Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione: PO1 HL55798 (a KL) e dell&#39;American Heart Association Scientist Development Grant 0525532U (a EG).

1. Isolamento di aorte murino Approvazione del comitato istituzionale IACUC della procedura è richiesto di lavorare con i topi. <ol><li> Preparare heparinzed PBS con l&#39;aggiunta di 1000 unità di eparina sodica a 50 ml di PBS e invertendo il tubo per mescolare. Preparare una provetta vuota per la raccolta del sangue e un tubo di raccolta contenente PBS per ogni aorta da raccogliere. Mantenere tutte le provette su ghiaccio. </li><li> Eparinizzare una siringa di sangue disegno (0,1 ml di 1000 U / ml di sodio eparina), preparare gli strumenti chirurgici (due paia di pinzette ricurve, un paio di forbici da dissezione, e un paio di microshears), e un palcoscenico per sezionare la dissezione. </li><li> Eutanasia di un mouse utilizzando l&#39;anidride carbonica in una camera ha approvato i seguenti NIH e istituzionali Politiche comitato IACUC per quanto riguarda l&#39;eutanasia roditori. Verificare la presenza di efficacia prima di trasferire il mouse alla fase dissezione. </li><li> Brevemente immergere il mouse con il 70% di etanolo e fissare il mouse alla fase dissezione. Prelievo di sangue dal mouse tramite puntura cardiaca. </li><li> Aprire la cavità addominale e toracica. Usando una siringa da 10 ml con un ago da 25 g, il sistema vascolare del tutto profumato con PBS contenente 2% di eparina per rimuovere completamente il sangue dai vasi mediante puntura cardiaca. Assicurarsi che non c&#39;è sangue nei tessuti aortica. La perfusione deve essere eseguito lentamente con poca pressione per garantire che tutte le placche nella parete del vaso rimangono intatti. </li><li> Sezionare e rimuovere gli organi viscerali, gli organi genito-urinario, diaframma e la milza, lasciando i reni, cuore, aorta e intatto. </li><li> Con attenzione sezionare tessuti adiposi e para-aortici linfonodi lontano dalla aorta, lasciando l&#39;aorta e avventizia intatto. Raccogliere l&#39;aorta tutto compreso dell&#39;arco aortico, ascendente, discendente, toracica, addominale e porzioni. Posizionare l&#39;aorta isolata in un tubo di raccolta con PBS. Durante la procedura di isolamento, cercare di mantenere umido il vaso. </li></ol> 2. Preparazione di sospensioni singola cella <ol><li> Creare un 1X Aorta soluzione enzimatica dissociazione stock (ADES) (125 U / ml Collagenasi tipo XI, 60 U / ml tipo ialuronidasi 1-s, 60 U / ml DNasi I, e 450 U / ml Collagenasi tipo I, in 2,5 ml di PBS, modificato da Galkina et al. 7). Tutti gli enzimi sono di Sigma-Aldrich. Posizionare la soluzione enzimatica magazzino dal ghiaccio. </li><li> Rimuovere la PBS dal tubo di raccolta che contiene l&#39;aorta. Aggiungere 2,5 ml di 1X ADES ad ogni aorta. Tagliare la aorte in piccoli pezzi per facilitare la digestione enzimatica o lasciare intatto l&#39;aorta. Incubare la aorte con la soluzione enzimatica 1X per 1 ora a 37 ° C (più lenta agitazione è opzionale). </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1 ora, preparare sospensioni singola cellula dall&#39;aorta digerito dalla tosatura della aorte a parte e passare attraverso un filtro a 70 micron cella in 5 ml in polipropilene FACS tubi (BD Falcon). Agglomerare le cellule mediante centrifugazione (400xg, 5 minuti, 4 ° C). </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di FACS tampone (PBS integrato con BSA 1% e 0,05% NaN 3) e determinare il numero di cellule presenti nella sospensione cellulare aortica con trypan blu, un emocitometro, e un microscopio ottico. Il numero totale di cellule ottenute dopo la digestione dipende dall&#39;età del mouse e la dieta o la gravità di aterosclerosi. </li></ol> 3. Citometria a flusso colorazione <ol><li> Etichetta un numero adeguato di nuovi tubi di FACS. In generale, gli esperimenti di citometria a flusso dovrebbe avere un non-macchiato provetta di controllo, serie di tubi unico colore, appropriato