktail di anticorpi ad ogni pozzo e ripreziosare con attenzione senza generare bolle.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo 30 minuti, aggiungere 150 microlitri di tampone di colorazione ad ogni pozzo e centrifugare la piastra a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e rimescolare le cellule in 200 microlitri di PBS.
Le cellule sono ora pronte per l'analisi della citometria del flusso. Gli anticorpi anti-CD3, CD8, CD14, CD19 e TCR gamma delta sono titolazione con una curva dell'indice di colorazione massima. La titolazione degli anticorpi è il passaggio più critico di questo protocollo per identificare correttamente sette sottoinsiemi di cellule immunitarie usando due fluorocromi.
Per preparare una diluizione anticorpale duplice, riempire 10 pozzi di una piastra da 96 porri con 40 microlitri di tampone di colorazione per pozzo. Ai fini di questo video, verrà mostrata solo la titolazione di anti-CD8. Nel primo pozzo, aumentare il volume finale a 80 microlitri di tampone di colorazione e aggiungere anti-CD8 ad una concentrazione quattro volte superiore alla concentrazione suggerita dal produttore.
Mescolare bene e trasferire 40 microlitri al secondo pozzo. Mescolare bene e ripetere questo passaggio per tutti gli altri pozzi. Macchiare 10 campioni di PBBC o sangue intero con 30 microlitri delle 10 diverse diluizioni due volte dell'anti-CD8 seguendo il protocollo dimostrato in precedenza.
Acquisire dati con un citometro di flusso e tracciare il segnale da ogni diluizione. Dopo aver calcolato l'indice di macchia per ciascuna concentrazione di anticorpi come specificato nel testo, tracciare l'indice di macchia rispetto alla concentrazione di anticorpi espressa come frazione della diluizione dell'anticorpo e identificare la concentrazione di anticorpi con il valore massimo dell'indice di macchia. Per titolare gli anticorpi anti-CD4 e anti-CD56, iniziare con la duplice strategia di diluizione dimostrata in precedenza, aggiungendo ulteriori concentrazioni nel mezzo per identificare finemente l'intervallo di concentrazione che consentirà la separazione delle cellule T cd4-positive e delle cellule NK dalle altre popolazioni cellulari.
Titolare l'anticorpo anti-CD4 posizionando il segnale anti-CD4 tra il doppio segnale CD8-positivo, CD3-positivo e la singola popolazione positiva CD3. Titolare l'anticorpo anti-CD56 seguendo una strategia simile alla titolazione anticorpale anti-CD4, posizionando le cellule NK tra le popolazioni CD3-negative e CD3-positive. Per iniziare questa strategia di gating a due fluorocromi, a sette marcatori, selezionare il cancello dei linfociti e creare un grafico a punti con uno dei due fluorocromi utilizzati in questo protocollo su ciascun asse.
Gate su cellule T cd8-positive identificate come cellule doppie positive CD3 e CD8 nell'angolo in alto a destra del grafico a punti. Escludere la popolazione di CD8 fioca che potrebbe contenere celle NKT. Gate su cellule T positive cd4 identificate come la popolazione tra le cellule T cd8-positive e le singole popolazioni positive cd3.
Gate su cellule gamma delta T identificate come cellule CD3 alte. Suddividere le cellule gamma delta T in CD8 positivo e CD8 negativo. Gate sulle cellule NK identificate come la popolazione tra le cellule CD3-positive e CD3-negative.
Suddividere le celle NK in CD8 positivo e CD8 negativo. Gate su cellule B identificato come la popolazione CD3-negativa, CD19-positiva nell'angolo in basso a destra del grafico a punti. Selezionate il cancello del monocita e create un plottaggio a punti con uno dei due fluorocromi utilizzati in questo protocollo su ciascun asse.
Gate sulla popolazione CD3-negativa, CD14-positiva. Utilizzando questa strategia, i linfociti di un paziente con mieloma multiplo sono stati gated sulla base della loro dispersione in avanti e della dispersione laterale e del loro profilo citometrico del flusso. Sottopopolazioni di memoria cd8-positive e cellule T ingenua sono state identificate dall'espressione di CD45RA e CCR7.
L'espressione di HLA-DR e CD57 è stata usata per studiare l'attivazione delle cellule T in ingenuità CD8, memoria, memoria centrale, memoria effettore e memoria effettore CD45RA-positive. Allo stesso modo, sono state identificate le cellule T ingenue e di memoria positive del CD4. All'interno della popolazione di memoria, CCR4 e CCR6 sono stati utilizzati per identificare le sottopopolazioni di aiutanti T nelle cellule T positive del CD4.
Le sottopopolazioni delle cellule NK erano caratterizzate dall'espressione CD16 e CD57. Questa strategia è stata utilizzata per indagare la dinamica delle popolazioni immunitarie di campioni longitudinali di un donatore con mieloma multiplo che riceve un trapianto di cellule staminali. La caratterizzazione delle sottopopolazioni CD8 e CD4 nel tempo ha mostrato un'attivazione sostenuta di cellule T CD4-positive e CD8-positive e un'inclinazione dell'aiutante T a un fenotipo T-helper-one.
Ma al giorno 60, la percentuale di cellule B aumentò drasticamente, predicendo la ricaduta del paziente. Una corretta preparazione cellulare e la titolazione degli anticorpi sono passaggi critici per ottenere risultati affidabili utilizzando questa tecnica. Gli anticorpi mirati ad altri marcatori possono essere aggiunti per eseguire analisi citometriche a flusso più profondo e per creare pannelli citometrici a flusso modulare mirati a più lignaggi contemporaneamente.
Approcci simili volti ad ampliare il numero di marcatori registrabili potrebbero anche essere sviluppati utilizzando diversi gruppi di marcatori o per l'uso in diversi modelli animali. Non dimenticare che l'azide di sodio può causare ustioni alla pelle e agli occhi. Pertanto, un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti dovrebbero sempre essere indossati quando si maneggia questo reagente.