fluorescenza-meno-uno di controllo (FMO) 8, isotipo controlli del caso, e una serie di tubi sperimentale. Dato che ci sono un numero limitato di leucociti aortica che può essere isolato, leucociti splenico può essere utilizzato per eseguire colorazione singolo controllo. </li><li> Usiamo un protocollo standard citometria a flusso per macchiare sospensioni cellulari aortica. In breve, il trasferimento di una aliquota di 0,5-1x10 6 celle da una sospensione cellulare aortica in un tubo FACS (s). Aggiungere 1 ml di FACS buffer e agglomerare le cellule per centrifugazione. Eliminare il surnatante dalle cellule pellet per decantazione. </li><li> Preparare la soluzione blocco Fc e cocktail di anticorpi per i tubi sperimentale, fluorescenza-meno-uno tubi, tubi e isotipo. Aggiungere 100μl di Fc blocco nel buffer di FACS (14.2μg/ml, clone 2.4G2) a tutti i tubi e film dito o vortice delicatamente per risospendere le cellule. Incubare i campioni per 15-20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare colorazione anticorpi, colorazione isotipo o FMO cocktail colorazione controllo. Determinare la concentrazione ottimale di anticorpi in esperimenti di titolazione preliminare. In presenza di blocco Fc, aggiungere cocktail di anticorpi (100ul/0.5-1.0x10 6 celle) per i tubi campione. Incubare per 20-30 minuti a 4 ° C al buio. </li><li> Aggiungere 1ml di tampone FACS a ciascuna provetta, vortice di mescolare, e agglomerare le cellule per centrifugazione. Ripetere la procedura ancora una volta. </li><li> Decantare il surnatante e risospenderele cellule in pellet 300μl del 2% PFA. Eseguire gli esempi su un citofluorimetro. <ul><li> Nota: in genere gli anticorpi anti-CD45 (antigene leucocitario comune marcatore) si aggiunge a tutti i campioni per gate CD45 + leucociti dopo 7 Inoltre, CD45 FMO e controlli isotipo dovrebbe essere utilizzato inizialmente per posizionare il CD45 + leucociti cancello. CD45 espressione può variare tra i leucociti. </li><li> Nota: Per rilevare la bassa densità che esprimono antigeni di superficie o antigeni evento basso, usare &quot;fluorocromi brillante&quot; come R-ficoeritrina (PE) o Allophycocyanin (APC). Inoltre, gli eventi rari può essere rilevato da mettere in comune diverse aorte abbinati insieme, ma se più di un milione di cellule sono utilizzate, la quantità di anticorpi utilizzati per test deve essere aumentata proporzionalmente. </li><li> Nota: Per assicurarsi che non vi siano contaminazioni di sangue minimo nella aorte isolate e di conseguenza nella sospensione cellulare aortica, in alcuni esperimenti di colorazione aggiuntiva è stata effettuata per TER-119, 7 un antigene espresso da globuli rossi (RBC). Il numero di globuli rossi di globuli bianchi (WBC) nel sangue è di circa 10x10 6 cell / mL a 8x10 3 celle / mL. In base all&#39;espressione del TER-119 nei campioni aortica, la percentuale di derivati ​​dal sangue umano i globuli bianchi nel campione può essere calcolato. Di solito abbiamo meno di 0,02% di derivati ​​dal sangue dei globuli bianchi nei campioni aortica. (Fig.1) </li><li> Nota: Poiché il trattamento enzimatico può influenzare l&#39;espressione di antigeni di superficie, la resistenza alla digestione enzimatica dovrebbe essere determinata per gli antigeni di interesse. In breve, linfonodi periferici (PLN) o piccoli pezzi di milza vengono incubate con o senza cocktail di enzimi per 1 ora a 37 ° C. Dopo 1 ora, l&#39;espressione degli antigeni è determinata mediante citometria di flusso. Il cocktail di enzimi non ha effetto su antigeni di superficie multiple (Fig.2) 7. In alcuni casi, il trattamento enzimatico portato ad una significativa perdita di espressione dell&#39;antigene. Questo problema può essere aggirato utilizzando marcatori cellulari alternative. </li><li> Nota: Live / morti colorazione vitalità cellulare può essere eseguita dopo il punto 4 se lo si desidera. Utilizzano in genere Live / Dead kit fissabile cellule morte Stain (Invitrogen, Molecular Probes). Per colorare le cellule con colorante Live / Dead, creare una soluzione 1x Live / Dead con l&#39;aggiunta di 1ml di ri-sciolto dal vivo / morto tintura in 1 ml di PBS e agitare per mescolare. Aggiungere 100-200 ml di colorante 1x Live / Dead to live / morti singolo, cocktail, FMO e campioni di controllo isotipico. Incubare i campioni con il colorante a temperatura ambiente per 10 minuti al buio. Il tubo di controllo unico per Live / Dead dovrebbe essere incubato a 56 ° C al buio per 10 minuti per uccidere le cellule da shock termico. Lavare le cellule con 1 ml di PBS e agglomerare le cellule per centrifugazione. Riprendi il protocollo al punto 5. </li><li> Nota: colorazione intracellulare per gli antigeni intracellulari e citochine è compatibile con questo protocollo. In breve, la colorazione intracellulare può essere effettuata utilizzando la fissazione delle cellule / reagenti permeabilizzazione da BD Pharmingen, eBioscience, o laboratori Caltag - a seconda degli antigeni di interesse. Per fissare e permeabilize le cellule per la colorazione intracellulare, eseguire la fissazione / permeabilizzazione passo, seguendo le istruzioni del produttore, dopo la fase di colorazione extracellulare (sezione 3 punto 5). Dopo la fase di lavaggio intracellulare, riprendere il nostro protocollo al passo 6 (sezione 3 punto 6). </li></ul></li></ol> 4. Analisi di citometria a flusso isolati circostanti avventizia e della parete dei vasi Come leucociti possono migrare verso l&#39;avventizia aortica e placche aterosclerotiche all&#39;interno della parete aortica, per esaminare leucociti avventiziale e aortica mediante citometria a flusso un protocollo per l&#39;isolamento e l&#39;esecuzione di citometria a flusso su questi due siti anatomici è stato sviluppato 9. In breve, prima della aorte tutto vengono digeriti con ADES (sezione 2, punto 2) l&#39;avventizia aortica è parzialmente digerito e rimossa dal resto della nave. Una volta che l&#39;avventizia è stato rimosso e messo da parte, il resto della aorta viene digerito con ADES per liberare leucociti dalla parete del vaso. <ul><li> Aortica avventizia isolamento protocollo </li></ul><ol><li> Dopo la compilazione della 1X ADES (sezione 2 punto 1), preparare 2,5 ml / aorta di soluzione 1X aortica digestione enzimatica avventizia (AADES) (781,25 U Collagenasi II e 14,0625 U elastasi in 2.5mls PBS (Worthington biochimici Corp., Lakewood, NJ )). 9 Posizionare soluzione di riserva sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Rimuovere la PBS dal tubo di raccolta che contiene l&#39;aorta. Aggiungere 2,5 ml di 1X AADES ad ogni aorta. Non tagliare il aorte in piccoli pezzi. Incubare la aorte con la soluzione 1X enzima avventizia per 10-20 minuti a 37 ° C. </li><li> Dopo la digestione 10-20 minuti, trasferire l&#39;aorta parzialmente digerito dal 1X AADES a una piastra di Petri con PBS fresco. Con molta attenzione, usando due paia di pinzette ricurve, sbucciare lo strato avventiziale via from l&#39;aorta come una singola unità. <ul><li> Nota: i tempi di digestione più lunghi rendono più facile rimuovere l&#39;avventizia, tuttavia, se l&#39;avventizia è troppo digerito sarà strappo. </li></ul></li><li> Quando l&#39;avventizia è stato completamente rimosso, trasferire l&#39;avventizia e l&#39;aorta per separare i tubi FACS. Aggiungere 1 ml di PBS al tubo avventizia, e posizionare il tubo in ghiaccio. Aggiungere 2,5 ml di soluzione 1X aorta dissociazione enzimatica al tubo aorta e l&#39;aorta incubare per 40 minuti a 37 ° C. <ul><li> Nota: Per facilitare la digestione enzimatica, l&#39;aorta può essere suddiviso in parti più piccole, a questo punto. </li></ul></li><li> Dopo la digestione 40 minuti, mettere il tubo aorta su ghiaccio e preparare sospensioni singola cellula dall&#39;aorta avventizia e dal taglio della aorte e avventizia a parte e passare attraverso un filtro a 70 micron cella in 5 ml in polipropilene FACS tubi (BD Falcon). Agglomerare le cellule mediante centrifugazione (400xg, 5 minuti, 4 ° C). Tornare alla sezione 2 4 step e riprendere il protocollo. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Qui vi presentiamo una serie di figure che dimostra citometria a flusso colorazione per analizzare la composizione immunitario di aorte complesso, la parete del vaso aortico e l&#39;avventizia aortica circostante. In primo luogo, abbiamo dimostrato una trama rappresentante FACS che mostra una colorazione TER-119 sul sangue intero e isolato sospensione cellulare aortica (Fig. 1). TER-119 cellule positive rossi del sangue il 18% delle cellule nella sospensione cellulare aortica, che indica che solo il 0,014% delle cellule isolate da cellule in sospensione aortica sono derivati ​​dal sangue umano. Si tratta di un esperimento di controllo importante che dimostra chiaramente che le navi digerito, ma che non circola nel sangue periferico è la fonte della maggior parte dei leucociti analizzati nel sospensione cellulare aortica. Inoltre, per convalidare il metodo, abbiamo valutato gli effetti del cocktail aorta dissociazione enzimatica su antigeni di superficie splenocyte (Fig. 2). Il cocktail di enzimi non ha effetti sulla espressione di antigeni diversi, tra cui, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ e molti altri antigeni di superficie 7. CD45 colorazione in collaborazione con Live / Dead colorante vitalità e controlli appropriati isotipo sono utilizzati per rilevare e sub-gate popolazioni di maggiore interesse e di escludere detriti cellulari durante l&#39;analisi. Nella, Fig.3 aortica vivere CD45 + leucociti sono stati gated per determinare la percentuale di IFN + Υ cellule T all&#39;interno del aorte congiunta di due giovani ApoE - / - topi. Per sottolineare la versatilità di questo metodo, utilizzando lo schema di gating presentato in Fig.3, presentiamo in Fig.4 colorazione intracellulare rappresentante per CD68 + CD11b + macrofagi e IFNγ + + TCRαβ celle da due ApoE - / - topi alimentati con dieta occidentale per 12 settimane. Come previsto, nella parte occidentale della dieta alimentato ApoE - / - aorte, la maggior parte dei leucociti all&#39;interno dell&#39;aorta sono macrofagi (40% CD68 + CD11b +) o altre cellule mieloidi (CD11b + basso CD68 e CD11b + CD68-). Inoltre, le cellule Th1 costituiscono una parte importante del aortica infiltrati TCRαβ cellule T (Fig. 4). Come la percentuale complessiva dei leucociti aortica e sottoinsiemi leucociti varia a seconda dell&#39;età del mouse e la gravità di aterosclerosi, la strategia di gating ottimale per le popolazioni di maggiore interesse devono essere empiricamente determinato Per dimostrare la fattibilità di isolare avventizia aortica per la colorazione citometria a flusso, presentiamo rappresentante colorazione dei leucociti CD45 + per sospensioni cellulari aortica e avventizia (Fig. 5). In breve, tre di età compresa tra ApoE - / - aorte topo fossero digeriti e raggruppate come descritto in precedenza (punti 2 e 4). Infiltrazione dei leucociti CD45 + sono state rilevate in entrambi i avventizia (18% di sospensione cellulare) e l&#39;aorta restante (11% della sospensione cellulare). <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. TER-119 colorazione in sospensione aortica digerito cellulare. Aorta è stato perfuso mediante puntura cardiaca con PBS contenente 2% di eparina. Poi l&#39;aorta è stato digerito con il cocktail di enzimi per 1 ora a 37 ° C. Aortica sospensione cellule e campione di sangue (come controllo positivo) sono state colorate con anticorpi anti-TER-119-PE Abs e analizzati mediante citometria di flusso. TER-119-positivo conto globuli rossi per il 18% di tutte le cellule in sospensione cellulare aortica indicano che solo il 0,014% di tutti i leucociti isolati da aorte possono essere derivati ​​dal sangue leucociti. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Enzyme-cocktail di trattamento non ha effetti sul CD45 (in alto) o CD19 (in basso) espressione sui linfociti. </strong&gt; sospensioni cellulari da non trattati (A, B) e trattati con l&#39;enzima-cocktail (C, D) LN sono stati ottenuti, e colorati con APC-Cy7-coniugato anti-CD45 e APC-coniugato anticorpi monoclonali anti-CD19. (A, C) I numeri rappresentano le percentuali dei leucociti CD45 + nel cancello R1. (B, D) I numeri rappresentano le percentuali di CD45 + / CD19 + linfociti. I profili sono gate sui leucociti CD45 +. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3 strategia di gating per l&#39;analisi dei leucociti due aorte aortica sono stati isolati e messi a disposizione dai soggetti aterosclerotiche ApoE -.. / - Topi e sospensioni cellulari aortica sono state preparate come descritto sopra. Le sospensioni cellulari sono state colorate per CD45 (PerCP), TCRαβ (CIC), IFNγ (eFluor 450), e Live / Dead Aqua, e analizzati utilizzando un Cytek DXP 8 Colore aggiornato BD FACS Calibur. In breve, leucociti CD45 + sono stati gated (B) e ulteriormente analizzati (CF). Le cellule morte sono stati rimossi dalla analisi basata su Live / Dead colorazione Aqua (D) e le trame FSC (E). Vivere leucociti aortica sono stati poi esaminati per TCRαβ e IFNγ espressione (F). <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="Figura 4"/> .. Sospensioni cellulari Figura 4 colorazione intracellulare per gli antigeni intracellulari e citochine sono state preparate da un intero ApoE - / - dell&#39;aorta e della milza come descritto. Aortica (A) e sospensioni delle cellule della milza (B, C) sono state colorate per CD45, CD11b e CD68 o un controllo isotipico utilizzando BD Cytofix / Cytoperm ™ Kit (BD Biosciences). Le cellule sono state gate sui leucociti CD45 + e detriti è stata esclusa in base ai profili scatter in avanti e laterale. Per la colorazione IFNγ intracellulare, sospensioni cellulari aortica e della milza sono stati coltivati ​​per cinque ore in RPMI 1640 integrato con Golgi stop, PMA, e ionomicina C, come descritto in precedenza. 9 stimolata aortica singolo (D) e milza (E, F) Le sospensioni cellulari sono state successivamente colorate con CD45 (PerCP), TCRαβ (CIC), CD3 (APC-Cy7), Live Aqua Morto, e IFNγ (eFluor 450; E) o un isotipo (IgG1-eF450, F). Cellule T (DF) sono stati gated da vivere CD3 + CD45 + leucociti (CD45 + Live / Dead Aqua-) ed esaminati per TCRαβ e IFNγ. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="Figura 5"/> .. Figura 5 immagine rappresentante di aortica avventizia murini isolati e parete vascolare aortica rappresentante citometria a flusso complotto contro dimostra la presenza di cellule T CD45 + nel avventizia e aortica muro di età compresa tra ApoE - / - topi. SSC-side scatter. Per eliminare autofluorescenza da detriti e dei tessuti necrotici, complotti sono stati gated per FSC&gt; 750. Per evitare ulteriori autofluorescenza doppiette i cancelli sono stati istituiti come FSC &lt;3500, SSC &lt;3500. Le percentuali indicano le cellule CD45 + alle porte della città.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui, vi presentiamo un metodo di citometria a flusso basato per lo studio della composizione delle cellule immunitarie di aorte murini. Il principale vantaggio di questo metodo è la capacità di analizzare aortica cellule del sistema immunitario ad un livello singola cellula e di caratterizzare lo stato di attivazione dei leucociti aortica. Questo metodo non si limita a aorte murina e noi (dati non pubblicati) e altri 10 utilizzati questo approccio per analizzare campioni umani come arteria mammaria interna,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale </td><td> Numero di catalogo </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Collagenasi XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNasi I, di tipo 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenasi I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenasi II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Corporation biochimici </td></tr><tr><td> Elastasi </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Corporation biochimici </td></tr></tbody></table>

flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas

L&#39;aterosclerosi è un processo infiammatorio cronico delle imbarcazioni medie e grandi dimensioni che è caratterizzata dalla formazione di placche composto da cellule schiumose, cellule del sistema immunitario, cellule muscolari lisce ed endoteliali, piastrine, matrice extracellulare, e un nucleo ricco di lipidi con necrosi estesa e fibrosi dei tessuti circostanti. 1 Il braccio innata e adattiva della risposta immunitaria sono coinvolti nello sviluppo di iniziazione, e la persistenza di aterosclerosi. 2, 3 Vi è un corpus significativo di prove che diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie, come i macrofagi, dendritiche cellule, linfociti T e B, sono presenti all&#39;interno della aorte di topi sani e aterosclerosi a rischio 4. Inoltre, le cellule immunitarie si trovano nel avventizia aortica circostante che suggerisce un ruolo importante di questo tessuto nell&#39;aterogenesi 2. Da qualche tempo, la rilevazione quantitativa di diversi tipi di cellule immunitarie, il loro stato di attivazione, e la composizione cellulare all&#39;interno della parete aortica è stato limitato mediante RT-PCR e metodi immunoistochimici per lo studio dell&#39;aterosclerosi. Pochi tentativi sono stati fatti per eseguire citometria a flusso utilizzando aorte umane, e una serie di problemi, come un autofluorescenza alto, sono stati riportati 5,6. Placche aterosclerotiche umane sono stati digeriti con collagenasi 1, e celle libere sono stati raccolti e colorate per CD14 + / CD11c + per evidenziare macrofagi derivati ​​da cellule schiumose. In questo studio, un canale &quot;finto&quot; è stato usato per evitare falsi positivi colorazione. 6 materiali necrotiche accumulano durante il processo di digestione dar luogo a una grande quantità di detriti che genera una autofluorescenza alta nei campioni aortica. Per risolvere questo problema, un gruppo di controlli negativi e positivi è stato proposto, ma solo doppia colorazione potrebbe essere applicata in questi campioni. Abbiamo sviluppato un nuovo flusso di citometria metodo basato su 7 per analizzare la composizione delle cellule immunitarie e caratterizzare l&#39;attivazione, la proliferazione, la differenziazione delle cellule del sistema immunitario in buona salute e aterosclerosi dell&#39;aorta a rischio. Questo metodo permette l&#39;indagine della composizione cellule immunitarie della parete aortica e apre possibilità di utilizzare un ampio spettro di metodi immunologici per le indagini degli aspetti immunitario di questa malattia.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Questo articolo presenta un metodo basato citometria di flusso per studiare la composizione immunitario dei aorte. Il documento illustra anche una tecnica aggiuntiva che consente di esaminare avventizia circostante e parete del vaso a parte. Questo metodo apre la possibilità di eseguire analisi fenotipica dei leucociti aortica e applicare diversi saggi immunologici per gli studi di aterosclerosi.

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.4K Views.  Eastern Virginia Medical School. Questo articolo presenta un metodo basato citometria di flusso per studiare la composizione immunitario dei aorte. Il documento illustra anche una tecnica aggiuntiva che consente di esaminare avventizia circostante e parete del vaso a parte. Questo metodo apre la possibilità di eseguire analisi fenotipica dei leucociti aortica e applicare diversi saggi immunologici per gli studi di aterosclerosi.

Video: Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

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Immunologia e infezioni

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

Analisi della restrizione di SAMHD1 mediante citometria a flusso in cellule mieloidi umane U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...